山定子種子凍干處理與層積處理解除休眠的比較試驗*

楊 鋒，郭洪濤，閆忠業(yè)，黃金鳳，劉 志

（1 遼寧省果樹科學(xué)研究所，營口115009）（2 熊岳金和苗木經(jīng)銷處）

蘋果（Malus pumilaMill.）屬薔薇科蘋果屬，原產(chǎn)于歐洲中部、東南部、中亞及我國新疆[1]，在全世界栽培面積較廣，產(chǎn)量較多。2020 年，我國蘋果栽培面積208.852 萬hm2，產(chǎn)量4 406.6 萬t，分別占世界蘋果總面積的44.3%、總產(chǎn)量的50.5%[2]，年產(chǎn)值2 100 億元，是我國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟的重要組成部分。蘋果是多年生木本植物，其良種繁殖依賴于嫁接、扦插等無性技術(shù)以保持種性的純度[3]。山定子（Malus baccata（L.）Borkh.）為蘋果屬落葉喬木，原產(chǎn)于亞洲東北部，在我國的新疆、河北和東北山區(qū)以及川西高原等地均有分布，抗寒性極強，容易繁殖，是蘋果苗木常用的基砧[4]。但山定子種子需要經(jīng)過一定的低溫處理才能解除休眠，生產(chǎn)上通常使用層積解除種子的休眠，以提高出苗率和整齊度[5]。山定子種子層積受植物激素、化學(xué)物質(zhì)、環(huán)境條件、逆境脅迫、貯藏年限等多種因素的影響[6-7]，傳統(tǒng)層積法是采用沙藏數(shù)周，其間溫、濕度不易控制，容易干燥、發(fā)熱、霉爛或招致鼠害等，影響發(fā)芽；且一旦解除休眠，種子在層積坑中很快發(fā)芽，必須及時播種，否則會降低發(fā)芽率，不易控制播種時間，給春耕帶來諸多不便[8]。為克服上述不足、降低育苗成本，我們研究了山定子種子凍干處理技術(shù)，于2014 年獲發(fā)明專利“山定子層積方法”（ZL 2012 1 0078198.6）。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

山定子果實采自遼寧省果樹科學(xué)研究所蘋果砧木育種試驗區(qū)，11 月中旬采摘充分成熟、無病蟲害的山定子果實，放于缸中15 d，果肉后熟腐爛，用清水反復(fù)漂洗，清除果肉，種子攤開，自然晾干，去除果柄、雜質(zhì)及干癟種子后，在室內(nèi)通風(fēng)處貯藏待用。

1.2 試驗處理

試驗設(shè)3 個處理：山定子種子凍干處理，山定子種子層積處理，以在室內(nèi)通風(fēng)處放置的未處理山定子種子作為對照。

（1）凍干處理。12 月中下旬，將山定子種子在40～50 ℃的溫水中浸泡12 h，撈出后裝入網(wǎng)袋中，在室外背陰處-15～-5 ℃下冷凍處理15 d，自然凍干，然后在報紙上攤開，自然晾干后在紙袋或編織袋中保存，0～15 ℃條件下貯存待用。

（2）層積處理。11 月上旬土壤封凍前，選擇背陰處，挖寬0.8 m、深0.6 m 的層積坑。12 月上中旬，將山定子種子與含水量60%的細河沙按1∶5混合均勻，放入網(wǎng)袋或編織袋中，放入層積坑中，用沙土填埋，在中央位置插入玉米秸稈或草把通氣；于培土處澆入15 kg 清水，培土堆高于地表30 cm，層積天數(shù)50～60 d[9]。

1.3 試驗測定項目與方法

（1）種子α-淀粉酶活性。采用二硝基水楊酸法測定α-淀粉酶活性。將處理的山定子種子放入pH值為5.5 的醋酸鈉與氯化鈣緩沖液中，在冰浴條件下研磨成勻漿，4 000 r/min 離心10 min，取上清液定容至25 mL，制備酶的提取液，然后在70 ℃恒溫水浴15 min 鈍化β淀粉酶；取1 mL 酶液加入1%淀粉溶液2 mL，在40 ℃水浴5 min 后，用4 mL 0.4 mol/L 的NaOH 終止反應(yīng)；取反應(yīng)液2 mL 加入2 mL二硝基水楊酸水浴5 min，定容至25 mL，用分光光度計在520 nm 下測定比色值，將比色值代入麥芽糖標準曲線，求得每克種子的α-淀粉酶活力單位數(shù)[10]，酶活性單位為U/g，一個活力單位指在25 ℃最適pH 值與底物充足條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmol 底物所需要的酶量[11]。

（2）種子激素含量。委托中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院采用酶聯(lián)免疫吸附法測定生長素（IAA）、赤霉素（GA）、細胞分裂素（CTK）。稱取處理的山定子種子1.0 g，加2 mL 樣品提取液，在冰浴下研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入10 mL 試管，4 ℃下浸提4 h，1 000 r/min離心15 min，取上清液、過C18 固相萃取柱，再轉(zhuǎn)入5 mL 塑料離心管中，真空濃縮干燥或用氮氣吹干，用稀釋液溶解定容至1.5 mL。在10 mL 包被緩沖液中加入一定量的包被抗原（最適稀釋倍數(shù)見試劑盒標簽）混勻，在酶標板每小孔中加100 μL；然后將酶標板放入內(nèi)鋪濕紗布的帶蓋瓷盤內(nèi)，置于37 ℃下3 h。再經(jīng)洗板、加標樣和抗體、顯色、比色等測定出激素含量[12]，單位為ng/g。

（3）種子發(fā)芽率與播種出苗率。取處理種子1 000 粒，放于托盤中用濕毛巾覆蓋，于20 ℃條件下催芽，其間每12 h 噴水1 次，保持種子濕潤。2月中旬溫室播種，4 月初露地播種。播種2 周后統(tǒng)計出苗率。

出苗率（%）＝（出苗數(shù)/種子數(shù)）×100[13]

2 結(jié)果與分析

2.1 α-淀粉酶活性分析

種子經(jīng)過層積處理或其他途徑打破休眠后，其內(nèi)部的酶由束縛型逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x型以用于代謝活動。α-淀粉酶的活性在種子萌芽前后含量水平變化較大，常用于作為種子萌芽活力的評價指標[14]。從圖1 可以看出，凍干處理種子α-淀粉酶活性與層積種子的差異不顯著，而兩者均極顯著高于未處理的種子。

圖1 不同方法處理的山定子種子的α-淀粉酶活性

2.2 激素含量分析

種子萌芽前激素大量合成，原有固定在胚乳中的束縛型轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢苿拥挠坞x型，并運輸?shù)缴L旺盛的胚根和胚芽部分促進生長與發(fā)育，在促進種子萌芽的激素中，以IAA、GA、CTK 等內(nèi)源激素最為活躍[15]。從圖2 可以看出，凍干處理種子中IAA、GA、CTK 含量與層積處理種子的差異均不顯著，但均極顯著高于未處理種子。

圖2 不同方法處理的山定子種子激素含量

2.3 種子發(fā)芽率與播種出苗率

種子經(jīng)層積處理之后，在溫度、濕度、空氣等環(huán)境適宜的條件下，即可以萌發(fā)[16]。生產(chǎn)上在播種前會對種子進行催芽處理，以提高發(fā)芽率和出苗的整齊度。從圖3 可以看出，凍干處理的種子發(fā)芽率為91.9%，層積處理的為93.8%，兩者差異不顯著，而未處理的種子發(fā)芽率僅為24.6%。

圖3 不同方法處理的山定子種子發(fā)芽率

在溫室播種，凍干處理的種子出苗率為87.9%，層積處理的種子出苗率為90.8%；兩者田間播種出苗率分別為78.3%、82.7%，兩種播種方法2 個處理出苗率差異均不顯著。而未處理的種子兩種播種方法出苗率分別為19.2%、15.9%（圖4）。

圖4 不同方法處理的山定子種子溫室和田間播種出苗率

3 討論與結(jié)論

優(yōu)質(zhì)的苗木是保證果園整齊、果品優(yōu)質(zhì)、豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的前提[17]，沙藏作為常規(guī)的層積方法，具有出芽率高、穩(wěn)定性好的優(yōu)點，在本試驗中山定子種子平均出苗率達到86.8%；凍干處理平均出苗率也達到83.1%，略低于層積的。與層積相比，凍干處理山定子種子在α-淀粉酶活性和IAA、GA、CTK 等激素含量上略小于層積的，其中α-淀粉酶是水解淀粉轉(zhuǎn)化為糊精、麥芽糖、葡萄糖的關(guān)鍵酶，為種子萌芽提供小分子碳水化合物以供胚芽軸的生長[18]，IAA、GA、CTK 等在種子解除休眠后顯著增加，在種子萌發(fā)過程中起著原初反應(yīng)的信號作用[19-20]。本試驗嘗試的凍干處理在溫度、時間等方面尚未開展梯度化的精細設(shè)計，其能否在酶活性、激素含量、發(fā)芽率和出苗率等各項指標上達到或超過沙藏層積，還需要進一步補充完善及篩選優(yōu)化出最佳的技術(shù)方案和參數(shù)等。

層積是將種子埋于戶外地下的環(huán)境，其溫度、濕度、時間、時機等并不容易掌控，處理不當容易解除休眠不徹底而發(fā)芽率低，或過早打破休眠而于層積坑中發(fā)霉、發(fā)芽等現(xiàn)象[21]；比較而言，凍干處理更易于掌控溫度、濕度、時間等各個環(huán)節(jié)，作業(yè)高效簡易可隨時監(jiān)控，符合當前及未來果業(yè)輕簡省工的發(fā)展趨勢[22]。

本文以抗性強、耐瘠薄、應(yīng)用廣的山定子為材料開展了凍干處理的簡易層積試驗，即種子在40～50 ℃的溫水中浸泡12 h，于室外背陰處在-15～-5 ℃低溫下冷凍處理15 d；種子內(nèi)α-淀粉酶活性和IAA、GA、CTK 等激素含量均達到了常規(guī)層積的水平；發(fā)芽率、田間與溫室播種出苗率分別達到了91.9%、87.9%和78.3%，與常規(guī)層積均無顯著差異，能夠滿足生產(chǎn)需求。但我國蘋果產(chǎn)區(qū)幅員遼闊，生產(chǎn)上還有很多砧木種子應(yīng)用，如八棱海棠（Malus robusta）、楸子（Malus prunifolia）和新疆野蘋果（Malus sieversii）等喬化砧木，還有無融合矮化或半矮化砧木中砧一號、青砧一號和遼砧106[23-25]等，這些砧木采用凍干處理打破休眠的可行性還需試驗驗證。