火龍果采后病原菌的分離鑒定及丁香酚抑菌研究*

羅冬蘭，雷霽卿，曹 森，瞿光凡，朱 婷，陳建業(yè)，范中奇，巴良杰

（1 貴陽(yáng)學(xué)院，貴州550005）（2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)）（3 福建農(nóng)林大學(xué)）

火龍果原產(chǎn)于墨西哥、中美洲等熱帶地區(qū)，以肉色不同將其分為紅肉、白肉、黃肉火龍果[1]。其中，紅肉火龍果因其富含較高的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、獨(dú)特的風(fēng)味深受消費(fèi)者喜愛(ài)[2]。然而，火龍果成熟期為高溫多雨季節(jié)，采后田間熱、較高的呼吸強(qiáng)度極易受病原菌的侵染，從而引起果實(shí)快速腐爛變質(zhì)，貨架期短[3-4]。據(jù)報(bào)道，火龍果采后主要病害有炭疽病、黑斑病、果腐病、潰瘍病、軟腐病[5]。病原菌的侵染是導(dǎo)致采后火龍果品質(zhì)劣變的主要因素。因此，控制果實(shí)采后病害發(fā)生對(duì)提高果實(shí)商品價(jià)值和產(chǎn)業(yè)發(fā)展尤其重要。

丁香酚作為一種天然的植物精油，其揮發(fā)性成分主要有菇烯、菇類化合物和酚類物質(zhì)，具有抑菌活性和誘導(dǎo)增強(qiáng)果蔬抗氧化等作用[6]。周丹丹等[7]研究發(fā)現(xiàn)，1 μL/L 丁香酚處理能有效抑制枇杷采后炭疽病的發(fā)生，在貯藏6 d 時(shí)，其對(duì)尖孢炭疽菌的抑制率為66.7%。葛達(dá)娥等[8]研究結(jié)果表明，丁香酚通過(guò)破壞鏈格孢菌的細(xì)胞膜通透性，抑制菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)，從而有效抑制藍(lán)莓采后黑斑病的發(fā)生。此外，米嘉琦等[9]研究發(fā)現(xiàn)，丁香酚處理不僅抑制芒果采后炭疽病的發(fā)生，還有效降低了芒果的腐爛率。然而，關(guān)于丁香酚對(duì)火龍果采后病原菌的抑制研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究對(duì)自然發(fā)病的火龍果進(jìn)行病原菌的分離鑒定，并篩選適宜濃度的丁香酚對(duì)病原菌進(jìn)行抑制研究，以期為火龍果采后病害的防控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

火龍果鮮果于2021 年9 月11 日從貴州省羅甸縣火龍果種植基地采摘，選取健康、無(wú)病蟲害果實(shí)用PE20 袋進(jìn)行單個(gè)包裝，并置于溫度20 ℃、空氣相對(duì)濕度85%條件下貯藏，定期觀察果實(shí)發(fā)病情況。病原菌的分離培養(yǎng)基為PDA 培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，瓊脂20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL）。

火龍果采后病原菌的形態(tài)特征及致病性測(cè)定結(jié)果Morphological characteristics of postharvest pathogens of pitaya fruit and its pathogenicity test results

1.2 火龍果采后優(yōu)勢(shì)菌分離

采用組織分離法對(duì)病原菌進(jìn)行分離[10]。將自然發(fā)病的果實(shí)置于75%酒精消毒30 s，無(wú)菌水沖洗3次，再用無(wú)菌吸水紙將果皮水分擦干，采用無(wú)菌手術(shù)刀切取果實(shí)病健交界處組織，放于PDA 培養(yǎng)基上，經(jīng)過(guò)多次劃線分離、單孢培養(yǎng)直至獲得純化菌株，并將純化菌株于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病原菌傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)觀察

將分離的病原菌接種在新的PDA 平板上培養(yǎng)15 d，觀察記錄分離菌株的菌落生長(zhǎng)情況，利用光學(xué)顯微鏡觀察記錄菌絲和孢子的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，并參照《真菌鑒定手冊(cè)》[11]對(duì)病原菌進(jìn)行初步鑒定。

1.4 病原菌致病性檢測(cè)

將火龍果果實(shí)用無(wú)菌水清洗后，在75%酒精中浸泡30 s，再用無(wú)菌水清洗3 次，用無(wú)菌打孔器在果實(shí)赤道處刺直徑4 mm、深3 mm 的傷口，在傷口處分別接種培養(yǎng)5 d 病原菌菌餅，以無(wú)菌菌餅作為對(duì)照，每株病原菌3 個(gè)果。置于溫度25 ℃、空氣相對(duì)濕度80%～90%條件下恒溫培養(yǎng)4 d 后觀察記錄果實(shí)發(fā)病情況，根據(jù)柯赫氏法則對(duì)病原菌進(jìn)行致病性檢測(cè)[12-13]。

1.5 病原菌rDNA-ITS 序列分析

1.5.1 病原菌DNA 提取

取一定量純化后培養(yǎng)5 d 的病原菌菌絲，參照真菌基因組DNA 快速抽提試劑盒（生工生物工程）提取病原菌DNA。

1.5.2 病原菌ITS 區(qū)PCR 擴(kuò)增及凝膠電泳

選用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAA CCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGAT ATGC-3′）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系：TaqMast erMix 110 μL、ITS1 和ITS4 1 μL、模板DNA 1 μL、ddH2O2補(bǔ)加至20 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min[14]。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，寄送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI 網(wǎng)站的GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST 同源性比對(duì)分析。

1.6 丁香酚對(duì)火龍果病原菌體外抑菌效果

采用菌絲生長(zhǎng)速率法[15]測(cè)定丁香酚對(duì)火龍果采后病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響。稱取一定質(zhì)量丁香酚液配制成10 mg/mL 母液，分別吸取一定量的母液加入到10 mL PDA 培養(yǎng)基中，使得丁香酚質(zhì)量濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL，充分搖勻后倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，備用。用無(wú)菌打孔器從純化后培養(yǎng)5～7 d 的病原菌菌落邊緣打取直徑4 mm 菌餅放于PDA 培養(yǎng)基中央，以不加丁香酚培養(yǎng)基作為對(duì)照（CK），每個(gè)處理3 次重復(fù)。28 ℃培養(yǎng)7 d 或?qū)φ战M長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)基后測(cè)量菌落直徑，并參照王丹等[16]方法計(jì)算抑菌率。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用SPSS Statistics 23 軟件的Duncan’s 法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，采用Origin 2018 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 火龍果自然發(fā)病癥狀

貯藏3 d 后，果實(shí)鱗片開始萎蔫；貯藏5 d 后，局部鱗片和果柄處長(zhǎng)出少量菌絲；貯藏8 d 后，果柄處長(zhǎng)出大量白色、灰色和灰白色菌絲，肉眼可見(jiàn)，并覆蓋整個(gè)果柄面，菌絲逐漸向果身擴(kuò)展；同時(shí)，果柄周圍果皮褐腐潰爛，果皮出現(xiàn)許多小黑點(diǎn)（圖版1-a），失去食用價(jià)值。

2.2 病原菌的形態(tài)特征

將自然發(fā)病的火龍果果實(shí)采用組織塊分離法分離得到4 株病原菌，記作H-1、H-2、H-3 和H-4。菌株H-1 在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)（圖版1-b-A1～A3），菌絲生長(zhǎng)較快，初期為灰白色棉絮狀，后期變?yōu)榛液谏虬祷疑?，菌落基質(zhì)初期為暗黃色，后期變?yōu)樽睾稚?；在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，菌落培養(yǎng)7 d后產(chǎn)生成熟的分生孢子，孢子呈橢圓形、卵圓形或短棒形，孢子兩端鈍圓，無(wú)色，無(wú)膈膜，串珠狀排列。根據(jù)其形態(tài)特征并參照真菌分類手冊(cè)，初步鑒定為新暗色柱節(jié)孢菌（Neoscytalidium dimidiatum）。

菌株H-2在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)（圖版1-b-B1～B3），菌絲初期為白色，后逐漸變?yōu)榈厣笃诔始t棕色，并分泌紅褐色色素；菌落基質(zhì)呈現(xiàn)明顯同心輪紋，外層暗黃色，內(nèi)層紅棕色；菌落培養(yǎng)7～15 d 產(chǎn)生分生孢子，分生孢子呈球形、近球形，無(wú)膈膜。根據(jù)其形態(tài)特征并參照真菌分類手冊(cè)，初步鑒定為黑附球菌（Epicoccum nigrum）。

菌株H-3 在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)（圖版1-b-C1～C3），初期為白色絨毛狀，后期變?yōu)闇\黃色；菌落基質(zhì)初期為米黃色，后期呈黃棕色；培養(yǎng)5 d 后產(chǎn)生分生孢子，分生孢子彎曲顯著或微彎，呈鐮刀形，有膈膜，橫膈膜1～3 個(gè)，無(wú)色。根據(jù)其形態(tài)特征并參照真菌分類手冊(cè)，初步鑒定為鐮刀菌屬（Fusariumsp.）。

菌株H-4 在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)（圖版1-b-D1～D3），菌落初期為白色絨毛狀，菌絲呈網(wǎng)狀形展開生長(zhǎng)，后期變?yōu)榘迭S色；菌落基質(zhì)初期為米黃色，后期呈暗黃棕色或暗灰色；在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，菌絲粗壯，內(nèi)有油球，菌落培養(yǎng)7 d 后，產(chǎn)生分生孢子，孢子呈球形、近球形，無(wú)膈膜。根據(jù)其形態(tài)特征并參照真菌分類手冊(cè)，初步鑒定為球黑孢菌（Nigrospora sphaerica）。

2.3 病原菌的致病性測(cè)定結(jié)果

選取無(wú)病蟲害、無(wú)機(jī)械損傷的果實(shí)，將果實(shí)置于75%酒精中浸泡30 s，無(wú)菌水沖洗2～3 次后放于超凈工作臺(tái)中自然晾干，備用。采用刺傷接種法將菌株H-1、H-2、H-3 和H-4 分別接種至火龍果果實(shí)上，對(duì)照組接無(wú)菌菌餅，并將果實(shí)置于溫度25 ℃、空氣相對(duì)濕度85%條件下貯藏4 d。刺傷接種菌株H-1（圖版1-c-A）果實(shí)，刺傷部位長(zhǎng)出灰白色菌絲，果實(shí)開始褐腐潰爛。刺傷接種菌株H-2（圖版1-c-B）、H-3（圖版1-c-C）、H-4（圖版1-c-D）引起火龍果致病，其刺傷部位長(zhǎng)出大量菌絲，肉眼可見(jiàn)，對(duì)照組均無(wú)發(fā)病。取接種發(fā)病果實(shí)組織再次進(jìn)行分離，分離得到的菌株與原菌株培養(yǎng)性狀一致。

2.4 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

將火龍果病原菌PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得到4 株病原菌序列長(zhǎng)度均為500～700 bp；并將其產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交NCBI 網(wǎng)站的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST 同源性比對(duì)分析，并下載同源較高的序列，采用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。由系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果得知，菌株H-1 與Neoscytalidium dimidiatum具有較高的同源性，其相似度高達(dá)100%，結(jié)合其形態(tài)特征鑒定為新暗色柱節(jié)孢菌；菌株H-2 與Epicoccum nigrum處于同一分支，相似度達(dá)91%，結(jié)合其形態(tài)特征鑒定為黑附球菌；菌株H-3 與Fusarium oxysporum有較高同源性，相似度達(dá)99%，結(jié)合其形態(tài)特征鑒定為尖孢鐮刀菌；菌株H-4 與Nigrospora sphaerica有較高的同源性，相似度達(dá)100%，結(jié)合其形態(tài)特征鑒定為球黑孢菌。

圖1 火龍果4 株病原菌的rDNA-ITS 序列PCR 電泳圖及系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 丁香酚對(duì)火龍果病原菌菌絲抑制及室內(nèi)毒力測(cè)定

2.5.1 丁香酚對(duì)病原菌菌絲抑制效果

不同質(zhì)量濃度丁香酚對(duì)火龍果采后病原菌菌絲生長(zhǎng)抑制效果見(jiàn)表1。由表1 可知，隨著丁香酚質(zhì)量濃度的增加，其對(duì)4 株病原菌的抑制率呈遞增趨勢(shì)，且不同濃度間抑制效果差異顯著。當(dāng)丁香酚濃度為0.20 mg/mL 時(shí)，對(duì)4 株病原菌的抑制率大于70%，其中，完全抑制F.oxysporum生長(zhǎng)。當(dāng)丁香酚濃度為0.25 mg/mL 時(shí)，對(duì)N.dimidiatum、E.nigrum、F.oxysporum和N.sphaerica的抑菌率分別為87.66%、97.49%、100.00%和95.07%。由此可見(jiàn)，丁香酚對(duì)火龍果采后病害的防治具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

表1 丁香酚對(duì)火龍果采后病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果

2.5.2 丁香酚對(duì)病原菌菌絲室內(nèi)毒力測(cè)試

通過(guò)菌絲生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)，求出丁香酚對(duì)4 株病原菌菌絲毒力回歸方程及EC50，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，F(xiàn).oxysporum對(duì)丁香酚的敏感性最高，EC50為0.114 7 mg/mL，其他依次為E.nigrum、N.sphaerica、N.dimidiatum，EC50分別為0.128 3、0.156 0、0.174 8 mg/L。

表2 丁香酚對(duì)火龍果采后病原菌菌絲生長(zhǎng)的毒力回歸方程

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)，火龍果采后病害的發(fā)生造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)前人研究報(bào)道，崔志婧等[17]研究發(fā)現(xiàn)，上海市進(jìn)口火龍果軟腐病主要由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和單隔鐮刀菌（Fusarium dimerum）引起；郭力維等[18]認(rèn)為，引起云南火龍果果腐病的病原菌為霜霉目白秀科桃吉爾霉（Gilbertella persicaria）；Guo 等[19]首次發(fā)現(xiàn)平頭炭疽菌（Colletotrichum truncatum）可引起火龍果炭疽病發(fā)生；王會(huì)會(huì)等[20]發(fā)現(xiàn)引起火龍果潰瘍病的致病菌為新暗色柱節(jié)孢菌。此外，胡翠平等[21]還發(fā)現(xiàn)，引起廣西白心火龍果采后腐爛的致病菌為新月彎孢菌（Curvularia lunata）。綜上研究報(bào)道可知，引起火龍果腐爛的病原菌種類較多，且致病力可能與火龍果品種、病原菌種類及區(qū)域條件有關(guān)。本研究從自然發(fā)病的火龍果果實(shí)分離病原菌，并經(jīng)過(guò)致病性測(cè)定、形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定，確定引起貴州省羅甸縣火龍果采后腐爛的病原菌主要是新暗色柱節(jié)孢菌（Neoscytalidium dimidiatum）、黑附球菌（Epicoccum nigrum）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和球黑孢菌（Nigrospora sphaerica）。

丁香酚不僅具有廣譜殺菌性，而且在果蔬采后保鮮上具有潛在的應(yīng)用價(jià)值；能夠有效提高枇杷[7]、草莓[22]的貯藏品質(zhì)，降低青茄[23]冷害發(fā)生，抑制蘋果[6]采后病原菌生長(zhǎng)。本研究發(fā)現(xiàn)，丁香酚對(duì)火龍果采后病原菌具有較好的控制效果。其中，當(dāng)丁香酚濃度為0.20 mg/mL 時(shí)，其對(duì)4 株病原菌的抑制率均大于70%。通過(guò)毒力測(cè)試發(fā)現(xiàn)，丁香酚對(duì)F.oxysporum抑制效果最顯著，EC50為0.114 7 mg/mL，其次為E.nigrum、N.sphaerica、N.dimidiatum，EC50分別為0.128 3、0.156 0、0.174 8 mg/L。因此，丁香酚可應(yīng)用于火龍果采后病害防控。然而，關(guān)于丁香酚對(duì)火龍果采后病原菌的抑菌機(jī)理及貯藏保鮮效果還需進(jìn)一步的研究。