新疆梨種質(zhì)資源的火疫病抗性評(píng)價(jià)*

陳勵(lì)坤，徐葉挺，王永鵬，何臨梓，曾 斌，艾沙江·買買提

（1 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，烏魯木齊830000）（2 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所）

梨火疫病是由淀粉歐文氏菌（Erwinia amylovora）引起的細(xì)菌性病害，對(duì)薔薇科果樹(shù)具有毀滅性的危害[1]，梨火疫病菌侵入寄主后對(duì)其造成永久性的結(jié)構(gòu)破壞，最終致其死亡。該病傳播能力極強(qiáng)，美國(guó)、荷蘭、德國(guó)等世界多地的林果產(chǎn)業(yè)都曾受其嚴(yán)重危害[2-3]。2016 年梨火疫病入侵我國(guó)新疆地區(qū)[4]，破壞原有生態(tài)，嚴(yán)重阻礙了林果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，抗病種質(zhì)資源篩選培育的問(wèn)題亟待解決。

藥物施用與果樹(shù)修剪可作為緊急方案短期內(nèi)應(yīng)對(duì)梨火疫病的侵害[5-6]，抗病品種篩選培育是當(dāng)前最有效的長(zhǎng)期防治手段。前人對(duì)梨和蘋果抗火疫病品種鑒定已進(jìn)行大量研究，先后從野生資源中鑒定出了Solanka、Prairie Gem、Chancleer 等表現(xiàn)為高抗的梨品種[7-9]，野生資源與馴化品種多代雜交培育出了高抗的CG 系列蘋果砧木[10]。Paprstein 等[11]對(duì)試管幼苗采用剪切接菌法，發(fā)現(xiàn)感病品種幼苗會(huì)產(chǎn)生病斑，滲出白色菌膿。Piotr 等[12]采用葉片浸泡法，成功鑒定出了Malus J-2003-05、Malus Early Szampion 2 個(gè)高抗品種。李洪濤等[13]采用枝條針刺接菌的方法，比較了不同菌株致病力的差異。前人研究表明，花朵、幼苗噴施接菌法同樣可用于抗性鑒定[14]。

新疆梨是我國(guó)5 個(gè)主栽梨系統(tǒng)之一[15]，由西洋梨與東方梨雜交而來(lái)[16]?？够鹨卟』虻倪z傳和積累對(duì)后代的抗性水平有顯著影響[17]。本研究通過(guò)對(duì)31 個(gè)新疆梨品種的嫩葉、嫩枝接種梨火疫病菌，置于適宜環(huán)境中離體培養(yǎng)，對(duì)其感病性觀察記錄，分析品種間的抗性差異，初步探討供試品種對(duì)火疫病的抗性及新疆梨系統(tǒng)整體抗性水平，為后續(xù)抗病梨種質(zhì)資源的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗(yàn)接種所用的梨火疫病菌（E.amylovora）由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)胡白石教授惠贈(zèng)，菌株分離于新疆庫(kù)爾勒沙依東園藝場(chǎng)，寄主為庫(kù)爾勒香梨。供試的31 個(gè)梨品種均屬于新疆梨系統(tǒng)（表1），供試材料來(lái)源于新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院輪臺(tái)果樹(shù)資源圃，選擇樹(shù)體健康、長(zhǎng)勢(shì)良好的梨樹(shù)采集所需嫩葉、嫩枝。

表1 供試新疆梨品種

新疆梨接種火疫病菌的發(fā)病情況Incidence of Pyrus sinkiangensis Yu inoculated with Erwinia amylovora

1.2 試驗(yàn)處理與方法

1.2.1 火疫病菌的培養(yǎng)

采用平板劃線法將病菌接種至NA 培養(yǎng)基，密封之后置于恒溫培養(yǎng)箱中，28 ℃培養(yǎng)24 h 后，挑取單菌落接種于NB 培養(yǎng)基，置于28 ℃恒溫?fù)u床中150 r/min 培擴(kuò)繁24 h，肉眼觀察為純白色，OD600＝0.4 為標(biāo)準(zhǔn)接種菌液。

1.2.2 嫩葉接菌

采集完全展開(kāi)的幼嫩健康葉片，置于保鮮箱中備用；純水清洗葉片后，用紫外線殺菌20 min，將多余葉柄剪去保留0.5 cm 左右，在超凈工作臺(tái)中用微量注射器吸取2 μL 菌液從葉片背面刺入主葉脈；將濕潤(rùn)的無(wú)菌濾紙置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用無(wú)菌牙簽搭三角架，葉片背面朝上置于牙簽三角架上，防止葉片沾水褐化，置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，每個(gè)品種接種3 片葉，每隔24 h 觀察1 次葉片發(fā)病情況，并記錄各時(shí)間段葉片主葉脈的病變長(zhǎng)度，共觀察記錄96 h。

對(duì)供試31 個(gè)梨品種葉片各時(shí)間段主葉脈平均病變長(zhǎng)度進(jìn)行聚類分析，評(píng)價(jià)其抗性。

1.2.3 嫩枝接菌

選取健康的當(dāng)年生嫩枝，采集后枝條下端用濕潤(rùn)紗布包裹備用；純水清洗枝條后，用紫外線殺菌20 min；在完全展開(kāi)的第2 片葉基部的主莖上，用微量注射器斜向下刺孔，將2 μL 菌液滴入嫩梢中；將枝條置于室內(nèi)培養(yǎng)，下端放入水中培養(yǎng)，每個(gè)品種接種3 根枝條，每隔24 h 觀察記錄枝條的病變長(zhǎng)度，共觀察記錄96 h。

根據(jù)李洪濤等[13]制定的火疫病接種離體枝條病情分級(jí)，將枝條病變長(zhǎng)度與枝條總長(zhǎng)之比作為病級(jí)代表值：0 級(jí)，枝條無(wú)病變現(xiàn)象；1 級(jí)，病變長(zhǎng)度占接種枝條長(zhǎng)度的1%～5%；3 級(jí)，病變長(zhǎng)度占接種枝條長(zhǎng)度的6%～15%；5 級(jí)，病變長(zhǎng)度占接種枝條長(zhǎng)度的16%～30%；7 級(jí)，病變長(zhǎng)度占接種枝條長(zhǎng)度的31%～50%；9 級(jí)，病變長(zhǎng)度占接種枝條長(zhǎng)度的50%以上。

病情指數(shù)＝［∑（各級(jí)發(fā)病枝條數(shù)×各級(jí)代表值）/（調(diào)查總枝條數(shù)×最高級(jí)代表值）］×100

根據(jù)相同時(shí)間內(nèi)的病情指數(shù)，將供試品種離體枝條抗病能力分為4 個(gè)等級(jí)，高抗（HR）：病情指數(shù)為1～15；中抗（MR）：病情指數(shù)為16～35；中感（MS）：病情指數(shù)為36～69；高感（HS）：病情指數(shù)≥70。

1.2.4 幼果接菌

采集幼果后保存于10 ℃左右的環(huán)境中，盡量保證果皮蠟質(zhì)層不被破壞；將果實(shí)整體浸入75%酒精溶液中2 min 左右，進(jìn)行表面消毒，用無(wú)菌濾紙吸干表面殘留的酒精后，將果實(shí)縱剖為兩半，在果實(shí)每一個(gè)剖面靠近果核周圍選擇6 個(gè)接菌點(diǎn)，用微量注射器每個(gè)接菌點(diǎn)注入2 μL 菌液。接菌后將果實(shí)放在鋪有濕潤(rùn)無(wú)菌紗布的瓷盤中，并用保鮮膜覆蓋，置于28 ℃左右恒溫箱中培養(yǎng)，每隔24 h 觀察1 次果實(shí)剖面變化，共觀察記錄96 h。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用Excel 2010 整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，用SPSS 26 軟件進(jìn)行差異顯著性分析檢驗(yàn)及聚類分析，數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片病變分析

2.1.1 葉片發(fā)病進(jìn)程

由圖版2-A 可以看出，梨葉片被火疫病菌侵染后，主葉脈發(fā)生病變褐化，病變長(zhǎng)度隨時(shí)間逐漸增加。從表2 可以看出，供試的31 個(gè)梨品種接菌后24、48、72、96 h 主葉脈平均病變長(zhǎng)度分別為0.57、1.24、2.12、2.92 cm，相鄰2 個(gè)時(shí)間點(diǎn)病變長(zhǎng)度差分別為0.57、0.67、0.88、0.80 cm。經(jīng)方差分析，4個(gè)時(shí)間段的主葉脈平均病變長(zhǎng)度差異顯著。從整體可以看出，梨葉片接種梨火疫病菌后48～72 h 主葉脈病變最快。

表2 供試?yán)嫫贩N嫩葉對(duì)火疫病抗性測(cè)定結(jié)果

續(xù)表2

供試?yán)嫫贩N葉片接菌24 h 后，主葉脈平均病變長(zhǎng)度為0.57 cm，其中棉梨最短（0.24 cm），沙03最長(zhǎng)（0.91 cm），二者差異顯著；接菌后48 h，主葉脈平均病變長(zhǎng)度為1.24 cm，其中棉梨最短（0.80 cm），沙02 最長(zhǎng)（2.04 cm），二者差異顯著；接菌后72 h，主葉脈平均病變長(zhǎng)度為2.12 cm，其中綠梨最短（1.33 cm），沙02 最長(zhǎng)（3.57 cm），二者差異顯著；接菌后96 h，主葉脈平均病變長(zhǎng)度為2.92 cm，其中綠梨最短（1.82 cm），庫(kù)爾勒香梨最長(zhǎng)（4.65 cm），二者差異顯著（表2）。

最終結(jié)果表明，葉片接菌96 h 后發(fā)病最輕的是綠梨，發(fā)病最嚴(yán)重的是庫(kù)爾勒香梨。綠梨在接菌后24、48、72、96 h 主葉脈病變長(zhǎng)度分別為0.36、0.86、1.33、1.82 cm，相鄰2 個(gè)時(shí)間點(diǎn)主葉脈病變長(zhǎng)度差分別為0.36、0.50、0.47、0.49 cm，可見(jiàn)接菌后0～24 h 病變最慢，24～48 h 病變最快，各時(shí)間段病變速度平穩(wěn)相近。庫(kù)爾勒香梨在接菌后24、48、72、96 h 主葉脈病變長(zhǎng)度分別為0.71、1.55、3.52、4.65 cm，相鄰2 個(gè)時(shí)間點(diǎn)主葉脈病變長(zhǎng)度差分別為0.71、0.84、1.97、1.13 cm，接菌后0～24 h 病變最慢，48～72 h 病變最快，各時(shí)間點(diǎn)病變?cè)鏊俨町惷黠@。接菌后4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)庫(kù)爾勒香梨主葉脈病變長(zhǎng)度分別是綠梨的1.97、1.80、2.65、2.55 倍（表2）。

2.1.2 葉片抗病等級(jí)分析

對(duì)供試31 個(gè)梨品種各時(shí)間點(diǎn)主葉脈病變長(zhǎng)度進(jìn)行歐氏距離聚平均法連鎖聚類分析，如圖1 所示，當(dāng)連鎖距離為3 時(shí)，被分為4 個(gè)類群。也歷克阿木特、棉梨、霍城冬黃梨等16 個(gè)品種聚為A 類，主葉脈綜合平均病變長(zhǎng)度為1.31 cm，為高抗品種；酸秤砣、庫(kù)爾勒黃酸梨、綠梨等7 個(gè)品種聚為B 類，主葉脈綜合平均病變長(zhǎng)度為1.72 cm，為中抗品種；伊犁紅句句梨、黑酸梨和沙01 聚為D 類，主葉脈綜合平均病變長(zhǎng)度為2.26 cm，為中感品種；庫(kù)爾勒香梨、奎克阿木特、株選1 號(hào)等5 個(gè)品種聚為C 類，主葉脈綜合平均病變長(zhǎng)度為2.68 cm，為高感品種（圖1）。

圖1 供試?yán)嫫贩N葉片發(fā)病情況聚類分析樹(shù)狀圖

2.2 枝條病變分析

2.2.1 嫩枝發(fā)病進(jìn)程

梨嫩枝被火疫病菌侵染后發(fā)生病變，表現(xiàn)為由接菌點(diǎn)逐步向下褐化變黑（圖版2-B）。如表3 所示，供試?yán)嫫贩N接菌后24、48、72、96 h 嫩枝平均病變長(zhǎng)度分別為1.12、2.73、4.88、8.75 cm，相鄰2個(gè)時(shí)間點(diǎn)嫩枝病變長(zhǎng)度差分別為1.12、1.61、2.15、3.87 cm。經(jīng)方差分析，4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間嫩枝平均病變長(zhǎng)度差異顯著。從整體可看出，嫩枝接菌后72～ 96 h 病變最快。

表3 供試?yán)嫫贩N嫩枝對(duì)火疫病抗性測(cè)定結(jié)果

如表3 所示，接種火疫病菌后供試31 個(gè)梨品種的嫩枝在各時(shí)間點(diǎn)的發(fā)病程度差異明顯。接菌后24 h，嫩枝平均病變長(zhǎng)度為1.12 cm，其中綠梨嫩枝無(wú)病變，沙01 最長(zhǎng)（2.39 cm）；接菌后48 h，嫩枝平均病變長(zhǎng)度為2.73 cm，其中綠梨最短（0.40 cm），株選1 號(hào)最長(zhǎng)（5.26 cm），二者差異顯著；接菌后72 h，嫩枝平均病變長(zhǎng)度為4.88 cm，其中綠梨最短（0.63 cm），褐色句句梨最長(zhǎng)（12.23 cm），二者差異顯著；接菌后96 h，嫩枝平均病變長(zhǎng)度為8.75 cm，其中綠梨最短（1.03 cm），褐色句句梨最長(zhǎng)（22.49 cm），二者差異顯著。

由表3 可以看出，嫩枝接菌96 h 后發(fā)病最輕的是綠梨，最嚴(yán)重的是褐色句句梨。綠梨在接菌后24、48、72、96 h 嫩枝病變長(zhǎng)度分別為0、0.40、0.63、1.03 cm，相鄰2 個(gè)時(shí)間點(diǎn)嫩枝病變長(zhǎng)度差分別為0、0.40、0.23、0.40 cm，可見(jiàn)接菌后0～24 h 病變最慢，24～48 h 與72～96 h 2 個(gè)時(shí)間段病變最快，整體病變幅度較小，趨勢(shì)平緩。褐色句句梨在接菌后24、48、72、96 h 病變長(zhǎng)度分別為1.58、4.82、12.23、22.49 cm，相鄰2 個(gè)時(shí)間點(diǎn)嫩枝病變長(zhǎng)度差分別為1.58、3.24、7.41、10.26 cm，可見(jiàn)接菌后0～24 h病變最慢，72～96 h 病變最快，各時(shí)間點(diǎn)嫩枝病變?cè)鲩L(zhǎng)速度有較大差別。接菌后在48、72、96 h 褐色句句梨的嫩枝病變長(zhǎng)度分別是綠梨的12.05、19.41、21.83 倍。

2.2.2 枝條抗病等級(jí)分析

對(duì)接菌后24、48、72、96 h 嫩枝發(fā)病情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各品種的綜合病情指數(shù)及抗性等級(jí)如表4 所示，綜合病情指數(shù)最低的是綠梨，為30.56，最高的是句句梨，達(dá)72.22。棉梨、也歷克阿木特和綠梨3 個(gè)梨品種表現(xiàn)為中抗，句句梨表現(xiàn)為高感，其他27 個(gè)梨品種均表現(xiàn)為中感。

表4 供試?yán)嫫贩N病情指數(shù)和抗性等級(jí)

2.3 果實(shí)病變

梨幼果剖面接菌后，抗病品種幼果剖面始終無(wú)明顯變化，只存在少量白色小菌膿；感病品種接菌后24 h 之內(nèi)，接菌點(diǎn)開(kāi)始滲出白色菌膿，后形成大片菌膿并逐漸變黃發(fā)褐，果實(shí)也隨之出現(xiàn)皺縮甚至開(kāi)裂的現(xiàn)象。如圖版2-C 所示，棉梨、也歷克阿木特和句句梨3 個(gè)梨品種幼果接菌后72 h 的剖面表現(xiàn)，可明顯看出抗病品種棉梨和也歷克阿木特果實(shí)剖面只有極少量白色菌膿；感病品種句句梨果實(shí)剖面被大片菌膿覆蓋，同時(shí)幼果逐漸褐化、皺縮。

3 討論與結(jié)論

抗病資源的鑒定是抗病育種的基礎(chǔ)[18]，室內(nèi)接菌是最為常用的品種抗病水平鑒定手段。前人所用的接菌方法及指標(biāo)也各有不同，花朵噴施菌液、剪切接菌、浸泡接菌、果柄注射接菌等[11,19]，花朵被病菌侵染后其發(fā)病程度難以量化，難適用于多品種抗性水平的鑒定中?？剐詸z測(cè)中菌液的量可能會(huì)影響發(fā)病進(jìn)程，前人研究中少有對(duì)菌液定量的案例，本試驗(yàn)中采用微量注射器定量注射菌液，以“接菌口有菌液珠但不溢出”為準(zhǔn)，經(jīng)多次預(yù)試驗(yàn)確定嫩葉、嫩枝、幼果的接菌量，進(jìn)一步準(zhǔn)確鑒定品種的抗病水平。

本研究結(jié)果表明，棉梨和也歷克阿木特在葉片鑒定中表現(xiàn)為高抗，在枝條鑒定中表現(xiàn)為中抗，與其他品種相比抗性較強(qiáng)；綠梨抗性次之，其在葉片和枝條鑒定中均表現(xiàn)為中抗。據(jù)前人研究植株受脅迫后體內(nèi)SOD、POD、CAT 活性和MDA 含量會(huì)提高[20-23]，后續(xù)研究可測(cè)定接菌后棉梨、也歷克阿木特和綠梨植株內(nèi)上述物質(zhì)含量，進(jìn)一步驗(yàn)證抗病水平。供試的31 個(gè)新疆梨品種對(duì)于梨火疫病抗性表現(xiàn)具有顯著性差異，整體抗病水平偏低。前人研究表明，火疫病抗性受基因控制[24]，抗病性由雙親遺傳給下一代，新疆梨系統(tǒng)是由西洋梨和東方梨雜交而來(lái)，西洋梨對(duì)火疫病表現(xiàn)為易感[25]，新疆梨可能受西洋梨的遺傳影響，整體上表現(xiàn)為感病。

本研究中，棉梨、也歷克阿木特和綠梨對(duì)梨火疫病的抗性綜合表現(xiàn)較好，其中綠梨的單花藥花粉量多、花粉活力強(qiáng)且萌發(fā)率高[26]，果實(shí)硬度小，種子多，是優(yōu)良的育種材料。將高抗基因遺傳積累是雜交育種培育抗病材料的整體思路[27]。Evrenoso?lu等[28]研究表明，梨火疫病抗性為多基因遺傳，母本遺傳效應(yīng)高于父本，但植株抗火疫病的表型在很大程度上受到環(huán)境變化的影響，因此在后續(xù)雜交培育抗病材料的方案中需因地制宜。綜上，棉梨、也歷克阿木特和綠梨可作為后續(xù)抗梨火疫病育種研究的材料。