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    基于廣泛代謝組學(xué)的荔枝果肉營(yíng)養(yǎng)代謝物綜合解析

    2022-09-01 08:02:08蔣儂輝朱慧莉肖志丹賴旭輝朱倩瑩
    食品科學(xué) 2022年16期
    關(guān)鍵詞:黃酮

    蔣儂輝,朱慧莉,劉 偉,向 旭,*,肖志丹,賴旭輝,凡 超,金 峰,朱倩瑩

    (1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南亞熱帶果樹(shù)生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省熱帶亞熱帶果樹(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510640;2.茂名市農(nóng)業(yè)農(nóng)村電子商務(wù)協(xié)會(huì),廣東 茂名 525000)

    荔枝(Sonn.)是典型亞熱帶常綠果樹(shù),因外觀鮮艷、果肉爽滑、香味濃郁等特點(diǎn)作為新鮮和加工產(chǎn)品而深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)。2020年荔枝種植面積約54. 03萬(wàn) hm,總產(chǎn)量約255. 35萬(wàn) t,產(chǎn)量和面積均居世界之首,其次是泰國(guó)、印度和越南,中國(guó)是荔枝原產(chǎn)地,栽培歷史長(zhǎng)達(dá)2 000多年,世界各地荔枝的栽培品種都以廣東為中心向四周傳播,經(jīng)古荔枝資源馴化或?qū)嵣x育而來(lái)。

    荔枝果肉作為可食用部分,含有豐富的糖類、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、粗纖維、胡蘿卜素及礦物質(zhì),被推薦為多糖、多酚、維生素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的良好來(lái)源,具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。幾個(gè)世紀(jì)以來(lái),荔枝被大量用于傳統(tǒng)中藥,近年來(lái),人們對(duì)荔枝的藥用和保健特性有了更深入的了解,荔枝果實(shí)產(chǎn)生一系列化學(xué)和生物多樣性化合物,這些代謝物是增強(qiáng)免疫力、抗菌、抗氧化、抗癌、降血脂和降血糖等多種健康效應(yīng)的來(lái)源。然而發(fā)揮上述功能的具體物質(zhì)的揭示仍然停留在粗成分上,對(duì)發(fā)揮功能的具體成分和機(jī)理的探索仍然不足。

    基于超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time of flight-tandem mass spectrometry,UPLC-QTOF-MS/MS)的廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)的發(fā)展使人們能夠?qū)Ω鞣N植物器官中的代謝物進(jìn)行剖析和鑒定,從而鑒定出數(shù)千種生物活性代謝物,并彌合基因型和表型之間的差距,在品質(zhì)評(píng)價(jià)、品種鑒定、選擇性育種等方面能夠發(fā)揮重要作用。荔枝資源極為豐富,在長(zhǎng)期栽培過(guò)程中,形成了許多適應(yīng)當(dāng)?shù)丨h(huán)境條件的優(yōu)良荔枝品種,荔枝的營(yíng)養(yǎng)功能成分的含量和組成具有深刻的遺傳背景,并受發(fā)育狀態(tài)和栽培條件影響,因此不同品種荔枝可能在營(yíng)養(yǎng)功能成分含量和組成,乃至功效上存在很大的差異。對(duì)荔枝種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定、評(píng)價(jià)是有效利用資源的前提。因此,研究商品荔枝品種的代謝組可以提供不同基因型果實(shí)包括營(yíng)養(yǎng)特征在內(nèi)的多樣性的全面信息,并對(duì)開(kāi)發(fā)營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)優(yōu)良的新品種發(fā)揮作用。

    已有研究揭示了荔枝不同品種之間在多酚類等抗氧化成分存在顯著差異,但目前鮮見(jiàn)從代謝組學(xué)的角度對(duì)荔枝果肉營(yíng)養(yǎng)化合物進(jìn)行全面系統(tǒng)研究,不同品種的營(yíng)養(yǎng)物差異遠(yuǎn)不能反映荔枝資源豐富多樣性的概貌。鑒于荔枝果肉是最大的可食部位,本研究采用廣泛靶向代謝組學(xué)方法,對(duì)10 個(gè)商業(yè)化荔枝品種的果肉代謝產(chǎn)物的復(fù)雜而獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)狀況進(jìn)行研究,有助于全面了解荔枝果實(shí)的營(yíng)養(yǎng)特征,剖析荔枝果肉重要代謝產(chǎn)物的潛在功能,對(duì)荔枝的鮮食、加工利用、栽培育種乃至醫(yī)療保健至關(guān)重要。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    2018年6—7月,從4 個(gè)栽培基地中選出10 個(gè)荔枝品種。試材的栽培管理措施基本一致。每個(gè)品種從3 株不同樹(shù)冠的植株邊緣的東、南、西和北方向選擇30 個(gè)大小相同(成熟、無(wú)病害和無(wú)損傷)的果實(shí)。將果實(shí)包裝在密封食品袋后,立即放在干冰中及時(shí)運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室。果實(shí)信息見(jiàn)表1。

    表1 不同荔枝品種的樣品信息Table 1 Information about differrent litchi varieties tested in this study

    甲醇、乙腈、乙酸(均為色譜級(jí)) 德國(guó)Merck公司;標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich和昆明BioBioPha公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Shim-pack UFLC CBM30A超高效液相色譜系統(tǒng)日本島津公司;6500 QTRAP串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國(guó)Thermo Fisher公司。

    1.3 方法

    1.3.1 樣品處理

    運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室的荔枝取用果肉部分,首先進(jìn)行真空冷凍干燥,研磨至粉末狀。準(zhǔn)確稱量樣品粉末(100 mg)并溶解于1.0 mL 70%甲醇溶液中進(jìn)行萃取,溶解后的樣品在4 ℃冷藏過(guò)夜,期間旋轉(zhuǎn)3 次。10 000×離心10 min后,吸取上清液,通過(guò)0.22 μm微孔膜過(guò)濾樣品,并貯存在注射瓶中進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。

    1.3.2 儀器條件

    參照Chen Wei等建立的方法。色譜柱Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);流動(dòng)相,超純水(含0.04%乙酸)和乙腈(含0.04%乙酸);梯度洗脫:0~11 min,95%~5% A、5%~95% B;12~12.1 min,5%~95% A、95%~5% B;12.1~15 min,95% A、5% B;流速0.4 mL/min;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量2 μL。在500 ℃和5 500 V條件下使用電噴霧電離方式進(jìn)行質(zhì)譜分析。氣幕壓力為25 psi,碰撞誘導(dǎo)電離設(shè)置為高。

    1.3.3 質(zhì)控(quality control,QC)樣本測(cè)定

    QC樣本由10 個(gè)不同品種荔枝樣本提取物等量混合制備,3 個(gè)重復(fù),與分析樣本采用相同的方法處理和檢測(cè),在儀器檢測(cè)的過(guò)程中,每10 個(gè)檢測(cè)分析樣本中插入1 個(gè)QC樣品,以考察整個(gè)分析過(guò)程的重復(fù)性。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    數(shù)據(jù)分析:基于Metware武漢邁維生物科技有限公司MVDB V2.0數(shù)據(jù)庫(kù)和公共數(shù)據(jù)庫(kù)代謝物信息對(duì)代謝物進(jìn)行定性分析。初級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜分析根據(jù)現(xiàn)有的MassBank、KNAPSAcK、HMDB和METLIN等質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)。采用三重四極桿質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。在獲得不同樣品中代謝物的質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)后,使用軟件Analyst 1.6.3對(duì)所有質(zhì)譜峰的峰面積進(jìn)行積分,并對(duì)不同樣品中相同代謝物的質(zhì)譜峰進(jìn)行積分和校正。根據(jù)得到的保留時(shí)間、質(zhì)荷比和峰強(qiáng)進(jìn)行了注釋。另外,采用Graphpad Prism 8.0和iIBM SPSS 25軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。樣品組間比較采用Duncan新復(fù)極差值法,<0.05,差異顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 代謝物的質(zhì)量控制分析與積累特征分析

    采用重疊顯示分析法對(duì)混合QC樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析,對(duì)得到的總離子流圖進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn),代謝物檢測(cè)的總離子流曲線具有很高的重疊度,即保留時(shí)間和峰強(qiáng)一致,說(shuō)明儀器信號(hào)穩(wěn)定性良好。以MVDB數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ),用質(zhì)譜對(duì)樣品中的代謝物進(jìn)行定性和定量分析,多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式代謝物檢測(cè)多峰圖顯示了樣品中可檢測(cè)到的物質(zhì)。每個(gè)色譜峰的峰面積代表相應(yīng)物質(zhì)的相對(duì)含量。經(jīng)導(dǎo)出并保存所有色譜峰面積的積分?jǐn)?shù)據(jù),最后確定了539 種不同的代謝物。

    圖1 10 個(gè)荔枝品種代謝產(chǎn)物的2D PCA評(píng)分圖(A)及聚類熱圖(B)Fig. 1 2D PCA score plot (A) and cluster heat map (B) of metabolites in 10 litchi cultivars

    對(duì)所有重復(fù)的樣品以及QC樣品進(jìn)行主成分分析(principal component analysis,PCA),以評(píng)估代謝譜數(shù)據(jù)的質(zhì)量(圖1A)。可以看到所有QC樣品在PCA中聚集在一起,變異性很小,表明數(shù)據(jù)可靠;圖1A可以清楚地區(qū)分10 個(gè)品種,表明它們的果實(shí)代謝物存在較大的差異,對(duì)每個(gè)樣品的數(shù)據(jù)處理可重復(fù)、可靠;此外,‘桂味’‘糯米糍’‘金包銀’‘御金球’‘仙進(jìn)奉’‘翡脆’‘北園綠’等品種主要分布在PC1的正半軸上,而‘三月紅’‘白糖罌’‘妃子笑’3 個(gè)品種分布在PC1的負(fù)半軸上。

    為了對(duì)具有相同特征的代謝物進(jìn)行分類,以確定代謝物特征的組間變異,對(duì)10 個(gè)品種539 種代謝物進(jìn)行聚類熱圖分析(圖1B)標(biāo)明不同品種間存在明顯的分組模式,共聚類為3 組:組1的‘三月紅’,組2的‘白糖罌’‘妃子笑’和組3的‘桂味’‘糯米糍’‘金包銀’‘御金球’‘仙進(jìn)奉’‘翡脆’‘北園綠’,推測(cè)可能與品種之間的熟性及風(fēng)味品質(zhì)相對(duì)應(yīng),‘三月紅’是特早熟品種,風(fēng)味品質(zhì)及商品性較差,‘白糖罌’‘妃子笑’為早熟品種,風(fēng)味品質(zhì)及商品性較好,而‘桂味’‘糯米糍’‘金包銀’‘御金球’‘仙進(jìn)奉’‘翡脆’‘北園綠’為中晚熟品種,通常認(rèn)為風(fēng)味品質(zhì)及商品性優(yōu)良。

    2.2 代謝物組成分析

    2.2.1 代謝物的分類

    根據(jù)代謝物的結(jié)構(gòu)分為12大類(圖2A)。其中初生代謝物298 個(gè)(55.29%),次生代謝物228 個(gè)(42.30%)、其他類13 個(gè)(2.41%);初生代謝物包含氨基酸及其衍生物(82 個(gè),15.21%)、脂質(zhì)(60 個(gè),11.13%)、有機(jī)酸(59 個(gè),10.95%)、核苷酸及其衍生物(53 個(gè),9.83%)、糖類及醇類(25 個(gè),4.64%)、維生素(19 個(gè),3.53%);次生代謝物包含黃酮(129 個(gè),23.93%)、酚酸類(54 個(gè),10.02%)、生物堿(31 個(gè),5.75%)、木脂素和香豆素(9 個(gè),1.67%)、原花青素(5 個(gè),0.93%)。

    圖2 10 個(gè)荔枝品種代謝物組成分類圖Fig. 2 Classification and composition of metabolites in 10 litchi varieties

    2.2.2 品種間營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)差異比較

    比較不同荔枝品種中的總代謝物(圖2B),‘三月紅’‘白糖罌’‘妃子笑’‘桂味’與‘仙進(jìn)奉’的峰面積顯著高于‘翡脆’‘糯米糍’和‘金包銀’,這表明‘三月紅’‘白糖罌’‘妃子笑’‘桂味’與‘仙進(jìn)奉’等品種的總代謝物有更高的離子豐度。

    初生代謝物比較(圖2C)發(fā)現(xiàn)‘白糖罌’‘妃子笑’的離子豐度也顯著高于‘桂味’‘翡脆’‘糯米糍’‘仙進(jìn)奉’‘金包銀’‘北園綠’(<0.05)。次生代謝物比較(圖2D)發(fā)現(xiàn)‘妃子笑’‘桂味’的次生代謝物峰面積顯著高于‘三月紅’‘翡脆’‘白糖罌’‘御金球’‘金包銀’‘仙進(jìn)奉’‘糯米糍’。初生代謝物包含了常規(guī)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)次生代謝物通常包含了大量的功能性化合物,這些功能性化合物通常與抗氧化、抵抗疾病及生物脅迫有關(guān)。

    2.3 代謝物營(yíng)養(yǎng)成分分析

    果肉組織的代謝組學(xué)分析鑒定了多種代謝物,各類中數(shù)量較多,為研究最重要的化合物,依據(jù)峰面積高低,分析各類成分中相對(duì)含量不小于1%的代謝物。

    2.3.1 初生代謝物

    圖3 荔枝果肉主要的初生代謝物Fig. 3 Major primary metabolites of litchi pulp

    2.3.1.1 糖類和醇類

    荔枝果實(shí)中的糖含量及成分組成直接影響果實(shí)的內(nèi)在品質(zhì)和風(fēng)味。實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)到糖類和多元醇類25 種,其中糖類18 種,多元醇7 種,圖3A顯示相對(duì)含量大于1%的糖和醇類依次有:-(+)-蔗糖、-(+)-葡萄糖、-果糖-6-磷酸、-乙酰氨基葡萄糖、葡萄糖酸、-景天庚酮糖-7-磷酸、磷酸葡糖酸、-阿拉伯糖、肌醇、-葡萄糖-6-磷酸、己六醇、-山梨糖醇、2-脫氧核糖1-磷酸、葡萄糖醛酸、氨基葡萄糖(圖4A)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)荔枝中的低聚糖不僅有游離態(tài)的-(+)-蔗糖、-(+)-葡萄糖、-(-)-蘇阿糖、-阿拉伯糖,還有果糖、景天庚酮糖、脫氧核糖、海藻糖、松三糖的磷酸化合物,其中葡萄糖以磷酸化、氨基化、酸化、酯化、醛基化等多種形式存在。肌醇的相對(duì)含量較高(2.15%),這是一種廣泛分布在動(dòng)物和植物體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),此外還鑒定到己六醇、-山梨糖醇、-甘露醇等醇類,后二者也是荔枝甜味的來(lái)源之一。

    2.3.1.2 有機(jī)酸

    果實(shí)的風(fēng)味品質(zhì)主要取決于有機(jī)酸及糖的含量及其比例,鑒定結(jié)果顯示荔枝果肉中有機(jī)酸種類豐富,共檢測(cè)到59 種有機(jī)酸,圖3B顯示相對(duì)含量大于1%的化合物依次有:檸檬酸、延胡索酸、木糖酸、-蘋果酸、甲基丙二酸、琥珀酸、磷酸、戊二酸、甲基丁二酸、-羥基異戊酸、氨基丙二酸、-2-氨基辛酸、(-)-莽草酸、己二酸、2-甲基戊二酸(圖4B)。荔枝有機(jī)酸的范圍較以往的報(bào)道更為廣泛,首次發(fā)現(xiàn)荔枝中存在延胡索酸、木糖酸、反式烏頭酸、順式烏頭酸、-酮戊二酸、肌酸,對(duì)存在爭(zhēng)議的琥珀酸和酒石酸,本實(shí)驗(yàn)中有檢出,分別占8.25%、0.04%。盡管荔枝中有機(jī)酸的含量相較糖的含量更低,但卻賦予荔枝獨(dú)特的風(fēng)味。

    2.3.1.3 氨基酸及其衍生物

    氨基酸是蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)單元,荔枝氨基酸種類及含量豐富,檢測(cè)到85 種氨基酸,包括20 種基礎(chǔ)氨基酸及8 種必需氨基酸,其中基礎(chǔ)氨基酸占全部氨基酸的49.39%,必需氨基酸占全部氨基酸的24.82%。圖3C顯示,相對(duì)含量大于1%的氨基酸及其衍生物依次有:-氨基丁酸、-纈氨酸、纈氨酸、還原型谷胱甘肽、2-氨基己二酸、-乙酰--賴氨酸、-色氨酸、-(+)-賴氨酸、5-氧化脯氨酸、3-羥基-3-甲基谷氨酸、-(+)-精氨酸、-(-)-酪氨酸、-谷氨酰胺、-絲氨酸、組胺(圖4C)。本實(shí)驗(yàn)鑒定發(fā)現(xiàn)荔枝含有5 種鮮味氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸),占全部氨基酸的3.96%,其中對(duì)鮮味貢獻(xiàn)最大的谷氨酸和天冬氨酸占0.98%。鑒定發(fā)現(xiàn)荔枝果肉中的-氨基丁酸相對(duì)含量最高,為17.02%,這進(jìn)一步證明了荔枝富含-氨基丁酸這一功能性成分,人體必需氨基酸之一的-纈氨酸相對(duì)含量?jī)H次于-氨基丁酸。

    2.3.1.4 核苷酸及其衍生物

    核苷酸是大分子多聚體核酸的單體,本實(shí)驗(yàn)共鑒定獲得53 種核苷酸及其衍生物,其中相對(duì)含量大于1%的核苷酸及其衍生物依次有:2-脫氧核糖-5-磷酸鈉、2’-脫氧胞苷-5’-單磷酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷、嘌呤堿、1-甲基腺嘌呤、肌苷、胞嘧啶、5’-肌苷酸、鳥(niǎo)嘌呤、2’-脫氧尿苷、鳥(niǎo)苷-5’-單磷酸、脫氧胞苷、核糖腺苷酸、胸苷、腺苷-5’-單磷酸、1-甲基黃嘌呤、7-甲基黃嘌呤、鳥(niǎo)苷-3’,5’-環(huán)一磷酸、甲基鳥(niǎo)苷、2-脫氧腺苷(圖3D)。研究中檢測(cè)到5’-肌苷酸、5’-鳥(niǎo)苷酸的存在,這是兩種典型的呈鮮味核苷酸,占全部核苷酸的3.71%。

    2.3.1.5 維生素及其衍生物

    荔枝果肉中共鑒定出19 種維生素,絕大多數(shù)為水溶性維生素,占相對(duì)含量的99.54%,脂溶性維生素(VA、VD、VK)僅占0.46%。如圖3E所示,相對(duì)含量大于1%的維生素類有吡哆醇、抗壞血酸、煙酸核糖核苷、煙酸己糖苷、煙酰胺、煙酸,占全部維生素及其衍生物的97.04%,且全部為水溶性維生素,參與糖代謝、脂質(zhì)代謝、氨基酸及蛋白質(zhì)代謝等多種生理功能。

    2.3.1.6 脂類及其衍生物

    荔枝果肉中共鑒定出61 種脂類物質(zhì),其中脂肪酸14 種、甘油酯14 種、甘油磷脂31 種。相對(duì)含量大于1%脂肪酸和甘油酯依次有:棕櫚醛、9-羥基-(10,12,16)十八碳三烯酸、單酰甘油酯(?;?8:3)異構(gòu)1、十八碳-9,13,15-三烯酸、單酰甘油酯(?;?18:3)異構(gòu)5、單酰甘油酯(?;?8:2)異構(gòu)2、單酰甘油酯(?;?8:1)異構(gòu)1、膽固醇、單酰甘油酯二糖(18:1)、單酰甘油酯二糖(18:2)異構(gòu)1、單酰甘油酯(18:2)、石榴酸、9,10-環(huán)氧十八碳二烯酸,見(jiàn)圖3F。其中的不飽和脂肪酸主要由18碳組成,約占總脂肪酸含量的49.56%,且?guī)缀跞渴嵌┧岷腿┧帷?-羥基-(10,12,16)十八碳三烯酸占17.71%、單酰甘油酯(酰基18:3)異構(gòu)1占17.49%,是荔枝中主要的脂肪酸和甘油酯。此外相對(duì)含量最高的棕櫚醛(占26.02%),具有花和蠟的弱香氣。甘油磷脂是最重要的磷脂,是親水親脂兩性分子。檢測(cè)到甘油磷脂占總脂肪的89.26%,包括22 種溶血磷脂酰膽堿和9 種溶血磷脂酰乙醇胺,它們是磷脂分解代謝的主要產(chǎn)物。首次發(fā)現(xiàn)荔枝中含有石榴酸,這是一種具有3 個(gè)共軛雙鍵的共軛亞油酸。

    2.3.2 次生代謝物

    圖4 荔枝果肉主要的次生代謝物Fig. 4 Major secondary metabolites of litchi pulp

    2.3.2.1 黃酮

    荔枝中的黃酮種類及含量非常豐富,共計(jì)鑒定出129 種黃酮類代謝物,分屬于10 個(gè)亞類(黃酮、黃酮醇、黃烷醇類、花青素、二氫黃酮、二氫黃酮醇、黃酮碳糖苷、異黃酮、查耳酮、雙黃酮)。圖4A顯示,相對(duì)含量大于1%的黃酮依次有:異鼠李素-5--己糖苷、山柰酚-3--蕓香糖苷、木犀草素-8--己糖苷--己糖苷、異鼠李素-3--新橙皮糖苷、羥甲基黃酮-5--己糖苷、-己糖基芹菜素--咖啡酰己糖苷、花翠素-3--葡萄糖苷、橙皮素-5--葡萄糖苷、金圣草黃素--己糖基--蕓香糖苷、異槲皮苷、繡線菊苷、柚皮素-7--新橘皮糖苷(柚皮苷)、槲皮素-7--蕓香糖苷、異鼠李素--己糖苷、圣草酚--己糖、芹菜素--丙二酰己糖苷、甲基槲皮素--己糖苷、橙皮苷、木犀草素--己糖基--鼠李糖苷--己糖苷、矢車菊素、扁蓄苷、6--己糖基-橙皮素--己糖苷、新橙皮苷,包含7 個(gè)黃酮醇,8 個(gè)黃酮,1 個(gè)黃酮碳糖苷,3 個(gè)二氫黃酮,1 個(gè)二氫黃酮醇,2 個(gè)花青素。數(shù)據(jù)顯示異鼠李素-5--己糖苷是荔枝果肉成熟期相對(duì)含量最高(22.18%)的黃酮化合物,山柰酚-3--蕓香糖苷(10.90%)相對(duì)含量也高達(dá)10.90%;另外荔枝果肉的次生代謝產(chǎn)物中,黃酮化合物常以金圣草黃素、麥黃酮、木犀草素、芹菜素結(jié)合己糖、蕓香糖等糖苷形式存在,而黃酮醇以山柰酚、槲皮素和異鼠李素結(jié)合己糖苷、蕓香苷和鼠李糖苷存在。

    2.3.2.2 酚酸

    荔枝酚酸種類及含量豐富,這些化合物對(duì)人體健康和預(yù)防慢性病起著重要作用,共計(jì)鑒定出54 種酚酸類代謝物,它們分屬于6 個(gè)亞類(羥基肉桂酰類24 種、苯甲酸類14 種、奎寧酸類6 種、有機(jī)酸類5 種、兒茶素類3 種、酚胺2 種)。圖4B顯示,相對(duì)含量大于1%的酚酸依次有:對(duì)苯二甲酸、鄰苯二甲酸酐、鄰氨基苯甲酸二己糖苷、2,5-二羥基苯甲酸--己糖苷、原兒茶醛、2-甲酰氨基苯甲酸、奎寧酸、對(duì)羥基苯甲酸、4-香豆酸、苯甲酸、綠原酸、原兒茶酸、丁香酰己糖苷、阿魏酸丁香酸、新綠原酸、紫丁香苷、咖啡酰--葡萄糖苷。其中苯甲酸類最多,占全部酚酸相對(duì)含量的69.01%,其次是奎寧酸類(7.81%)、羥基肉桂酰類(6.53%)及兒茶素類(6.32%)。

    2.3.2.3 生物堿

    荔枝生物堿共鑒定出31 種化合物,分屬于4 個(gè)亞類(生物堿18 種、酚胺類7 種、吲哚類5 種、異喹啉類1 種)。圖4C顯示,相對(duì)含量大于1%的生物堿依次有:葫蘆巴堿、哌啶、甲氧基吲哚乙酸、吲哚、-甘油-3-磷酸膽堿、腐胺、1,4-二氫-1-甲基-4-氧代-3-吡啶甲酰胺、甜菜堿、乙酰膽堿、-乙酰丁二胺、精胺、胍丁胺、膽堿、椰油酰胺丙基甜菜堿、5-氨基酮戊酸鹽、甲酰四氫葉酸,其中葫蘆巴堿和哌啶是荔枝果肉中兩個(gè)相對(duì)含量最高的生物堿(25.84%和11.69%)。

    2.3.2.4 木質(zhì)素和香豆素

    共鑒定出9 種木質(zhì)素和香豆素類代謝物,其中含香豆素類物質(zhì)8 種,分別屬于香豆素類和羥基肉桂酰類。圖4D顯示相對(duì)含量大于1%的有芥子酰羥基香豆素、東莨菪內(nèi)酯、秦皮素、阿魏酸-4-羥基香豆素、6-羥甲基脫腸草素、二氫香豆素、秦皮甲素,排名第一的芥子酰羥基香豆素相對(duì)含量達(dá)34.24%。

    2.3.2.5 單寧

    共鑒定出6 種單寧類代謝物:原花青素B、原花青素B、原花青素A、原花青素A、原花青素A、沒(méi)食子酸-己糖苷。圖4E顯示,相對(duì)含量大于1%的有原花青素B、原花青素B、原花青素A。單寧又稱為鞣酸,分水解單寧和縮合單寧(原花青素),在本研究中,原花青素B和原花青素B的含量顯著高于其他種類的原花青素。

    3 討 論

    對(duì)荔枝果肉的大規(guī)模的代謝譜進(jìn)行了綜合分析,揭示了荔枝中不同類別的多種代謝物(共539 種代謝物)。10 個(gè)品種中鑒定出的代謝物的豐度各不相同,品種之間代謝物的量化表明代謝物離子豐度的差異模式,很明顯,代謝物情況隨基因型的不同而不同。

    3.1 影響荔枝風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)的初生代謝物

    荔枝果實(shí)的味道以甜味和酸味為主,這與主要代謝產(chǎn)物有關(guān),尤其是可溶性糖和有機(jī)酸的含量。以往的報(bào)道描述荔枝果實(shí)主要以積累蔗糖、葡萄糖和果糖為主,糖是荔枝果肉的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),其含量高達(dá)10%~19.2%,而還原糖占70%,且不同品種間糖組分的比值差異很大,表現(xiàn)為不同類型糖積累模式,荔枝多糖單糖組成主要含有阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、鼠李糖和木糖。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)荔枝代謝產(chǎn)物中不僅有游離態(tài)的-(+)-蔗糖、-(+)-葡萄糖、-(-)-蘇阿糖、-阿拉伯糖,還有果糖、景天庚酮糖、脫氧核糖、海藻糖、松三糖的磷酸化合物,其中葡萄糖以磷酸化、氨基化、酸化、脂化、醛基化等多種形式存在,可見(jiàn)糖類代謝物中結(jié)合態(tài)是其存在的主要形式。-(-)-蘇阿糖、景天庚酮糖海藻糖、松三糖是首次在荔枝果肉中發(fā)現(xiàn);此外,荔枝果實(shí)缺乏貯藏性碳水化合物(如淀粉),在成熟過(guò)程中主要通過(guò)可溶性糖增加甜度,某些醇類也能貢獻(xiàn)部分甜度,如有甜味的-甘露醇、-山梨糖醇。有機(jī)酸類在植物的葉、根、特別是果實(shí)中廣泛分布,是衡量果實(shí)口感和風(fēng)味等內(nèi)在品質(zhì)的重要指標(biāo)之一,也是判斷果實(shí)加工特性、成熟特性及貯藏特性等的重要指標(biāo),已有報(bào)道顯示荔枝的有機(jī)酸主要有蘋果酸、檸檬酸、丙酮酸、抗壞血酸、草酸、乳酸、酒石酸、富馬酸、乙酸、琥珀酸、莽草酸,并以蘋果酸為主,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)荔枝有機(jī)酸的種類更加豐富,還存在延胡索酸、木糖酸、反式烏頭酸、順式烏頭酸、-酮戊二酸、肌酸等有機(jī)酸。氨基酸、核苷酸及部分黃酮類物質(zhì)的組成和含量同樣賦予獨(dú)特的荔枝風(fēng)味;食品中呈鮮味的氨基酸主要有谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸及其鈉鹽,并以谷氨酸、天冬氨酸最主要,在荔枝中鑒定到上述5 種呈味氨基酸。在荔枝中發(fā)現(xiàn)了5’-肌苷酸、5’-鳥(niǎo)苷酸兩種典型的呈鮮味核苷酸;此外還發(fā)現(xiàn)荔枝中黃酮類物質(zhì)異鼠李素-5--己糖苷(22.18%)與山柰酚-3--蕓香糖苷(10.90%)是果肉成熟期相對(duì)含量最高的黃酮化合物,對(duì)荔枝果實(shí)的顏色以及風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生影響。

    荔枝富含各類營(yíng)養(yǎng)代謝物。荔枝中氨基酸種類豐富,以往的研究發(fā)現(xiàn)氨基酸組分質(zhì)量濃度變化范圍介于98.7~396.9 mg/100 mL之間,平均質(zhì)量濃度達(dá)288.64 mg/100 mL,鑒定發(fā)現(xiàn)荔枝包括20 種基礎(chǔ)氨基酸、8 種必需氨基酸,荔枝中的-纈氨酸(10.18%)是人體必需氨基酸之一,缺乏時(shí)會(huì)引起神經(jīng)障礙、發(fā)育停止、體質(zhì)量下降、貧血等及其他一系列生理問(wèn)題。荔枝果肉中的核苷酸種類豐富,鑒定多達(dá)53 種,核苷酸通過(guò)參與細(xì)胞代謝和更新,改善細(xì)胞活力,提高機(jī)體自身功能和自我調(diào)節(jié)能力,實(shí)現(xiàn)最佳生理平衡狀態(tài)。荔枝的脂類物質(zhì)中以脂肪酸、甘油酯及甘油磷脂為主,其中的不飽和脂肪酸主要是18碳不飽和脂肪酸(49.56%),值得注意的是幾乎全部是二烯酸和三烯酸,眾所周知,十八碳不飽和脂肪酸(如亞麻酸和亞油酸)不僅是C和C揮發(fā)物的前體,而且在植物對(duì)生物和非生物脅迫的響應(yīng)中起著重要作用。荔枝果肉中幾乎全部為水溶性維生素,其中相對(duì)含量較大的煙酸(VB)是葡萄糖耐量因子的組成物,在身體中是可以增強(qiáng)胰島素作用的營(yíng)養(yǎng)素,因此其有影響身體調(diào)節(jié)血糖高低的能力。

    3.2 荔枝果肉中的主要次生代謝物及其功效

    黃酮、酚酸、生物堿為荔枝果肉中主要的次生代謝物。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黃酮、黃酮醇、黃烷醇類、花青素及二氫黃酮是荔枝果肉中主要的黃酮類代謝物,已知黃酮類化合物對(duì)植物的抗氧化、抗脅迫和繁衍有著重要作用,也作為信號(hào)分子參與各類生物代謝途徑。荔枝的酚類物質(zhì)種類及含量豐富,酚類物質(zhì)是植物中重要的次生代謝物質(zhì)和天然的強(qiáng)還原性物質(zhì),代表了水果清除自由基的水平,這些天然存在的酚類化合物,對(duì)人體健康和預(yù)防慢性病有重要作用,具有抗氧化、抗心血管疾病、抗糖尿病等生物活性。酚酸中以苯甲酸類(69.01%)最為豐富,其次是奎寧酸類(7.81%)、羥基肉桂酰類(6.53%)、兒茶素類(6.32%)。生物堿被認(rèn)為是一類重要的天然有機(jī)化合物,它不僅是人類飲食的重要組成部分,而且多數(shù)生物堿具有顯著生理活性,因其具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌和殺蟲(chóng)等特性,受到人們的關(guān)注,荔枝果肉中生物堿種類及含量豐富,生物堿、酚胺類、吲哚類、異喹啉類是其主要的類別,以葫蘆巴堿及哌啶的相對(duì)含量最高。香豆素中的芥子酰羥基香豆素相對(duì)含量最高,這種羥基香豆素對(duì)于奧狄括約肌有很好的松弛作用,它還具有很強(qiáng)的解痙和鎮(zhèn)痛的功效,具有明顯的利膽作用。

    3.3 幾種值得關(guān)注的藥食同源化合物

    化合物-氨基丁酸、肌醇、石榴酸、葫蘆巴堿通常有獨(dú)特的功效。鑒定結(jié)果表明,-氨基丁酸在荔枝果肉氨基酸中的相對(duì)含量最高,是果肉中主要氨基酸組分;以往的研究發(fā)現(xiàn)-氨基丁酸平均質(zhì)量濃度為101.68~143.82 mg/100 mL,含量達(dá)到游離氨基酸總量的38.6%,-氨基丁酸是作為一種四碳非蛋白氨基酸,是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì),具有多種生理活性,包括降低血壓、防止動(dòng)脈硬化、治療精神疾病、促進(jìn)免疫、預(yù)防癌癥、保護(hù)心腦血管、預(yù)防呼吸道疾病、調(diào)節(jié)激素等多種生理功能。荔枝中的肌醇在被鑒定的醇類中最高(2.15%),肌醇不僅在食品工業(yè)中作為營(yíng)養(yǎng)劑使用,與膽堿結(jié)合之后會(huì)產(chǎn)生卵磷脂從而降低血脂,促進(jìn)膽固醇代謝,還能改善細(xì)胞營(yíng)養(yǎng),促進(jìn)發(fā)育,有報(bào)道顯示,肌醇在胰島素作用的信號(hào)傳遞中也起重要作用,對(duì)II型糖尿病具有顯著療效;作為生長(zhǎng)因子肌醇還可應(yīng)用于治療慢性肝炎、肝硬化、脂肪肝及肝癌的藥物合成。本研究發(fā)現(xiàn)荔枝中含有石榴酸,這種3 個(gè)共軛雙鍵的共軛亞油酸大量存在于石榴籽油中,具有很強(qiáng)的清除人體自由基能力,有預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、提高機(jī)體免疫力、促進(jìn)皮膚細(xì)胞新陳代謝、抗癌、抗肥胖、抗糖尿病以及抗炎等多種生理功效。本實(shí)驗(yàn)還首次鑒定到葫蘆巴堿,且相對(duì)豐度在荔枝生物堿中最高;現(xiàn)代藥理學(xué)表明葫蘆巴堿具有降血糖、降血脂和抗腫瘤等活性作用,還能調(diào)節(jié)植物的各種生理生化功能,是植物抗逆境的一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),具有類似激素的功能。此外果肉組織中的哌啶以其作為腎素抑制劑提供心臟保護(hù)的作用而聞名。天然藥物中降糖活性成分主要有黃酮類、多酚類、皂苷類、生物堿類等,以往對(duì)荔枝降血糖活性的研究多集中于黃酮多酚類物質(zhì),如縮合單寧,而肌醇、石榴酸及葫蘆巴堿在荔枝中的高豐度提示其在降血糖作用中的潛在貢獻(xiàn)。

    4 結(jié) 論

    采用基于UPLC-QTOF-MS/MS的廣泛靶向代謝組分析,對(duì)10 個(gè)荔枝品種的果肉中539 種代謝物進(jìn)行鑒定,提供了關(guān)于荔枝這一特色商業(yè)水果的代謝物組成和豐度的全面信息,發(fā)現(xiàn)初生代謝物298 個(gè)(55.29%),次生代謝物228 個(gè)(42.30%),確定糖類和醇類、有機(jī)酸、氨基酸、脂質(zhì)、核苷酸是主要的初生代謝物,黃酮、酚酸類、生物堿是主要的次生代謝物。系統(tǒng)地比較了10 個(gè)荔枝品種間代謝物差異,PCA和聚類熱圖分析發(fā)現(xiàn)不同品種間存在明顯的分組模式,聚類為3 組,且與品種之間的熟期相對(duì)應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)‘妃子笑’‘桂味’無(wú)論在初生代謝物還是在次生代謝物的離子豐度均較高。

    本研究關(guān)注了每類成分相對(duì)含量大于1%的最重要的代謝物,總體上,揭示了各類代謝物對(duì)荔枝果肉營(yíng)養(yǎng)的貢獻(xiàn),發(fā)現(xiàn)了-氨基丁酸、肌醇、石榴酸、葫蘆巴堿幾種豐度較高且功能優(yōu)異的代謝物,有些還是首次被報(bào)道,其在荔枝中的作用機(jī)理及對(duì)人類健康效益還有待進(jìn)一步研究。鑒于荔枝的代謝產(chǎn)物鑒定與人類營(yíng)養(yǎng)與健康、果實(shí)風(fēng)味及抗性密切關(guān)系,本實(shí)驗(yàn)將為鮮食營(yíng)養(yǎng)、栽培育種、綜合利用提供理論依據(jù)和參考信息。

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