六堡茶渥堆過(guò)程中可培養(yǎng)微生物的分離與鑒定

黃紫衡，陳 歡，黃 麗,*，夏 寧，滕建文，韋保耀，陳 瑜，余 煉

（1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧 530000；2.貴州省興義市敬南鎮(zhèn)人民政府，貴州 興義 562402）

六堡茶是中國(guó)黑茶的典型代表之一，以其原產(chǎn)地廣西梧州六堡鎮(zhèn)命名。六堡茶耐久貯藏，其外形色澤黑褐油潤(rùn)，湯色紅濃明亮，滋味醇和爽口，香氣醇陳，葉底銅褐色，故素以“紅、濃、醇、陳”四絕而著稱。六堡茶原料經(jīng)殺青、初揉、堆悶、復(fù)揉、干燥工藝制成毛茶，再經(jīng)過(guò)篩選、拼配、汽蒸或不汽蒸、渥堆、汽蒸、壓制成型或不壓制成型、陳化，最終得到成品，在生產(chǎn)中會(huì)根據(jù)不同產(chǎn)品需要而設(shè)計(jì)不同的壓制工藝流程。其中，渥堆對(duì)六堡茶品質(zhì)形成具有決定性的作用，渥堆過(guò)程是在高溫高濕的環(huán)境下微生物大量繁殖并且分泌多種胞外酶，茶葉在這些微生物酶的酶促作用以及微生物呼吸代謝產(chǎn)生的熱量以及水分的濕熱作用下，發(fā)生了茶多酚的氧化聚合，蛋白質(zhì)的分解、降解和碳水化合物的分解，還有各種產(chǎn)物之間的聚合縮合等一系列反應(yīng)。因此微生物活動(dòng)對(duì)六堡茶特殊風(fēng)味和品質(zhì)的形成具有重要作用，特別是在渥堆工序中微生物十分豐富和活躍。探明六堡茶在加工過(guò)程中以及成品中存在的微生物種類對(duì)研究六堡茶的品質(zhì)和安全性具有重大意義。

為能客觀真實(shí)地反映六堡茶微生物的群落特征，高通量測(cè)序技術(shù)采用免培養(yǎng)方法，可直接從樣品中提取DNA進(jìn)行擴(kuò)增從而獲得微生物信息。Zhao Ming、Ma Yan等認(rèn)為曲霉屬真菌來(lái)自于普洱茶原料且在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中為優(yōu)勢(shì)菌；趙仁亮等采用Illumina MiSeq技術(shù)研究報(bào)道了生產(chǎn)于不同地區(qū)的茯磚茶中曲霉屬在每個(gè)樣品中的豐度均在92%以上，是絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌種，厚壁菌門中的乳球菌屬為第一優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，還檢測(cè)到畢赤酵母屬、假絲酵母屬以及耐堿酵母屬，但相對(duì)豐度小于1%。Zhang Yongjie等應(yīng)用高通量rDNA擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)表明普洱茶的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在發(fā)酵前后變化顯著，發(fā)酵后的普洱茶細(xì)菌多樣性上升，真菌多樣性下降；Li Qin等采用Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù)分析茯磚茶加工過(guò)程中真菌群落的演替，結(jié)果顯示在發(fā)酵早期（原料黑茶到發(fā)酵3 d）曲霉屬、和念珠菌屬占優(yōu)勢(shì)，隨后，只有曲霉屬仍占優(yōu)勢(shì)并且至發(fā)酵結(jié)束一直保持相對(duì)穩(wěn)定。Mao Yan通過(guò)MiSeq測(cè)序技術(shù)得出在屬水平上成品六堡茶的優(yōu)勢(shì)菌為曲霉屬，其次是青霉屬和酵母。陳慶金等采用MiSeq測(cè)序技術(shù)對(duì)陳化初期不同時(shí)段的六堡茶真菌多樣性進(jìn)行了分析，在屬水平上真菌以曲霉屬為優(yōu)勢(shì)菌。在屬水平上，曲霉屬無(wú)疑是黑茶中的優(yōu)勢(shì)菌屬，葡萄球菌屬、短狀桿菌屬、考克氏菌屬、芽孢桿菌等是黑茶中普遍存在的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。雖然現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)（下一代測(cè)序技術(shù)）避免了微生物的培養(yǎng)，直接通過(guò)提取研究對(duì)象中微生物的總DNA分析樣品中菌群的多樣性信息，更能反映樣品中微生物分布的真實(shí)樣貌以及菌落結(jié)構(gòu)的變化，但僅采用高通量測(cè)序的方法，無(wú)法獲得純種菌株，也無(wú)法對(duì)其進(jìn)行功能性、產(chǎn)毒性等更進(jìn)一步的研究。所以將傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)兩者結(jié)合起來(lái)，既能客觀全面地揭示樣品中微生物的多樣性信息，也可以對(duì)感興趣的菌株進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究。

對(duì)于黑茶中微生物的鑒定已經(jīng)有很多，而在六堡茶渥堆階段微生物的研究較少。周夢(mèng)珍等在梧州茶廠4 種六堡散茶中分離純化得到菌核曲霉、江西青霉、阿姆斯特丹曲霉、赤曲霉、雜色曲霉變種、稻枝孢、、枝狀枝孢、無(wú)花果假尾孢9 種真菌；歐惠算從12 種不同年份、不同茶廠的六堡茶茶樣中分離鑒定得到8 個(gè)屬20 株微生物，并表明六堡茶微生物具有多樣性，主要以曲霉屬、青霉屬和酵母屬為主；徐書澤利用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)在3 個(gè)不同茶廠的14 個(gè)六堡茶樣品中分離鑒定得到5 個(gè)屬18 個(gè)種的微生物，包括曲霉屬8 種, 青霉屬7 種，擬青霉屬1 種，散囊菌屬1 種和酵母1 種，真菌數(shù)量范圍為3.9×10～1.1×l0CFU/g；溫志杰等的研究結(jié)果表明，霉菌數(shù)量在六堡茶渥堆過(guò)程中最高可達(dá)1.5×10CFU/g，其研究認(rèn)為六堡茶渥堆過(guò)程中細(xì)菌的數(shù)量最大，其次是酵母和霉菌。胡沛然從渥堆過(guò)程的六堡茶中分離鑒定得到嗜熱菌，其中包括細(xì)菌5 個(gè)屬、14 個(gè)種，霉菌5 個(gè)屬、9 個(gè)種。但目前對(duì)六堡茶微生物多樣性的探索還遠(yuǎn)不夠，且以成品茶中的微生物為研究對(duì)象的研究較多，涉及到六堡茶渥堆生產(chǎn)過(guò)程的微生物尤其是細(xì)菌的研究較少。因此，本研究以渥堆前的毛茶和各個(gè)渥堆階段的六堡茶為研究對(duì)象，從中分離出細(xì)菌、真菌和放線菌，并采用ITS和16S rDNA序列分析對(duì)其進(jìn)行鑒定，旨在得到六堡茶發(fā)酵過(guò)程中微生物種類的組成及變化，從微生物的種水平上了解六堡茶渥堆工藝的微生物變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

樣品采集于廣西梧州市，取渥堆前的毛茶、渥堆前期（發(fā)酵15 d）、中期（發(fā)酵45 d）、后期（發(fā)酵75 d）、末期（渥堆結(jié)束，發(fā)酵105 d）的樣品，貯存于無(wú)菌容器，低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室后立即進(jìn)行分離。

1.1.2 培養(yǎng)基

ISP7培養(yǎng)基：甘油15 mL，-酪氨酸0.5 g，-天冬酰胺1 g，復(fù)合鹽溶液10 mL，磷酸氫二鉀0.5 g，蒸餾水1 L，瓊脂1.4%，pH 7.3，每300 mL加重鉻酸鉀和磷酸氫二鉀各1 mL；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：稱取200 g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水500 mL左右煮沸0.5 h，過(guò)濾，再加20 g葡萄糖，瓊脂1.4%，加水至1 L；ISP2培養(yǎng)基：酵母提取粉2.0 g，麥芽提取粉2.0 g，葡萄糖2.0 g，瓊脂14 g，蒸餾水1 L，pH 7.2；氯硝胺18%甘油（DG18）瓊脂培養(yǎng)基：酪蛋白胨5 g，無(wú)水葡萄糖10 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，氯硝胺0.002 g，無(wú)水甘油200 g，瓊脂15 g，氯霉素0.1 g，蒸餾水1 L；形態(tài)學(xué)觀察所用的培養(yǎng)基為查氏（Czapek dox agar，CA）培養(yǎng)基和查氏酵母膏（Czapek yeast autolysate agar，CYA）培養(yǎng)基。上述培養(yǎng)基配制后于高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃條件下滅菌20 min備用。

1.2 儀器與設(shè)備

T100Thermal Cyeler聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、Universal Hood II紫外成像儀、PowerPacBasic電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；MC6000微型離心機(jī)、DH300干式恒溫器 杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

每個(gè)茶葉樣品取2 g于預(yù)先滅菌的研缽磨碎，加入20 mL無(wú)菌蒸餾水中混勻，用旋渦振蕩器振蕩30 min。接種方法為取1 mL原液依次稀釋至10、10、10、10、10，用移液槍分別吸取200 μL每個(gè)稀釋度的樣品菌懸液，均勻涂布于已經(jīng)配置好的平板培養(yǎng)基上，每個(gè)樣品每個(gè)稀釋度每種培養(yǎng)基涂布3 個(gè)平板，分別置于28、37、48 ℃的恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.2 六堡茶中微生物的分離純化

待菌落長(zhǎng)出后，根據(jù)菌落的生長(zhǎng)特征進(jìn)行分離純化。挑出平板培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落，用接種針將其接種于適合生長(zhǎng)的培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，反復(fù)接種分離2～3 次直至得到純的菌株，至恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，記錄編號(hào)后于4 ℃保存。

1.3.3 菌株DNA的提取

取50 μL滅菌的樹脂于八連管，用滅菌的牙簽挑取極少部分上述分離純化的單菌落在裝有樹脂的八連管中研磨，金屬浴10 min后離心10 min取上清液制得模板DNA以備用。

1.3.4 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

細(xì)菌PCR擴(kuò)增引物：27F（5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）。真菌PCR擴(kuò)增引物：ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。PCR體系（25 μL）：模板DNA 0.5 μL，mix酶12.5 μL，引物A 0.5 μL，引物B 0.5 μL,無(wú)菌水11 μL。細(xì)菌PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸8 min。真菌PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸8 min。

1.3.5 BLAST比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析

將PCR產(chǎn)物送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序后的結(jié)果在NCBI上用BLAST軟件序列比對(duì)，初步確定所分離菌株的種屬，并將測(cè)得的序列與已登錄的該屬其他標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 六堡茶渥堆過(guò)程中的細(xì)菌種類及其作用

2.1.1 細(xì)菌和放線菌的分子學(xué)鑒定

將六堡茶中分離出的細(xì)菌和放線菌進(jìn)行DNA 序列分析，分子鑒定結(jié)果顯示序列相似度超過(guò) 97%，分別如表1、2所示，根據(jù)16S rDNA序列鑒定用Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分離出的菌株可以確定為細(xì)菌13 個(gè)屬、27 個(gè)種，放線菌7 個(gè)屬、8 個(gè)種。系統(tǒng)發(fā)育樹分別如圖1、2所示。分離到的微生物，大多都是芽孢桿菌屬、地芽孢桿菌屬、考克氏菌屬、乳桿菌屬、葡萄球菌屬等。

表1 細(xì)菌的16S rDNA分子鑒定Table 1 Molecular identification of bacteria from Liupao tea by 16S rDNA sequence

表2 放線菌的16S rDNA分子鑒定Table 2 Molecular identification of actinomycetes from Liupao tea by 16S rDNA sequence

圖1 從六堡茶中分離的細(xì)菌與BLAST比對(duì)結(jié)果的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Phylogenetic tree constructed for bacteria isolated from Liupao tea using basic local alignment search tool (BLAST) results

圖2 從六堡茶中分離的放線菌與BLAST比對(duì)結(jié)果的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree constructed for actinomycetes isolated from Liupao tea based on BLAST results

2.1.2 細(xì)菌和放線菌的分布情況

由表3、4可知，六堡茶渥堆過(guò)程中各階段、各層級(jí)之間的菌落結(jié)構(gòu)不盡相同。芽孢桿菌屬在毛茶及渥堆階段的樣品中均存在，且分離所得數(shù)量最多；其次是地芽孢桿菌，但僅在渥堆前期茶堆內(nèi)部樣品且高溫培養(yǎng)條件下得到；再次之是葡萄球菌屬，在渥堆前期、后期及末期均有檢出；考克氏菌屬在各渥堆階段的樣品中均存在，分離所得數(shù)量較多。同時(shí)，在渥堆末期分離鑒定到4 株戊糖乳桿菌。毛茶中僅分離到高地芽孢桿菌，渥堆前期和末期的菌落結(jié)構(gòu)較渥堆中期及后期復(fù)雜，渥堆前期以芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬以及地芽孢桿菌屬等為優(yōu)勢(shì)菌，渥堆末期以葡萄球菌屬、考克氏菌屬等為優(yōu)勢(shì)菌。

表3 六堡茶渥堆過(guò)程中細(xì)菌分布情況Table 3 Distribution of bacteria in the fermentation process of Liupao tea

表4 六堡茶渥堆過(guò)程中放線菌的分布情況Table 4 Distribution of actinomycetes in the fermentation process of Liupao tea

2.2 六堡茶渥堆過(guò)程中的真菌種類及其作用

2.2.1 真菌的形態(tài)學(xué)觀察與分子學(xué)鑒定

運(yùn)用可培養(yǎng)方法從渥堆過(guò)程的六堡茶中分離出種類較為豐富的霉菌菌株，將分離純化得到的菌株接種于CA和CYA培養(yǎng)基上，進(jìn)行形態(tài)觀察，部分霉菌菌落的形態(tài)特征如表5所示，參照《真菌鑒定手冊(cè)》和《中國(guó)真菌志》對(duì)菌株進(jìn)行觀察，結(jié)合表6以及系統(tǒng)發(fā)育樹的分子鑒定結(jié)果得到的20 種真菌分別為橘青霉、草酸青霉、、、微小根毛霉、、黑曲霉、塔賓曲霉、高滲曲霉、冠突曲霉、、聚多曲霉、雜色曲霉、煙曲霉、unknown_p_Ascomycota、、球孢枝孢、芽枝狀枝孢、傘狀毛霉菌、sp.，各菌株的形態(tài)特征如圖3所示。

圖3 菌株在CA培養(yǎng)基和CYA培養(yǎng)基上形態(tài)學(xué)特征Fig. 3 Morphological characteristics of fungal strains grown on CA medium and CYA medium

表5 菌株的形態(tài)特征及初步鑒定Table 5 Morphological characteristics and preliminary identification of fungal strains

根據(jù)表6所示的ITS序列鑒定結(jié)果，用Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖4所示。圖3、4結(jié)果顯示，分子鑒定結(jié)果與形態(tài)分類結(jié)果一致，序列相似度超過(guò)97%。由系統(tǒng)發(fā)育樹可判斷分離出的霉菌菌株的種屬，本研究分離出的真菌可以確定為共11 個(gè)屬、23 個(gè)種，具體見(jiàn)表6。分離到的微生物，大多都是曲霉屬、、青霉屬等。

表6 真菌的ITS序列分子鑒定Table 6 Molecular identification of fungi based on internal transcribed spacer (ITS) sequence

圖4 從六堡茶中分離的真菌與BLAST比對(duì)結(jié)果的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Phylogenetic tree constructed for fungi isolated from Liupao tea based on BLAST results

2.2.2 真菌的分布情況

表7 六堡茶渥堆過(guò)程中真菌的分布情況Table 7 Distribution of fungi in the fermentation process of Liupao tea

在各渥堆階段的樣品中均存在，且分離所得數(shù)量最多；從毛茶到渥堆結(jié)束的樣品中均分離到曲霉屬，分離所得數(shù)量較大，以黑曲霉和塔賓曲霉為主；青霉屬數(shù)量雖不多但在渥堆前期和后期被檢測(cè)到；渥堆前、中、后期均發(fā)現(xiàn)根毛霉屬。由表7可知，毛茶中僅分離到塔賓曲霉，渥堆開始后各階段的菌群結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度相當(dāng)，組成上既有差異也有聯(lián)系，渥堆前期以酵母、曲霉、青霉、根毛霉為優(yōu)勢(shì)菌，酵母、曲霉在中期、后期、末期繼續(xù)保持優(yōu)勢(shì)地位，同時(shí)在后期、末期也出現(xiàn)少量其他種屬的真菌。本研究結(jié)果顯示曲霉屬是六堡茶渥堆過(guò)程中第一優(yōu)勢(shì)真菌，同時(shí)是第二優(yōu)勢(shì)真菌。

3 討 論

通過(guò)可培養(yǎng)方法從渥堆過(guò)程的六堡茶中分離到細(xì)菌13 個(gè)屬、27 個(gè)種，放線菌7 個(gè)屬、8 個(gè)種，真菌11 個(gè)屬、23 個(gè)種。以黑曲霉和塔賓曲霉為主的曲霉屬和在整個(gè)渥堆過(guò)程均保持優(yōu)勢(shì)地位。芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬以及地芽孢桿菌屬等為渥堆前期的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，葡萄球菌屬、考克氏菌屬等為渥堆末期的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。與傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法相比，高通量測(cè)序技術(shù)能夠檢測(cè)到更多的微生物類群，例如六堡茶渥堆過(guò)程中已檢測(cè)到鞘鞍醇單胞菌屬、甲基桿菌屬、、、乳桿菌屬、考克氏菌屬、、、短狀桿菌屬、短桿菌屬、、葡萄球菌屬、等屬水平上的主要細(xì)菌，六堡茶渥堆過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)真菌有曲霉屬（包括黑曲霉、黃曲霉、灰綠曲霉、冠突曲霉）、青霉屬、。本研究分離到的真菌的種屬在屬水平上與以上高通量測(cè)序結(jié)果中的優(yōu)勢(shì)真菌一致，通過(guò)純培養(yǎng)分離到的細(xì)菌的種屬與現(xiàn)有高通量測(cè)序結(jié)果中共同鑒定到的屬有芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、潘多拉菌屬、葡萄球菌屬、鞘鞍醇單胞菌屬、乳桿菌屬、短狀桿菌屬、短桿菌屬、、鏈霉菌屬、考克氏菌屬、檸檬菌屬，但發(fā)現(xiàn)博德特氏菌、類芽孢桿菌屬、、莫拉氏菌屬、地芽孢桿菌屬、異常球菌屬、甲基桿菌屬、是高通量測(cè)序方法沒(méi)有鑒定的屬，因此采用兩種方法相結(jié)合更有利于研究和應(yīng)用。

由本研究結(jié)果可知，渥堆前期以酵母、曲霉、青霉、根毛霉為優(yōu)勢(shì)真菌，酵母、曲霉在中期、后期、末期繼續(xù)保持優(yōu)勢(shì)地位。目前關(guān)于六堡茶渥堆、陳化過(guò)程和成品茶中的微生物分離鑒定結(jié)果已報(bào)道過(guò)41種真菌，本研究分離鑒定到的真菌中有9 種為首次在六堡茶中報(bào)道，即、、、高滲曲霉、、、布蘭克念珠菌、球孢枝孢、sp.。眾所周知曲霉屬是黑茶后發(fā)酵過(guò)程中的主要菌群，數(shù)量龐大，參與茶褐素和其他優(yōu)勢(shì)風(fēng)味物質(zhì)的形成，因其具有豐富的泌酶系統(tǒng)而被廣泛應(yīng)用到工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。但其中有些菌種是重要的發(fā)酵工業(yè)微生物，有些菌種卻是環(huán)境中的致病菌。例如，黑曲霉能夠分泌多種水解酶，促進(jìn)甘味物質(zhì)和多酚類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，還對(duì)黑茶特殊的“陳香”的形成有重要貢獻(xiàn)；塔賓曲霉在普洱茶中被用于生產(chǎn)高含量的茶褐素；聚多曲霉可以降解咖啡因，將其轉(zhuǎn)化為茶堿，減少茶湯苦味；冠突曲霉分泌的各種酶作為高效的生化動(dòng)力促進(jìn)茶葉中相關(guān)物質(zhì)的氧化聚合、轉(zhuǎn)化和分解，使得茶湯顏色紅亮，苦澀味減弱，同時(shí)，該菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物具有調(diào)節(jié)膽固醇代謝、抗腫瘤等保健功能；首次在黑茶中被分離出，曾被報(bào)道從室內(nèi)空氣環(huán)境中分離出，不產(chǎn)生赭曲霉毒素A，通常具有比較好的產(chǎn)酸能力；米曲霉能夠提高綠茶的抗氧化性，因此還用于生產(chǎn)發(fā)酵綠茶。青霉屬被學(xué)者研究證明能夠在普洱茶渥堆發(fā)酵過(guò)程中分泌纖維素酶并對(duì)其甘味物質(zhì)的形成具有顯著促進(jìn)作用。纖維素酶作用于茶葉中的纖維素使之分解成回甘物質(zhì)如單糖、雙糖和寡糖。草酸青霉被證明適合于黑茶發(fā)酵，用其發(fā)酵后的茶樣湯色棕紅、香氣甜濃、味道醇和，安全性高。枝狀枝孢霉在自然界中主要存在于木本植物、土壤中等，根據(jù)已有報(bào)道此菌可高效降解纖維素，是很好的產(chǎn)纖維素酶酶源。球孢枝孢首次在黑茶中被分離出，具有產(chǎn)纖維素的能力，可以水解茶葉基質(zhì)的纖維素。酵母菌在黑茶渥堆過(guò)程中數(shù)量龐大，有助于黑茶內(nèi)含物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，對(duì)其品質(zhì)的形成具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)分離到的優(yōu)勢(shì)酵母為（syn.），它是一種非常規(guī)、非致病性、具有耐熱性和耐滲透性，屬于酵母亞門，被譽(yù)為具有巨大科技潛力的二態(tài)酵母。溫志杰等已證明是六堡茶渥堆發(fā)酵環(huán)節(jié)最主要的優(yōu)勢(shì)酵母菌，其產(chǎn)生的多種胞外酶在高溫條件下表現(xiàn)出高活力，對(duì)茶葉成分轉(zhuǎn)化及風(fēng)味形成起著重要作用。幾乎所有陳年普洱茶中都以酵母（spp.）為主，且酵母有助于改善在普洱茶發(fā)酵和陳釀過(guò)程中形成的滋味。布蘭克念珠菌為耐高溫酵母，在普洱茶發(fā)酵中期和后期被大量分離到，被認(rèn)為是發(fā)酵過(guò)程的主要菌種之一，能夠明顯促進(jìn)茶多酚轉(zhuǎn)化為茶色素。本研究檢出的微小根毛霉，在黑茶中多次被鑒定為主要的嗜熱真菌。同樣地，也是一種嗜熱真菌，被報(bào)道為普洱茶固態(tài)發(fā)酵中的優(yōu)勢(shì)真菌，具有將茶多酚轉(zhuǎn)化為茶褐素的能力。由渥堆的高溫環(huán)境推測(cè)以上檢出的嗜熱微生物參與了六堡茶渥堆發(fā)酵的過(guò)程，已有研究表明高溫嗜熱菌能夠分泌多種胞外酶，因此菌種鑒定結(jié)果為探明渥堆發(fā)酵過(guò)程中高溫嗜熱菌的種類和變化規(guī)律及其作用機(jī)制，都做出了積極的貢獻(xiàn)。

另外，本研究結(jié)果顯示，渥堆前期以芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬及地芽孢桿菌屬等為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，渥堆末期以葡萄球菌屬、考克氏菌屬等為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。目前關(guān)于六堡茶中的細(xì)菌分離鑒定結(jié)果僅報(bào)道過(guò)渥堆過(guò)程中的14 種嗜熱菌、5 種乳酸菌和鞘氨醇單胞菌，本實(shí)驗(yàn)分離鑒定的細(xì)菌戊糖乳桿菌、嗜熱地芽孢桿菌、副地衣芽孢桿菌、、熱噬地芽孢桿菌外均為首次在六堡茶中分離。芽孢桿菌屬中多數(shù)為有益菌，不僅具有耐酸、耐高溫等特點(diǎn)，還能分泌多酚氧化酶和過(guò)氧化物酶，茶葉中的黃烷醇類及其糖苷類能夠?yàn)槎咛峁┑孜?，而多酚氧化酶?duì)黑茶中茶黃素、茶紅素等物質(zhì)的形成起著關(guān)鍵作用。因此芽孢桿菌可能對(duì)六堡茶茶湯色澤以及功能活性物質(zhì)的形成具有重要意義。特基拉芽孢桿菌作為益生菌能夠利用碳源產(chǎn)生葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖和木糖等胞外多糖。從發(fā)酵的香豆分離出來(lái)，被認(rèn)為參與了香豆香氣化合物的形成。從植物葉組織分離出的漳州芽孢桿菌被證實(shí)會(huì)產(chǎn)生苯酚酸、黃酮類化合物和單寧等具有天然生物活性的酚類化合物，并對(duì)常見(jiàn)致病菌具有抗菌活性。高地芽孢桿菌具有產(chǎn)木聚糖酶的能力，將木聚糖轉(zhuǎn)化為它的組成單糖。北城假單胞菌可以分泌不含纖維素酶的木聚糖酶。葡萄球菌屬耐高溫，兼性厭氧，付潤(rùn)華等用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法得到四川康磚茶中主要細(xì)菌也是芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬?？伎耸暇鷮倌馨l(fā)酵產(chǎn)生木聚糖酶，玫瑰考克氏菌（）被證明具有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)水解能力，可能與茶葉中氨基酸含量的變化有關(guān)，進(jìn)而影響茶湯滋味。短桿菌屬高產(chǎn)膽固醇氧化酶，而膽固醇氧化酶是膽固醇代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶之一，因此，推測(cè)六堡茶醇提物調(diào)節(jié)高血脂作用與其渥堆過(guò)程中含有的大量短桿菌屬有關(guān)。甲基桿菌屬被認(rèn)為是黑茶渥堆過(guò)程中核心功能微生物之一，可能對(duì)六堡茶的品質(zhì)形成具有一定作用。戊糖乳桿菌具有較強(qiáng)的抑制致病菌能力，同時(shí)產(chǎn)酸耐酸較強(qiáng)，此外乳酸菌還能分泌多種胞外酶，對(duì)六堡茶渥堆過(guò)程中微生物生長(zhǎng)環(huán)境如pH值的變化以及六堡茶風(fēng)味品質(zhì)具有一定作用。姚靜等從普洱茶中也檢出了歐文氏菌屬、考克氏菌屬、假單胞桿菌屬、克雷白氏菌屬，但是其對(duì)普洱茶渥堆發(fā)酵的作用需要進(jìn)一步研究。

目前關(guān)于六堡茶加工過(guò)程中放線菌的報(bào)道較少，除外，本研究分離到的放線菌也是第一次在六堡茶中報(bào)道。放線菌具有很強(qiáng)的生物合成能力，能夠合成具有廣泛生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物。能產(chǎn)生多種糖苷酶，最適生長(zhǎng)溫度為28 ℃，是一種寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌。淡紫褐鏈霉菌是一種產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶（glucose isomerase，GI）的放線菌，而GI作為胞內(nèi)酶能夠參與進(jìn)入體內(nèi)的木糖的應(yīng)用，作為胞外酶能夠?qū)?葡萄糖轉(zhuǎn)化為-果糖，被大量應(yīng)用于高果糖漿的工業(yè)生產(chǎn)中。本研究通過(guò)ITS和16S rDNA序列分析發(fā)現(xiàn)了在以往黑茶和六堡茶研究中尚鮮見(jiàn)報(bào)道的一定數(shù)量的新種。由鑒定結(jié)果可以從微生物學(xué)角度說(shuō)明六堡茶是有效利用微生物作用的優(yōu)良發(fā)酵食品，深入研究和挖掘這些新種在微生物分類學(xué)和發(fā)酵六堡茶微生物資源的保護(hù)方面具有積極意義。