熒光光譜法探究pH值對(duì)葉黃素與牛血清白蛋白相互作用的影響

范金波，康 柱，張 炎，蘇冬雨，周素珍，呂長(zhǎng)鑫

（渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013）

牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）是人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）的同源蛋白，由3 個(gè)結(jié)構(gòu)同源的螺旋結(jié)構(gòu)域（I、II和III）組成，每個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)域都包含2 個(gè)亞結(jié)構(gòu)域（A和B），并且位于白蛋白上藥物結(jié)合位點(diǎn)的主要區(qū)域在IIA和IIIA子域的疏水腔中。BSA螺旋結(jié)構(gòu)相對(duì)于其他蛋白質(zhì)比較薄弱，與其他物質(zhì)的連接位置容易更改，所以BSA能夠與脂溶性或水溶性物質(zhì)發(fā)生結(jié)合作用。由于BSA相對(duì)HSA易提取，成本較低，可作為載體攜帶小分子作用于相應(yīng)部位，發(fā)生相應(yīng)的活性作用，因此研究BSA與小分子結(jié)合對(duì)小分子的活性保護(hù)和靶向傳遞有著重要意義。

類胡蘿卜素廣泛存在于植物中，種類多樣，具有抗癌、抗炎、抗氧化、抑菌、抑血栓等多種活性作用。其中，葉黃素是人體視網(wǎng)膜黃斑的組成成分，具有保護(hù)視網(wǎng)膜和預(yù)防心血管疾病的作用。然而因葉黃素穩(wěn)定性差，易受光、氧、熱等環(huán)境因素的影響，以及水溶性較差的特點(diǎn)，導(dǎo)致其生物利用度低，限制了其應(yīng)用。因此，通過蛋白基載體實(shí)現(xiàn)葉黃素的保護(hù)和靶向遞送已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。

目前，藥物、生物活性小分子等與BSA或HSA相互作用的研究較為普遍，但在不同pH值條件下，葉黃素與BSA的相互作用鮮見報(bào)道，亟待深入研究。通過熒光光譜法及分子對(duì)接技術(shù)研究不同pH值（7.4、5.2、3.0）對(duì)葉黃素-BSA相互作用的影響，對(duì)于BSA蛋白基載體的開發(fā)及活性成分的保護(hù)都具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BSA（98%） 北京百靈威科技有限公司；葉黃素（98%）、布洛芬（ibuprofen，IBUP，98%）、華法林（warfarin，WARF，98%） 生工生物工程（上海）有限公司；其他實(shí)驗(yàn)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

F-7000熒光分光光度計(jì) 日本日立高新技術(shù)公司；GL124-1SCN電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；HY-2旋渦混勻儀、PHS-25 pH計(jì) 儀電科學(xué)儀器（上海）股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 儲(chǔ)備液的配制

配制0.2 mol/L的pH 7.4、5.2、3.0磷酸緩沖液，并配制1.2×10mol/L的BSA儲(chǔ)備液，以及7.2×10mol/L葉黃素、IBUP、WARF儲(chǔ)備液。

1.3.2 葉黃素與BSA相互作用的熒光光譜測(cè)定

熒光發(fā)射光譜：向離心管中加入一定量的磷酸緩沖液，再加入1.2×10mol/L BSA溶液30 μL，最后加入葉黃素溶液，最終離心管中溶液總體積為3 mL，使之充分反應(yīng)30 min。分別在298 K和310 K溫度下，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為290～450 nm，以700 nm/min的掃描速率進(jìn)行熒光發(fā)射光譜的測(cè)定。

同步熒光光譜：在298 K溫度下，固定和的波長(zhǎng)間隔分別為Δ=60 nm和Δ=15 nm，分別測(cè)定樣品在250～350 nm的同步熒光光譜并記錄。

1.3.3 葉黃素與BSA的結(jié)合位點(diǎn)

參照1.3.2節(jié)方法，在加入葉黃素溶液前，先加入7.2×10mol/L WARF/IBUP溶液25 μL，使其混勻充分反應(yīng)20 min，再加入葉黃素溶液，后續(xù)操作同1.3.2節(jié)，并設(shè)置對(duì)照組。

1.3.4 分子對(duì)接

運(yùn)用Autodock Vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接。在RCSB PDB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中選取BSA（ID∶4OR0）的3D結(jié)構(gòu)，保留A鏈并去除結(jié)構(gòu)中的水分子，添加H原子；PubChem數(shù)據(jù)庫中選取葉黃素（CID:5281243）的3D結(jié)構(gòu)。設(shè)置對(duì)接區(qū)域以覆蓋受體分子的大部分，BSA設(shè)為剛性對(duì)接，葉黃素設(shè)為柔性對(duì)接，其他參數(shù)設(shè)置保持默認(rèn)。從結(jié)果中選擇結(jié)合能最低的對(duì)接構(gòu)象，利用Discovery Studio 2017 R2和Pymol軟件進(jìn)行作圖分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 葉黃素與BSA相互作用的熒光光譜分析

如圖1所示，298 K、不同pH值條件下，葉黃素對(duì)BSA均產(chǎn)生熒光猝滅現(xiàn)象，且熒光強(qiáng)度隨著葉黃素濃度的升高而逐漸降低。pH 7.4～3.0時(shí)，BSA的熒光強(qiáng)度峰值分別降低了43%、46%和39%。當(dāng)pH 7.4時(shí)，最大發(fā)射波長(zhǎng)（）在340 nm處，沒有發(fā)生明顯的位移；pH 5.2時(shí)，發(fā)生微弱藍(lán)移（339～337 nm）；pH 3.0時(shí)，發(fā)生紅移（325～329 nm）。這可能是因?yàn)閜H值使葉黃素與BSA相互作用的微環(huán)境發(fā)生了變化。由圖1D可知，隨著葉黃素濃度的增大，猝滅率逐漸增大。pH 5.2的猝滅率最高，pH 7.4和pH 3.0的猝滅率相差不大。

圖1 298 K條件下pH值對(duì)葉黃素與BSA結(jié)合影響的熒光光譜Fig. 1 Fluorescence spectra of lutein-BSA complex at different pH conditions and 298 K

由圖2可知，在310 K時(shí)，不同pH值條件下葉黃素對(duì)BSA均產(chǎn)生熒光猝滅作用。當(dāng)pH 7.4、5.2和3.0時(shí)，BSA的熒光強(qiáng)度峰值分別降低了46%、35%和31%。在pH 7.4、5.2和3.0時(shí)，隨著葉黃素濃度的增大，BSA的分別紅移2 nm（338～340 nm）、藍(lán)移2 nm（337～335 nm）、紅移5 nm（324～329 nm）。這說明葉黃素與BSA發(fā)生了相互作用，同時(shí)加之pH值變化的影響，使熒光基團(tuán)附近的微環(huán)境發(fā)生變化。在不同pH值條件下，與298 K相比，均有明顯的位移現(xiàn)象，說明溫度也影響了其相互作用的微環(huán)境。由圖2D可知，在同一葉黃素濃度下，隨著pH值的升高，猝滅率逐漸增大，pH 7.4時(shí)，猝滅率最高，說明pH值影響了葉黃素與BSA的結(jié)合作用。

圖2 310 K條件下pH值對(duì)葉黃素與BSA結(jié)合影響的熒光光譜Fig. 2 Fluorescence spectra of lutein-BSA complex at different pH conditions and 310 K

2.2 熒光猝滅機(jī)理和結(jié)合常數(shù)

通常熒光猝滅用來反映蛋白質(zhì)與活性成分之間的相互作用，熒光猝滅類型有2 種，分別是動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅，2 種方式均可以降低生物大分子的熒光強(qiáng)度。本實(shí)驗(yàn)采用Stern-Volmer方程（1）和Hill方程（2）分析小分子與蛋白的結(jié)合作用和熒光猝滅機(jī)理。

式中：和分別為猝滅劑加入前后熒光體的熒光強(qiáng)度峰值；[]為猝滅劑濃度/（mol/L）；為未加猝滅劑時(shí)熒光體的平均壽命/（10s）；為Stern-Volmer猝滅常數(shù)/（L/mol）；為生物分子猝滅速率常數(shù)/（L/（mol·s））；為表觀結(jié)合常數(shù)/（L/mol）；為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

表1 葉黃素與BSA相互作用的常數(shù)Table 1 Interaction constants between lutein and BSA

由表1可知，在相同pH值條件下，隨溫度的升高呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，且均大于2×10L/（mol?s）（生物分子的最大散射碰撞猝滅常數(shù)），說明葉黃素對(duì)BSA產(chǎn)生的熒光猝滅類型為靜態(tài)猝滅；在相同溫度條件下，也受pH值變化的影響，隨著pH值的增加而上升，當(dāng)pH 7.4時(shí)，最大，與圖2D的結(jié)果相互驗(yàn)證。在2 個(gè)溫度下，均在1左右，表明BSA提供一個(gè)位點(diǎn)與葉黃素結(jié)合。血清白蛋白與藥物的結(jié)合常數(shù)常在10～10L/mol之間，由表1可知，BSA與葉黃素的結(jié)合常數(shù)在10～10L/mol數(shù)量級(jí)，表明葉黃素和BSA的結(jié)合能力較強(qiáng)。的值越接近于1，說明數(shù)據(jù)越精確。

2.3 熱力學(xué)性質(zhì)分析和作用力類型

生物活性小分子與BSA相互作用時(shí)，二者之間主要由疏水相互作用、靜電相互作用、范德華力和氫鍵等維持。當(dāng)溫度不變或溫差較小時(shí)，Δ可認(rèn)為是定值或常數(shù)。通過Van’ t Hoff方程（3）和方程（4）計(jì)算相關(guān)參數(shù)，分析其作用力。

式中：、對(duì)應(yīng)（298 K）、（310 K）時(shí)葉黃素與BSA的結(jié)合常數(shù)；Δ為吉布斯自由能變化/（kJ/mol）；Δ為熵變/（J/（mol·K））；Δ為焓變/（kJ/mol）；R為氣體常數(shù)，8.314 J/（mol·K）。

表2 葉黃素與BSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)Table 2 Thermodynamic constants of interaction between lutein and BSA

對(duì)于熱力學(xué)常數(shù)與相互作用力的關(guān)系，一般認(rèn)為，當(dāng)Δ＜0或Δ≈0，Δ＞0，靜電相互作用作為結(jié)合的主要驅(qū)動(dòng)力；Δ＞0，Δ＜0時(shí)，通過靜電和疏水相互作用結(jié)合；Δ＜0，Δ＜0時(shí)，結(jié)合的主要驅(qū)動(dòng)力是氫鍵與范德華力；Δ＞0，Δ＞0時(shí)，結(jié)合的主要作用力為疏水相互作用。由表2可知，葉黃素與BSA結(jié)合時(shí)，Δ＞0，Δ＞0，Δ＜0，說明該相互作用，是熵增加、吉布斯自由能升高的吸熱過程，主要作用力是疏水相互作用。在3 種不同pH值條件下，熱力學(xué)常數(shù)的方向沒有發(fā)生變化，說明pH值對(duì)二者間的相互作用力和反應(yīng)類型沒有影響。

2.4 同步熒光光譜的測(cè)定

由于蛋白質(zhì)中含有對(duì)微環(huán)境敏感的氨基酸，這些氨基酸具有特定的熒光吸收峰，而同步熒光具有選擇性高的特點(diǎn)，故同步熒光光譜常用來評(píng)價(jià)活性小分子結(jié)合作用引起的蛋白質(zhì)微環(huán)境的變化。本實(shí)驗(yàn)通過同步熒光光譜，判斷葉黃素對(duì)BSA構(gòu)象的改變。同步熒光光譜中，Δ=15 nm和Δ=60 nm分別反映酪氨酸（Tyr）殘基和色氨酸（Trp）殘基的特征光譜。

如圖3所示，298 K，當(dāng)Δ=15 nm時(shí)，Tyr殘基的熒光強(qiáng)度依次減弱，在pH 5.2和pH 7.4條件下，對(duì)應(yīng)氨基酸殘基的略微紅移1 nm，pH 3.0時(shí)未發(fā)生變化；當(dāng)Δ=60 nm時(shí)，在3 個(gè)pH值條件下，Trp殘基的均略微紅移1 nm。隨著pH值的逐漸增大，Trp殘基的熒光強(qiáng)度下降更為明顯。由此可以推測(cè)，葉黃素與BSA的結(jié)合位點(diǎn)在Trp殘基附近，且葉黃素的加入和pH值的影響共同改變了BSA構(gòu)象。

圖3 298 K條件下pH 3.0（A）、5.2（B）和7.4（C）時(shí)葉黃素與BSA相互作用的同步熒光光譜Fig. 3 Synchronous fluorescence spectra of interaction between lutein and BSA at pH 3.0 (A), 5.2 (B), and 7.4 (C) and 298 K

2.5 葉黃素與牛血清白蛋白結(jié)合位點(diǎn)分析

BSA的亞結(jié)構(gòu)域IIA（Sudlow’s site I）和亞結(jié)構(gòu)域IIIA（Sudlow’s site II）分別是WARF和IBUP的特異性結(jié)合位點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)將IBUP和WARF作為位點(diǎn)Marker，通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)，比較猝滅率的變化判斷葉黃素與BSA的結(jié)合位點(diǎn)。

由圖4A、B可知，pH 7.4和pH 5.2時(shí)，WARF和IBUP的加入，均影響了葉黃素與BSA的相互作用，使得熒光猝滅率下降；但I(xiàn)BUP的加入對(duì)葉黃素對(duì)BSA的熒光猝滅現(xiàn)象更顯著，進(jìn)而可推測(cè)出葉黃素與BSA的結(jié)合位點(diǎn)位于亞結(jié)構(gòu)域IIA和IIIA之間，但更接近于亞結(jié)構(gòu)域IIIA，即Sudlow’s site II附近。

由圖4C可知，pH 3.0時(shí)，WARF和IBUP的存在對(duì)葉黃素與BSA的熒光猝滅現(xiàn)象沒有顯著影響，結(jié)合位點(diǎn)既不在亞結(jié)構(gòu)域IIA附近，也不在亞結(jié)構(gòu)域IIIA附近。說明pH值影響了葉黃素與BSA的結(jié)合，pH值不同結(jié)合位點(diǎn)也不同。

圖4 298 K條件下pH 7.4（A）、5.2（B）和3.0（C）時(shí)IBUP和WARF對(duì)葉黃素與BSA結(jié)合的影響Fig. 4 Effect of IBUP and WARF on the interaction between lutein and BSA at pH 7.4 (A), 5.2 (B), and 3.0 (C) and 298 K

2.6 分子對(duì)接

分子模擬是研究葉黃素與BSA等生物大分子結(jié)合位點(diǎn)的有效方法。通Autodock Vina軟件研究葉黃素和BSA的分子對(duì)接，最佳構(gòu)象Δ=－33 kJ/mol，和熒光結(jié)果相差不大。由圖5可知，葉黃素與BSA的結(jié)合位點(diǎn)位于亞結(jié)構(gòu)域IIA和IIIA之間。此外葉黃素與BSA間的相互作用力以疏水相互作用為主（主要為L(zhǎng)eu259、Leu237、Lys187、Arg435等氨基酸殘基形成），其次還有少許氫鍵（主要為Arg256、Ser286、Ala260等氨基酸殘基形成）和靜電相互作用（主要為Tyr149、His241等氨基酸殘基形成）（表3）。這與位點(diǎn)Marker實(shí)驗(yàn)和熱力學(xué)性質(zhì)分析的結(jié)果一致。

圖5 葉黃素與BSA的可能結(jié)合位點(diǎn)、氨基酸殘基和作用力Fig. 5 Possible binding sites, amino acid residues and interaction forces of lutein and BSA

表3 葉黃素與BSA相互作用的結(jié)合位點(diǎn)氨基酸殘基，作用力及吉布斯自由能Table 3 Amino acid residues, binding force and Gibbs free energy of the interaction between lutein and BSA

3 結(jié) 論

采用熒光光譜法，研究在pH 7.4、5.2、3.0條件下葉黃素與BSA的相互作用。結(jié)果表明，在3 種pH值條件下，葉黃素對(duì)BSA均產(chǎn)生熒光猝滅效應(yīng)。通過熒光猝滅機(jī)理分析，該猝滅類型屬于靜態(tài)猝滅，且在pH 7.4時(shí)，猝滅效應(yīng)最為明顯，同時(shí)結(jié)合常數(shù)達(dá)到10數(shù)量級(jí)，由此說明在生理?xiàng)l件下葉黃素與BSA更易結(jié)合；經(jīng)熱力學(xué)分析可知，二者結(jié)合作用力主要是疏水相互作用；同步熒光結(jié)果表明，葉黃素的加入和pH值的影響共同改變了BSA的構(gòu)象；位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)和分子對(duì)接技術(shù)結(jié)果顯示，葉黃素與BSA的結(jié)合位點(diǎn)受pH值的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pH值的變化影響了葉黃素與BSA的結(jié)合，且pH值的增加促進(jìn)了二者的結(jié)合，這對(duì)于在分子水平上認(rèn)識(shí)葉黃素與BSA相互作用的機(jī)理，以及BSA蛋白基載體的開發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。