環(huán)境因素對β-胡蘿卜素復合納米粒子穩(wěn)定性的影響

郭 靜，孫曉琳，潘思軼

（華中農業(yè)大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070）

-胡蘿卜素是一類重要的類胡蘿卜素，是一種親脂性天然色素，廣泛存在于自然界并具有抗氧化、抗癌、提高免疫力等生理功能。但-胡蘿卜素的穩(wěn)定性較差，在加工貯藏時極易受到光照、高溫、pH值等因素影響導致其發(fā)生化學降解，同時，由于-胡蘿卜素具有高度親脂性，在水溶液中溶解度較低，這都限制了其在食品、醫(yī)藥工業(yè)中的應用。

克服這些限制的有效方法之一是通過遞送載體包封-胡蘿卜素。近年來，生物聚合物納米顆粒因其良好的生物相容性、低免疫原性、無毒性和生物可降解性的優(yōu)點，受到了人們的關注。天然存在的蛋白質和多糖是包封親脂性活性物質的重要材料。蛋白質-多糖復合物可以提高親脂性活性物質的穩(wěn)定性和溶解性。但蛋白質-多糖復合物在遞送活性物質時仍存在一定的局限性，例如穩(wěn)定性較差、生物利用率較低等問題。之前的研究表明，食品級表面活性劑如吐溫80、鼠李糖脂、茶皂素等，可以通過靜電作用、疏水相互作用與生物聚合物結合形成保護涂層，從而提高親脂性活性物質的化學穩(wěn)定性，延緩其在體外消化過程中的釋放。Guo Qing等的研究結果表明，加入表面活性劑后，豌豆分離蛋白-高甲氧基果膠-表面活性劑（鼠李糖脂、茶皂素和月桂酰精氨酸乙酯）可以包封白藜蘆醇，在體外消化過程中可以延緩白藜蘆醇的光降解和熱降解，且三元復合物中白藜蘆醇的釋放率低于二元復合物。

玉米醇溶蛋白獨特的氨基酸組成使其成為兩親性蛋白質，并具有良好的成膜性和阻隔性，因此在活性物質和風味物質的包埋遞送中應用廣泛。海藻酸丙二醇酯（propylene glycol alginate，PGA）是海藻酸和環(huán)氧丙烷通過酯化反應生成的海藻酸衍生物，是一種可以與蛋白質結合的、具有表面活性的食品級多糖。卵磷脂是一種天然小分子表面活性劑，由脂肪酸和磷酸酯基酯化的甘油骨架組成，具有兩親性，因此具有良好的乳化性能，可以用作食品乳化劑。

因此，本研究采用反溶劑沉淀法制備玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA三元復合物實現對-胡蘿卜素的包埋，并重點考察環(huán)境因素（溫度、pH值、光照）對-胡蘿卜素納米粒子分散體系穩(wěn)定性的影響，以期為-胡蘿卜素的進一步加工及長期貯存提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

-胡蘿卜素（生物試劑，97%）、玉米醇溶蛋白、大豆卵磷脂（≥90%） 上海源葉生物科技有限公司；PGA 河南萬邦化工科技有限公司；無水乙醇、正己烷、氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Malvern Nano ZS納米粒度電位分析儀 英國馬爾文公司；UV-1800紫外分光光度計 日本島津公司；UltraScan VIS色差儀 美國HunterLab公司。

1.3 方法

1.3.1-胡蘿卜素納米顆粒的制備

根據Wei Yang和Dai Lei等的方法制備-胡蘿卜素復合納米顆粒，并進行修改。稱取25 mg玉米醇溶蛋白、50 mg卵磷脂和12.5 mg PGA置于燒杯中，加入20 mL 90%乙醇溶液，在室溫下密封避光磁力攪拌2 h至完全溶解，再稱取一定量的-胡蘿卜素置于燒杯中，分別達到1∶1、1∶3、1∶5、1∶10和1∶25的質量比（-胡蘿卜素比玉米醇溶蛋白），加入20 mL 90%乙醇溶液，在室溫下密封避光磁力攪拌2 h至完全溶解。使用注射器將40 mL上述混合物緩慢注入60 mL蒸餾水中，將所得體系在室溫下連續(xù)攪拌30 min。制得的溶液在35 ℃下旋轉蒸發(fā)除去體系中的乙醇。制得的溶液在2 000 r/min離心10 min以去除不溶性雜質。將部分最終分散液貯存在4 ℃下進行進一步分析，并將另一部分冷凍干燥以獲得粉末。為進行比較，使用與上述相同的方法制備玉米醇溶蛋白/-胡蘿卜素納米顆粒、玉米醇溶蛋白-卵磷脂/-胡蘿卜素和玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA/-胡蘿卜素納米顆粒。

1.3.2 納米顆粒粒徑及電位的測定

取一定量樣品用去離子水稀釋10 倍后用納米粒度電位分析儀測定樣品的粒徑及電位。測定條件：材料折射率1.590，分散介質水折射率1.330，溫度25 ℃。實驗平行測定3 次。

1.3.3 包封率的測定

標準曲線的繪制：配制不同質量濃度梯度的-胡蘿卜素標準液，使用紫外分光光度計在波長456 nm處測定吸光度，制定-胡蘿卜素標準曲線。采用吸光度-質量濃度繪制線性關系圖，得出校正曲線=0.217 9－0.047，相關系數大于0.99。

包封率的測定：參考吳曉琳等的方法并加以修改。取1 mL樣品和3 mL正己烷渦旋60 s，在5 000 r/min離心10 min，取上清液于10 mL棕色容量瓶中，重復3 次合并上清液后定容，使用紫外分光光度計在波長456 nm處測定吸光度。包封率按式（1）計算：

式中：為-胡蘿卜素總質量/mg；為游離的-胡蘿卜素質量/mg。

1.3.4 透射電鏡觀察

利用透射電鏡觀察-胡蘿卜素納米粒的顯微形態(tài)，吸取少量樣品滴加至銅網上，于通風處自然干燥，滴加少量磷鎢酸負染，自然干燥后置于透射電鏡下觀察微觀形態(tài)并拍照，加速電壓為100 kV。

1.3.5 分散體系凍干后的溶解性

稱取2 mg凍干樣品于燒杯中，加入20 mL去離子水，測定樣品在波長456 nm處吸光度。之后每10 min測定一次樣品在波長456 nm處吸光度，直至吸光度達到最大且不再上升。實驗平行測定3 次。

1.3.6 分散體系凍干后的重分散性

稱取5 mg的凍干樣品于燒杯中，加入15 mL去離子水，在室溫下磁力攪拌2 h至完全溶解，測定樣品的粒徑、電位及多分散指數（polydispersity index，PDI）。實驗平行測定3 次。

1.3.7 色差的測定

取一定量樣品裝入石英比色皿中，用色差儀測定樣品的亮度*、紅值*、黃值*，色差儀使用前用白色校正板進行校正。實驗平行測定3 次。通過計算總體色差（Δ*）作為評價體系顏色變化的指標，而色差中的黃值（*）可以定性表示-胡蘿卜素的降解程度?？傮w色差按式（2）計算：

1.3.8 溫度在貯藏過程中對體系穩(wěn)定性的影響

將新制備的玉米醇溶蛋白/-胡蘿卜素納米顆粒、玉米醇溶蛋白-卵磷脂/-胡蘿卜素納米顆粒、玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA/-胡蘿卜素納米顆粒分裝與試劑瓶中，分別置于4、25、37 ℃下避光貯藏7 d，每天定時取樣，測定樣品的平均粒徑、Zeta電位、色度和吸光度。實驗平行測定3 次。

1.3.9 pH值對體系穩(wěn)定性的影響

將新制備的玉米醇溶蛋白/-胡蘿卜素納米顆粒、玉米醇溶蛋白-卵磷脂/-胡蘿卜素納米顆粒、玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA/-胡蘿卜素納米顆粒分裝與試劑瓶中，用NaOH溶液和HCl溶液將體系pH值分別調節(jié)為3、4、5、6、7、8，室溫下避光放置24 h，測定樣品的平均粒徑、Zeta電位、色度和吸光度。實驗平行測定3 次。

1.3.10 光照對體系穩(wěn)定性的影響

將新制備的玉米醇溶蛋白/-胡蘿卜素納米顆粒、玉米醇溶蛋白-卵磷脂/-胡蘿卜素納米顆粒、玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA/-胡蘿卜素納米顆粒分裝與試劑瓶中，用紫外燈在室溫下照射4 h，每隔1 h取樣，測定樣品的平均粒徑、Zeta電位、色度和吸光度。實驗平行測定3 次。

1.4 數據統(tǒng)計分析

為保證實驗結果準確，減小誤差，所有實驗均進行3 次平行并采用平均值，使用SPSS進行方差分析，＜0.05，差異顯著，并使用Origin 8.5作圖。

2 結果與分析

2.1 玉米醇溶蛋白對β-胡蘿卜素包封性能

包封率是評價生物活性物質包埋效果的重要指標。如圖1所示，當-胡蘿卜素和玉米醇溶蛋白的比例為1∶1時，玉米醇溶蛋白無法負載過量的-胡蘿卜素，此時大量-胡蘿卜素游離在分散體系外。當-胡蘿卜素與玉米醇溶蛋白的質量比從1∶1變?yōu)?∶3時，包封率從84.62%顯著增加到93.64%（＜0.05）。結果表明，當-胡蘿卜素與玉米醇溶蛋白的質量比為1∶3時，包封效果最好。包封率高是因為玉米醇溶蛋白可以包封疏水性-胡蘿卜素，加入表面活性劑卵磷脂可以與游離-胡蘿卜素形成復合物，從而改善其包封率。PGA也可以促進-胡蘿卜素在復合物中的滲入。這與Sun Cuixia等的結果一致，PGA還可以改善玉米醇溶蛋白納米顆粒中槲皮素的包封率。隨著-胡蘿卜素和玉米醇溶蛋白比例逐漸減小，包封率降到82.87%，這是因為少量的-胡蘿卜素與過量的玉米醇溶蛋白中豐富的脯氨酸結合不完全。因此選擇-胡蘿卜素和玉米醇溶蛋白的比例為1∶3進行后續(xù)實驗。

圖1 β-胡蘿卜素與玉米醇溶蛋白比例對納米顆粒分散體系包封率的影響Fig. 1 Effect of the ratio of β-carotene to zein on the encapsulation efficiency of nanoparticle dispersion systems

2.2 β-胡蘿卜素納米顆粒分析結果

表1 載β-胡蘿卜素納米顆粒的基本指標Table 1 Properties of nanoparticles loaded with β-carotene

平均粒徑是評價納米顆粒包埋的一個重要指標，與納米顆粒的分布、包埋物質的黏度、表面積和其他物理化學性質的變化有關。Zeta電位是評價納米顆粒表面帶電荷的常用指標，它可以決定懸浮液、大分子或材料表面的粒子穩(wěn)定性，與膠體系統(tǒng)中的電勢相對應。一般情況下，納米顆粒電位的絕對值越大，其相同電荷之間的斥力越大，納米顆粒越不容易發(fā)生聚集沉淀，納米體系越穩(wěn)定。如表1所示，與玉米醇溶蛋白納米顆粒、玉米醇溶蛋白-卵磷脂二元復合納米顆粒相比，三元復合物具有更高的-胡蘿卜素包封率，包封率可達93.63%。玉米醇溶蛋白-卵磷脂/-胡蘿卜素納米顆粒粒徑為134.1 nm，顯著低于玉米醇溶蛋白/-胡蘿卜素納米顆粒的粒徑（406.1 nm），這可能因為玉米醇溶蛋白和卵磷脂在一定水平下可以形成緊湊的結構，從而減小納米顆粒的尺寸，這結果與Jiao Yan等的研究結果一樣。玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA/-胡蘿卜素納米顆粒粒徑為113.5 nm低于玉米醇溶蛋白-卵磷脂/-胡蘿卜素納米顆粒的粒徑，推測是因為PGA與玉米醇溶蛋白之間的靜電吸引能促進三元復合物的形成。玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA/-胡蘿卜素納米顆粒（－27.47 mV）和玉米醇溶蛋白-卵磷脂/-胡蘿卜素納米顆粒（－26.87 mV）帶的負電荷顯著多于玉米醇溶蛋白/-胡蘿卜素納米顆粒（－12.30 mV），表明前兩者具有更好的穩(wěn)定性。

2.3 透射電鏡結果

如圖2所示，玉米醇溶蛋白/-胡蘿卜素納米顆粒分布不均勻，有一些顆粒聚集；玉米醇溶蛋白-卵磷脂/-胡蘿卜素納米顆粒和玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA/-胡蘿卜素納米顆粒粒徑分布較勻稱，在水中的分散性較好。另外，從透射電鏡圖中所觀察到的納米粒子粒徑明顯小于使用納米粒度電位分析儀測得的樣品粒徑。這可能是因為粒徑儀測定的是納米粒子的水合粒徑，透射電鏡觀察的是水分蒸發(fā)后樣品的粒徑。

圖2 玉米醇溶蛋白/β-胡蘿卜素（a）、玉米醇溶蛋白-卵磷脂/β-胡蘿卜素（b）和玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA/β-胡蘿卜素（c）的透射電鏡圖Fig. 2 TEM images of zein/β-carotene (a), zein-lecithin/β-carotene (b)and zein-lecithin-PGA/β-carotene (c)

2.4 分散體系凍干后的溶解性

將納米顆粒制成凍干粉末可以較好提升樣品的貯藏期和穩(wěn)定性，便于食品的長期貯藏和運輸，因此凍干粉末的溶解性和重分散性也是評價包埋體系的一個重要指標。本實驗通過測定吸光度考察凍干粉末的溶解性，凍干粉末的溶解量隨時間的延長而增加，溶液濃度不斷增大，吸光度也不斷增大。由圖3可知，納米顆粒在30～50 min內溶解最快，60 min后溶解度基本不變，吸光度達到最大。玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA/-胡蘿卜素凍干粉末吸光度最大，溶解性最好，玉米醇溶蛋白/-胡蘿卜素凍干粉末的溶解性最差，可能是由于玉米醇溶蛋白表面沒有包覆層導致其疏水基團暴露，玉米醇溶蛋白的強疏水性導致其凍干后重分散性較差，這與Ma Mengjie等的研究結果一致。

圖3 3 種納米顆粒凍干后的復溶性Fig. 3 Solubility of freeze-dried samples of three kinds of nanoparticles

2.5 貯藏過程中溫度對體系穩(wěn)定性的影響

2.5.1 溫度在貯藏過程中對納米粒子粒徑的影響

-胡蘿卜素的熱穩(wěn)定性較差，在加工貯藏時容易受到環(huán)境穩(wěn)定影響發(fā)生異構化生產同分異構體，因此考察納米顆粒在不同溫度下貯藏過程中粒徑等指標的變化十分重要。如圖4所示，在4 ℃下貯藏7 d的玉米醇溶蛋白-卵磷脂/-胡蘿卜素和玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA/-胡蘿卜素納米顆粒平均粒徑變化較小，37 ℃下貯藏的納米顆粒平均粒徑變化較大，玉米醇溶蛋白/-胡蘿卜素納米顆粒的平均粒徑從406.1 nm增加到677.9 nm，增加了271 nm，玉米醇溶蛋白-卵磷脂/-胡蘿卜素納米顆粒的平均粒徑從134.1 nm增加到212.0 nm，玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA/-胡蘿卜素納米顆粒的平均粒徑從113.5 nm增加到186.3 nm，玉米醇溶蛋白/-胡蘿卜素納米顆粒的平均粒徑比玉米醇溶蛋白-卵磷脂/-胡蘿卜素和玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA/-胡蘿卜素納米顆粒的平均粒徑增大的多。這可能是由于玉米醇溶蛋白包埋-胡蘿卜素時，玉米醇溶蛋白表面缺少穩(wěn)定劑，疏水作用增強，導致納米顆粒易于聚集沉淀。如圖4可以看出，卵磷脂和PGA的存在使復合納米顆粒的結構更加緊密，并在25 ℃和37 ℃條件下對-胡蘿卜素提供了更好保護，這與Dai Lei和Wei Yang等的結果一致。

圖4 溫度在貯藏過程中對玉米醇溶蛋白/β-胡蘿卜素（a）、玉米醇溶蛋白-卵磷脂/β-胡蘿卜素（b）和玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA/β-胡蘿卜素（c）分散體系粒徑的影響Fig. 4 Effects of temperature on particle size of zein/β-carotene nanoparticles (a), zein-lecithin/β-carotene nanoparticles (b) and zeinlecithin-PGA/β-carotene nanoparticles (c) dispersion systems during storage

2.5.2 貯藏過程中溫度對體系顏色的影響

在貯藏過程中，產品應在一段時間內保持顏色穩(wěn)定，因此顏色也是判斷納米顆粒體系穩(wěn)定性的一個重要指標。在貯藏過程中，樣品顏色逐漸褪去，顏色的降解在一定程度上可以反映-胡蘿卜素的降解。在大多數情況下，隨著貯藏時間的延長，樣品的*值和Δ*值逐漸變大，*值和*值逐漸變小。由圖5可知，在貯藏過程中3 種納米顆粒的Δ*值均隨時間延長不斷增大，*值不斷減小，變化速率隨溫度的升高而增大。且玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA/-胡蘿卜素的分散體系的*值減少最小，說明三元復合物使/-胡蘿卜素降解的最少，體系更加穩(wěn)定。

圖5 溫度在貯藏過程中對納米顆粒分散體系總體的影響Fig. 5 Effects of different temperatures on color parameters of nanoparticle dispersion systems during storage

2.6 pH值對體系穩(wěn)定性的影響

在食品加工領域中，pH值可以調節(jié)食品飲料的口感，因此pH值對體系的影響程度也是考察納米顆粒體系穩(wěn)定性的一個重要指標。本研究通過平均粒徑和Zeta電位的變化評估體系穩(wěn)定性。由圖6a、b可知，玉米醇溶蛋白/-胡蘿卜素在pH 5時粒徑較大，電位絕對值低，這可能是因為該條件與玉米醇溶蛋白的等電點（pH 6.2）接近，此時體系的凈電荷少，蛋白質易發(fā)生聚集沉淀導致平均粒徑較大，這一結果與Ba Chujie等之前的研究結果一致。玉米醇溶蛋白-卵磷脂/-胡蘿卜素納米顆粒在pH 5和pH 6時粒徑較大，電位絕對值較低，但是粒徑仍維持在200 nm以下。玉米醇溶蛋白-卵磷脂/-胡蘿卜素納米顆粒和玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA/-胡蘿卜素納米顆粒的粒徑在pH 3～8之間變化不大，初步判斷具有較好的pH值穩(wěn)定性，但是2 種分散體系分別在pH 6時電位絕對值較低，因此在該pH值條件下長期貯藏時的穩(wěn)定性還有待進一步考察。

由圖6c可知，3 種包埋體系顏色的變化規(guī)律與平均粒徑及Zeta電位的變化規(guī)律基本一致，玉米醇溶蛋白/-胡蘿卜素在pH 5時黃值明顯減小，這可能是因為等電點附近時體系的凈電荷少，導致蛋白質沉淀和-胡蘿卜素的降解。在pH 3～5時，由于體系處于酸性環(huán)境中，-胡蘿卜素易發(fā)生異構化降解，導致*值降低，這與Qian Cheng等的研究結果一致。

圖6 pH值對3 種分散體系平均粒徑（a）、Zeta電位（b）和b*值（c）的影響Fig. 6 Effect of pH on average particle size (a), zeta potential (b) and b* value (c) of three nanoparticle dispersion systems

2.7 光照對體系穩(wěn)定性的影響

-胡蘿卜素的光穩(wěn)定性較差，在加工貯藏過程中極易因為光照發(fā)生降解，因此體系的光穩(wěn)定性是考察納米顆粒穩(wěn)定性的一個重要指標。如圖7a、b所示，在經過4 h紫外照射后，3 種包埋體系的粒徑均稍有增加，玉米醇溶蛋白/-胡蘿卜素分散體系的PDI明顯增大，而玉米醇溶蛋白-卵磷脂/-胡蘿卜素和玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA/-胡蘿卜素分散體系的PDI略微增大。這可能是因為僅使用玉米醇溶蛋白對-胡蘿卜素進行包埋時，由于玉米醇溶蛋白表面沒有包覆層，難以形成空間位阻，在紫外照射后較易發(fā)生分子重組。同時，在沒有卵磷脂和PGA作為穩(wěn)定劑和活性劑時，玉米醇溶蛋白的疏水基團暴露，在疏水作用下納米顆粒極易聚集沉淀，導致平均粒徑和PDI較大。PGA的存在可以進一步保護-胡蘿卜素免受紫外線照射而引起降解，玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA/-胡蘿卜素分散體系的粒徑較小且紫外照射前后PDI均較小。

由圖7c可知，隨著紫外照射時間增加，3 種包埋體系的*值均逐漸減小，說明三者都受到了光照的影響，玉米醇溶蛋白-卵磷脂/-胡蘿卜素分散體系的黃值減小最多，玉米醇溶蛋白/-胡蘿卜素和玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA/-胡蘿卜素分散體系的黃值減小相差不大。這是因為玉米醇溶蛋白分子中的芳香基團和雙鍵具有紫外吸收能力，可以一定程度上的保護-胡蘿卜素。玉米醇溶蛋白-卵磷脂/-胡蘿卜素分散體系保護效果較差的原因可能是因為卵磷脂在紫外照射下易發(fā)生酸敗變質，對紫外線更加敏感，影響了分散體系的穩(wěn)定性。

圖7 紫外照射對3 種分散體系粒徑（a）、PDI（b）及b*值（c）的影響Fig. 7 Effect of UV irradiation on particle size (a), PDI (b) and b*value (c) of three nanoparticle dispersion systems

3 結 論

制備玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA納米顆粒，并研究-胡蘿卜素與玉米醇溶蛋白的質量比對其包封率的影響，得到玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA納米顆粒的最佳包封率為（93.63±0.14）%，平均粒徑為（113.53±1.3） nm，Zeta電位為（－27.47±0.87） mV。還探究玉米醇溶蛋白/-胡蘿卜素納米顆粒、玉米醇溶蛋白-卵磷脂/-胡蘿卜素和玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA/-胡蘿卜素納米顆粒在溫度、時間、pH值和紫外光照等貯藏環(huán)境下的穩(wěn)定性，玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA/-胡蘿卜素納米顆粒在37 ℃下貯藏7 d后及在紫外燈照射4 h后均具有較好的理化性質，平均粒徑在波長250 nm以下，PDI小于0.2，凍干后的納米顆粒具有良好的復溶性和重分散性。這些結果表明，玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA復合納米顆?？梢宰鳛橐环N有效的遞送系統(tǒng)改善-胡蘿卜素的物理穩(wěn)定性。