綿羊Myl3基因啟動(dòng)子區(qū)的克隆、分析及蛋白表達(dá)

張春蘭

（濰坊學(xué)院 生物與海洋學(xué)院，山東 濰坊 261061）

肌球蛋白輕鏈3基因（Myosin light chain3，Myl3）是動(dòng)物體肌肉組織中編碼肌球蛋白的基因之一。研究發(fā)現(xiàn)該基因及其編碼蛋白（MYL3）主要在小鼠[1]和牛[2]的心肌細(xì)胞中表達(dá)，MYL3蛋白C端Ser殘基的磷酸化與心肌收縮有關(guān)[3]，并且發(fā)現(xiàn)該基因突變與心肌的增生有密切關(guān)系[4~6]。

雖然大量研究表明該基因在心肌的分化和發(fā)育中發(fā)揮了重要作用，但是對(duì)其表達(dá)調(diào)控的研究甚少，在羊上還鮮有報(bào)道。前期研究中在綿羊骨骼肌組織中利用5′和3′RACE法克隆得到了該基因的全長(zhǎng)cDNA序列[7]。本試驗(yàn)以獲得的cDNA序列為參考，對(duì)其啟動(dòng)子區(qū)序列進(jìn)行了克隆和分析，并利用Western blotting法對(duì)其編碼蛋白在小尾寒羊各種組織中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，從而為深入研究其功能和調(diào)控機(jī)理建立基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集

試驗(yàn)用小尾寒羊來(lái)自山東魯良優(yōu)質(zhì)肉羊科技示范有限公司。從純種群中選取3只11月齡母羊，宰殺后迅速采取心、肝、肺等組織并立即投入液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 啟動(dòng)子區(qū)的克隆及特征分析

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

將前其獲得的綿羊Myl3的cDNA序列（Genbank登錄號(hào)KJ710703）與NCBI中的預(yù)測(cè)序列加以比對(duì)，查找起始密碼子。以起始密碼子上游序列為參考，以Primer Premier 5和DNAClub軟件設(shè)計(jì)引物（F：5′-ATGTGCCAACCAGAGGAG 3′，R：5′-GAGAAGGAAGCCGAAAGC 3′），并交由上海生物工程有限公司合成。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增及測(cè)序

依照PCR MasterMix試劑盒（TIANGEN，KT201）說(shuō)明書(shū)，以小尾寒羊基因組DNA為模板擴(kuò)增獲得Myl3基因的啟動(dòng)子區(qū)序列，并依照AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN，#0691）說(shuō)明書(shū)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和回收。將陽(yáng)性克隆送于上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，以DNAman7.0軟件查看測(cè)序峰圖及測(cè)序序列。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

將測(cè)序所得序列以CpGislands（http://www.bioinformatics.org/sms2/cpg_islands.html） 和 CpGPlot（https://www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot） 分析其CpG島（設(shè)定參數(shù)值為CG%>50%，Obs/Exp>0.65，序列長(zhǎng)度≥200 bp）； 以 Neural Network Promoter Prediction（http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）預(yù)測(cè)啟動(dòng)子；以McPromote在線(xiàn)工具預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)；提交至http://www.dan.affrc.go.jp/PLACE/分析其潛在的順式作用元件；并以 AliBaba（http://gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html）對(duì)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)加以分析。

1.3 蛋白表達(dá)分析

取小尾寒羊各種組織，以RIPA裂解液（Solarbio，R0010）提取總蛋白后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離。分離條帶經(jīng)電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以兔MYL3多克隆抗體（Proteintech，10913-1-AP）進(jìn)行一抗孵育。然后以山羊抗兔二抗（上海雅酶生物科技有限公司，LF102）孵育后，加入ELC Plus超敏發(fā)光液（Solarbio，PE0010）進(jìn)行顯影和拍照。以GAPDH蛋白的表達(dá)水平為參考，通過(guò)ImageJ軟件分析條帶的灰度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 啟動(dòng)子區(qū)序列

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，該基因啟動(dòng)子區(qū)序列擴(kuò)增條帶單一。該單一條帶經(jīng)克隆測(cè)序，獲得長(zhǎng)為990 bp的序列（圖1）。

圖1 Myl3基因啟動(dòng)子區(qū)的PCR擴(kuò)增

2.2 生物信息學(xué)分析

如圖2所示，該序列有1個(gè)CpG島，位于15～216 bp處；存在1個(gè)基礎(chǔ)啟動(dòng)子，位于803～853 bp處；在其34 bp處有1個(gè)TATA-box；有4個(gè)CAAT-box，分別位于3、308、794和835 bp處；并在536 bp處有1個(gè)GC模序。

圖2 Myl3基因啟動(dòng)子區(qū)的生物信息學(xué)分析

經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，該序列有多種轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。其中結(jié)合位點(diǎn)較多的轉(zhuǎn)錄因子有Sp1、MyoD、NF1、AP1等。

2.3 小尾寒羊不同組織MYL3蛋白表達(dá)差異

如表1和圖3所示，MYL3蛋白分子量約為22KD，主要在小尾寒羊的心肌中表達(dá)，其次為骨骼肌；在脾和卵巢組織中有少量表達(dá)，而在其他組織中均無(wú)表達(dá)。

表1 小尾寒羊各種組織中MYL3蛋白的表達(dá)量（×104）

圖3 MYL3蛋白在小尾寒羊各組織中的表達(dá)

3 討論

典型的真核生物基因啟動(dòng)子主要包括TATA-box、CAAT-box、GC-box等順式作用元件。這些元件在基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程中具有重要的調(diào)控作用。本試驗(yàn)獲得的綿羊Myl3基因啟動(dòng)子區(qū)序列中擁有這些元件，并且具有多個(gè)CAAT-box，說(shuō)明該基因可能具有較高的轉(zhuǎn)錄頻率。但是，由于多數(shù)CAAT-box距離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)較遠(yuǎn)，它們能否增加該基因的轉(zhuǎn)錄頻率還有待于進(jìn)一步研究證明。

真核生物許多管家基因的啟動(dòng)子區(qū)通常存在CpG島。轉(zhuǎn)錄因子Sp1在動(dòng)物體多種組織中均有表達(dá)，并且結(jié)合于許多管家基因的啟動(dòng)子中[8]。本試驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，在該基因啟動(dòng)子區(qū)序列中存在有CpG島，并且含有多個(gè)Sp1轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，說(shuō)明該基因是一個(gè)管家基因，其表達(dá)方式為組成型表達(dá)。

Sp1廣泛參與了細(xì)胞的增殖、分化和調(diào)亡等多種代謝活動(dòng)[8]。在小鼠[8]和大鼠[9]中均發(fā)現(xiàn)Sp1可通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而調(diào)控骨骼肌的生長(zhǎng)。多個(gè)研究表明，MyoD作為一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在骨骼肌中進(jìn)行特異性表達(dá)，對(duì)骨骼肌的生成和分化具有重要的調(diào)控作用[10,11]。本試驗(yàn)在綿羊Myl3的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域發(fā)現(xiàn)有多處Sp1和MyoD轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，從而認(rèn)為Sp1、MyoD和Myl3基因在綿羊骨骼肌的生長(zhǎng)和發(fā)育中具有協(xié)調(diào)的調(diào)控作用。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)綿羊MYL3蛋白分子量約為22kD，這與前期根據(jù)編碼的氨基酸預(yù)測(cè)得到該蛋白分子量為21.961kD相一致[7]。蛋白表達(dá)譜顯示該基因編碼蛋白主要在綿羊的心肌中表達(dá)、其次為背最長(zhǎng)肌，這與在小鼠[1]、牛[2]和豬[12]中的發(fā)現(xiàn)相一致。綜上分析推測(cè)認(rèn)為，綿羊Myl3基因的表達(dá)可能在Sp1、MyoD等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控下對(duì)骨骼肌和心肌組織的生長(zhǎng)和發(fā)育具有重要的調(diào)節(jié)作用。

4 結(jié)論

綿羊Myl3基因啟動(dòng)子區(qū)序列有一個(gè)基礎(chǔ)啟動(dòng)子和一個(gè)CpG島，是一個(gè)管家基因。綿羊MYL3蛋白分子量約為22 kDa，在心肌組織中表達(dá)量最高，其次為骨骼肌。Myl3基因的表達(dá)可能受到Sp1、MyoD等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。