近紅外光驅(qū)動(dòng)的納米光敏劑UCNPs@SiO2@TiO2@MnO2的制備與性能*

曹瀟楠， 胡靜慧， 張敏麗， 王 浩， 靳丹丹，朱良亮， 陳文雪， 宮培軍

(浙江師范大學(xué) 先進(jìn)催化材料教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 金華 321004)

當(dāng)前，癌癥已經(jīng)成為高發(fā)病率、低治愈率的全球性重大疫病，精準(zhǔn)用藥和針對(duì)性治療是提高癌癥治愈率和減輕患者病痛的必由之路.作為一種非入侵性治療技術(shù)，光動(dòng)力療法(photodynamic therapy，PDT)是借助光敏劑在激發(fā)光下產(chǎn)生的活性氧物種(reactive oxygen species，ROS)氧化損傷生物大分子或細(xì)胞器以誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡和壞死.相比手術(shù)、放療和化療等傳統(tǒng)療法，PDT具有作用范圍精準(zhǔn)、安全性高、見(jiàn)效快、適應(yīng)性好等優(yōu)勢(shì)[1-2].然而，卟啉衍生物等臨床有機(jī)光敏劑存在激發(fā)光的穿透能力差、化學(xué)穩(wěn)定性低等缺點(diǎn)，導(dǎo)致PDT目前多用于淺表性癌癥的治療.

TiO2的生物相容性好、毒性低，化學(xué)穩(wěn)定性顯著優(yōu)于有機(jī)光敏劑，具有持久產(chǎn)生ROS的能力，可以將無(wú)機(jī)光敏劑單獨(dú)或與其他材料復(fù)合后使用[3-4].上轉(zhuǎn)換納米粒子(upconversion nanoparticles，UCNPs)具有獨(dú)特的上轉(zhuǎn)換發(fā)光性能，作為能量轉(zhuǎn)換器與光敏劑構(gòu)建成納米光敏劑可用于深組織下腫瘤治療[5-6].當(dāng)這類納米光敏劑富集于腫瘤時(shí)，利用可以穿透深組織的近紅外(NIR)光激發(fā)UCNPs發(fā)射紫外光和可見(jiàn)光，借助這些發(fā)射光激活與UCNPs復(fù)合的光敏劑產(chǎn)生ROS，從而殺滅深組織下的癌細(xì)胞[7-9].研究表明，由TiO2與UCNPs構(gòu)成的納米光敏劑在NIR光下表現(xiàn)出良好的抗腫瘤性能[10-11].然而，很多實(shí)體瘤在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)與正常組織不同的性質(zhì)，包括弱酸性環(huán)境、溶氧量偏低、H2O2濃度偏高等，而PDT極大依賴氧氣濃度，腫瘤乏氧將會(huì)極大制約PDT效果，導(dǎo)致治療不徹底、腫瘤耐藥或轉(zhuǎn)移等后果[12].近年來(lái)，利用MnO2在酸性環(huán)境下催化H2O2分解產(chǎn)生O2和H2O的能力，研究人員設(shè)計(jì)響應(yīng)腫瘤微環(huán)境的MnO2基納米藥物，通過(guò)催化分解內(nèi)源性H2O2提高癌細(xì)胞的溶氧量和ROS產(chǎn)生能力，增強(qiáng)PDT在腫瘤治療中的效果.同時(shí)，MnO2與H2O2的反應(yīng)產(chǎn)物Mn2+具有磁共振成像增強(qiáng)功能，為監(jiān)測(cè)藥物在腫瘤部位的富集和治療進(jìn)程提供影像學(xué)手段[13-15].因此，如果將MnO2，UCNPs和TiO23種功能材料復(fù)合，有望獲得可以借助腫瘤微環(huán)境特征改善腫瘤的溶氧量并增強(qiáng)PDT活力的納米光敏劑[16].然而，MnO2在紫外和可見(jiàn)光區(qū)具有較寬的光學(xué)吸收帶，可能與TiO2競(jìng)爭(zhēng)性吸收UCNPs的上轉(zhuǎn)換發(fā)光，導(dǎo)致光敏劑的ROS產(chǎn)能下降.因此，合理的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和組分配比不僅是提高納米光敏劑ROS產(chǎn)能的關(guān)鍵，也能確保藥物具有體內(nèi)應(yīng)用所必需的均勻形貌和尺寸分布.

考慮到核-殼結(jié)構(gòu)的NaYF4:Yb,Tm@NaGdF4:Yb@SiO2@TiO2納米復(fù)合粒子(UST)在NIR光照射下可以產(chǎn)生多種ROS[17-18]，本研究首先采用吸附法對(duì)UST修飾聚乙烯亞胺(PEI)，隨后利用PEI與KMnO4的反應(yīng)沉積MnO2，制備了可以通過(guò)催化分解H2O2產(chǎn)氧增強(qiáng)ROS產(chǎn)能的NIR光驅(qū)動(dòng)納米光敏劑NaYF4:Yb,Tm@NaGdF4:Yb@SiO2@TiO2-PEI@MnO2(USTM).PEI使KMnO4的還原反應(yīng)發(fā)生在UST粒子表面，生成的負(fù)電性MnO2在正電性PEI的靜電引力下原位沉積在UST表面，通過(guò)控制MnO2的沉積量可以獲得形貌和尺寸均勻的納米光敏劑，也確保TiO2優(yōu)先于MnO2吸收UCNPs的上轉(zhuǎn)換發(fā)光.在表征USTM的形貌、物相和元素構(gòu)成的基礎(chǔ)上，研究了MnO2沉積量對(duì)USTM的光學(xué)性質(zhì)、Zeta電位、粒徑分布、催化分解H2O2產(chǎn)氧，以及產(chǎn)生ROS的性能的影響，并借助自由基捕獲實(shí)驗(yàn)鑒定ROS的類型，分析USTM作為一種潛在的納米光敏劑用于乏氧腫瘤治療的可能性.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試 劑

高錳酸鉀(AR)，北方天醫(yī)化學(xué)試劑公司；支化型聚乙烯亞胺(PEI，99%)，Alfa Aesar化學(xué)有限公司；羅丹明B(RhB)、1,3-二苯基異苯并呋喃(DPBF，97%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；過(guò)氧化氫(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥30%，水溶液)、二水合乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)、叔丁醇、對(duì)苯醌(98%)、乙醇及其他試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

1.2 光敏劑USTM的制備

核-殼結(jié)構(gòu)納米復(fù)合粒子NaYF4:Yb,Tm@NaGdF4:Yb@SiO2@TiO2(UST)的制備方法參考文獻(xiàn)[18].將10 mg UST超聲分散在5 mL 2 mg/mL PEI溶液中，攪拌2 h后離心，用水洗去過(guò)量的PEI，得到PEI修飾的UST(簡(jiǎn)寫(xiě)為UST/PEI)，將粒子分散在5 mL水中，加入227 μL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的KMnO4溶液，攪拌反應(yīng)30 min后超聲30 min，離心并洗滌固體2次，得到納米光敏劑NaYF4:Yb,Tm@NaGdF4:Yb@SiO2@TiO2-PEI@MnO2，記為USTM-1(MnO2的理論質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.25%).調(diào)整KMnO4溶液的體積為455，910，1 820 μL，采用相同方法分別得到MnO2的理論負(fù)載量分別為2.5%，5%，10%的USTM，分別記為USTM-2，USTM-3和USTM-4.

1.3 USTM催化分解H2O2產(chǎn)氧的能力

將5 mg USTM分散在15 mL 10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH=6.5)中，攪拌均勻，用溶解氧測(cè)定儀測(cè)定溶液的初始溶氧量.在攪拌下快速注入H2O2溶液使體系中H2O2的濃度為1 mmol/L，在攪拌下記錄溶液的溶氧量.改變體系中H2O2的濃度至0.1和0.5 mmol/L，測(cè)定對(duì)應(yīng)體系的溶氧量變化.

1.4 USTM產(chǎn)生ROS的測(cè)定

單線態(tài)氧(1O2)產(chǎn)生能力檢測(cè)：將2.5 mg 樣品分散在2.5 mL 水中，加入2.5 mL質(zhì)量濃度為30 mg/L的DPBF的乙醇溶液，避光吸附1 h后用2.1 W/cm2的980 nm近紅外光照射反應(yīng)液，間隔15 min取樣，離心去除粒子，測(cè)試上清液的UV-Vis譜，以DPBF的降解效果評(píng)估光敏劑產(chǎn)生1O2的能力.對(duì)于添加H2O2的反應(yīng)，體系中H2O2的濃度為1 mmol/L，其余條件不變.

1.5 樣品的表征

分別采用D8 Advance型粉末X-射線衍射儀(XRD，德國(guó)Bruker公司)、JEM-2010型透射電子顯微鏡(TEM，日本JOEL公司)和配套能譜儀(EDS)測(cè)定樣品的物相結(jié)構(gòu)、形貌和元素構(gòu)成；借助ESCALAB 250Xi型X射線光電子能譜(XPS，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)分析樣品中Mn，N等元素的氧化態(tài)和化學(xué)環(huán)境；用鹽酸溶解光敏劑并稀釋溶液，借助GGX-810型原子吸收分光光度計(jì)(北京海光儀器公司)測(cè)定樣品中的Mn元素含量；將樣品分散在水中，采用Zetasizer nano ZS90型納米粒度和Zeta電位分析儀(英國(guó)Malvern公司)測(cè)定水力學(xué)粒徑分布(DLS)和Zeta電位；以P4PC型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)測(cè)定樣品吸收光譜(UV-Vis)；以MDL-H-980-3W型980 nm近紅外激光器(長(zhǎng)春新產(chǎn)業(yè)光電技術(shù)有限公司)為激發(fā)光源，使用F-7000型熒光光譜儀(日本Hitachi公司)測(cè)定上轉(zhuǎn)換發(fā)射光譜；使用JPB-607A型溶解氧測(cè)定儀(上海儀電科學(xué)儀器公司)測(cè)定溶液中的溶氧量.

2 結(jié)果與討論

2.1 USTM的表征

圖1為樣品的TEM圖.UCNPs為近似六棱柱狀粒子，在包裹SiO2和TiO2后得到的UST粒子呈現(xiàn)球形且表面相對(duì)平整，UST的核-殼結(jié)構(gòu)性質(zhì)已被相關(guān)研究證實(shí)[19].隨著KMnO4用量從227 μL增加至910 μL，USTM的表面出現(xiàn)小尺寸片狀沉積物且表面粗糙度增大，USTM的平均粒徑由85 nm增大至90 nm，表明盡管MnO2的負(fù)載量呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢(shì)，但其質(zhì)量分?jǐn)?shù)并不大.當(dāng)KMnO4用量達(dá)到1 820 μL時(shí)，USTM-4的粒徑和MnO2包裹層厚度均明顯增大，樣品中出現(xiàn)由MnO2納米片組成的聚集體，意味著生成的MnO2超出了UST表面的可承載能力，導(dǎo)致USTM-4的形貌不均勻.借助原子吸收光譜測(cè)定了USTM中Mn元素的含量，計(jì)算得出上述4個(gè)樣品中MnO2的實(shí)際負(fù)載量分別為0.1%，2.4%，4.4%和11.0%.USTM-3的EDS譜出現(xiàn)F，O，Na，Yb，Gd,Tm，Y，Si，Ti和Mn等元素信號(hào)峰，與目標(biāo)光敏劑的元素構(gòu)成一致，證實(shí)USTM的成功制備.

a:UCNPs;b:UST;c:USTM-1;d:USTM-2;e:USTM-3;f:USTM-4

圖2為USTM的XRD圖.圖中出現(xiàn)六方相NaYF4(JCPDS NO.16-0334)和銳鈦礦相TiO2(JCPDS NO.21-1272)的特征衍射峰，未觀察到MnO2的典型衍射信號(hào)，說(shuō)明MnO2為無(wú)定形結(jié)構(gòu)，與文獻(xiàn)制備的納米MnO2的物相一致[20].此外，圖中無(wú)其他雜質(zhì)的衍射峰，表明MnO2的負(fù)載不會(huì)改變UCNPs和TiO2的物相結(jié)構(gòu).

圖2 USTM的XRD圖

a:全譜圖;b:USTM-3的Mn 2p;c:UST/PEI的N 1s;d:USTM-3的N 1s

2.2 USTM的光學(xué)性質(zhì)

圖4a為光敏劑的UV-Vis譜.USTM在300～700 nm出現(xiàn)MnO2的寬吸收峰，對(duì)應(yīng)于MnO6八面體的配體場(chǎng)中Mn(Ⅳ)的3d電子從低能態(tài)軌道(t2g)向高能量(eg)軌道的d-d躍遷能帶[24].吸收峰的增強(qiáng)表明光敏劑中MnO2負(fù)載量的增大.圖4b為光敏劑在980 nm激發(fā)光下的上轉(zhuǎn)換發(fā)射光譜，USTM在345，362，452和476 nm處發(fā)射峰的位置與UST的發(fā)射譜一致，分別對(duì)應(yīng)于UCNPs中Tm3+的1I6→3F4，1D2→3H6，1D2→3F4和1G4→3H6躍遷[18].隨著MnO2負(fù)載量的增大，USTM的發(fā)光顯著減弱，其中MnO2對(duì)紫外區(qū)發(fā)射光的衰減作用較強(qiáng)，這是由于紫外發(fā)射峰與MnO2的強(qiáng)吸收區(qū)的重疊程度較高，發(fā)生了由UCNPs到MnO2的熒光共振能量轉(zhuǎn)移[17,25].

a:UV-Vis譜;b:上轉(zhuǎn)換發(fā)射光譜

2.3 USTM的Zeta電位與水力學(xué)粒徑

圖5a為樣品的Zeta電位值.PEI改性使UST的Zeta電位由-2.5 mV增大至38.4 mV，UST/PEI表面的強(qiáng)正電性為負(fù)電性MnO2的沉積提供了靜電引力.隨著MnO2沉積量的增大，USTM的Zeta電位從27.3 mV逐漸降至7.9 mV.較高的Zeta電位使粒子之間的靜電排斥力較強(qiáng)，有助于USTM在溶液中穩(wěn)定分散.上述樣品的平均水力學(xué)粒徑(MHD)與多分散系數(shù)(PDI)見(jiàn)圖5b.UST/PEI的MHD為220 nm，PDI為0.081，均略小于UST的對(duì)應(yīng)數(shù)值，表明PEI的強(qiáng)正電性使UST/PEI的分散效果優(yōu)于UST.

a:Zeta電位;b:平均水力學(xué)粒徑與多分散系數(shù)

當(dāng)MnO2負(fù)載量不超過(guò)4.4%時(shí)，USTM的MHD隨MnO2負(fù)載量的增加僅輕微增大，這是由于DLS測(cè)定的MHD值包含膠體的直徑和雙電層厚度，UST/PEI表面的PEI鏈在溶液中傾向于舒展，導(dǎo)致雙電層厚度增大；隨著MnO2在UST/PEI表面沉積量的加大，USTM的直徑則逐漸增加，PEI鏈的舒展受到限制、雙電層厚度減小，兩方面因素的共同作用使MHD值增長(zhǎng)緩慢.較大Zeta電位值使USTM-1，USTM-2和USTM-3的PDI值均很小(0.065～0.125).過(guò)多MnO2的生成使USTM-4的直徑進(jìn)一步增大，減小的Zeta電位不利于粒子的穩(wěn)定分散，導(dǎo)致USTM-4的MHD突躍到389 nm.較大的MHD和不均勻的形貌決定了USTM-4難以作為可靠的光敏劑用于光動(dòng)力治療.

2.4 USTM催化產(chǎn)氧的性能

考慮到含有H2O2的弱酸性緩沖液被廣泛作為模擬腫瘤細(xì)胞的生理介質(zhì)用以研究納米MnO2的催化產(chǎn)氧能力[13,16]，本文在磷酸鹽緩沖液(pH=6.5)中測(cè)試了USTM催化H2O2產(chǎn)氧的能力.溶液的溶氧量在加入U(xiǎn)STM后快速上升，圖6a顯示溶氧量的增幅與USTM中MnO2的負(fù)載量呈正相關(guān)，而UST對(duì)H2O2幾乎不分解，圖6b證實(shí)溶液中溶氧量的增幅隨H2O2濃度的增加而增大，說(shuō)明USTM-3具有催化H2O2分解產(chǎn)生O2的能力.由于MnO2納米?？梢源呋[瘤細(xì)胞內(nèi)的H2O2產(chǎn)氧[26]，上述結(jié)果意味著USTM-3具有改善乏氧腫瘤細(xì)胞中溶氧量的潛質(zhì).圖6c顯示，H2O2的濃度越大，USTM-3在產(chǎn)氧反應(yīng)后的上轉(zhuǎn)換發(fā)光越強(qiáng)，且強(qiáng)度逐漸接近UST的發(fā)光，表明H2O2對(duì)MnO2的消耗可以抑制UCNPs到MnO2的熒光共振能量轉(zhuǎn)移.這一現(xiàn)象可以確保光敏劑在催化產(chǎn)氧后仍具有在NIR光下產(chǎn)生ROS的能力[16]，同時(shí)也為通過(guò)測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度的變化評(píng)判光敏劑在腫瘤組織的產(chǎn)氧進(jìn)程提供了一種可能的途徑.

a:不同光敏劑催化1 mmol/L H2O2產(chǎn)氧;b:USTM-3催化不同濃度H2O2產(chǎn)氧;c:USTM-3在反應(yīng)前后的上轉(zhuǎn)換發(fā)光光譜

2.5 USTM組成和H2O2添加對(duì)ROS產(chǎn)生影響

圖7 H2O2對(duì)USTM降解RhB性能的影響

表1 不同材料在NIR光照射下氧化降解RhB的效果

2.6 ROS的鑒定

進(jìn)一步借助探針DPBF檢測(cè)了USTM在NIR光下產(chǎn)生1O2的能力.如圖8b所示，在光照105 min時(shí)，USTM-3對(duì)DPBF的降解效率(19%)約為UST(12%)的1.5倍.當(dāng)添加H2O2時(shí)，USTM-3的催化產(chǎn)氧和轉(zhuǎn)化O2為1O2的性能顯著提高了其產(chǎn)生ROS的能力，DPBF的降解率增加至56%，約為UST產(chǎn)生1O2能力的3.8倍.上述結(jié)果意味著USTM具有利用腫瘤微環(huán)境的特征產(chǎn)氧并增強(qiáng)產(chǎn)生ROS的潛力[26].

a:捕獲劑對(duì)USTM-3降解RhB的影響; b:UST和USTM-3降解DPBF的性能

3 結(jié) 論

本文成功制備了MnO2負(fù)載的近紅外光驅(qū)動(dòng)納米光敏劑USTM.MnO2負(fù)載量不超過(guò)4.4%的光敏劑具有均勻的形貌，在水溶液中具有良好的分散效果和較窄的粒徑分布.MnO2的負(fù)載使光敏劑可以在弱酸性溶液中催化H2O2分解產(chǎn)生O2，提升光敏劑在近紅外光下產(chǎn)生ROS的能力.上述性能表明，USTM是一種能響應(yīng)腫瘤微環(huán)境、具有增強(qiáng)ROS產(chǎn)生能力的近紅外光驅(qū)動(dòng)納米光敏劑.考慮到近紅外光具有良好的穿透能力，進(jìn)一步研究USTM的生物毒性和對(duì)模型腫瘤細(xì)胞的體外治療性能，將有助于更好地評(píng)估該光敏劑用于深組織下乏氧腫瘤光動(dòng)力治療的可能性.