除草鏈格孢菌HY-02的培養(yǎng)和發(fā)酵條件優(yōu)化

李祥，朱海霞

（1.青海大學(xué)，青海 西寧 810016；2.青海省農(nóng)林科學(xué)院，青海 西寧 810016；3.農(nóng)業(yè)部西寧作物有害生物科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，青海 西寧 810016；4.青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016）

農(nóng)田雜草是危害農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)的罪魁禍?zhǔn)字唬?］，近年來(lái)我國(guó)農(nóng)田草害發(fā)生面積約為9 246.7萬(wàn)hm2［2］，大大降低了農(nóng)作物的收獲量。目前，雜草防除主要使用化學(xué)農(nóng)藥，造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染，打破了生態(tài)平衡［3］?；瘜W(xué)農(nóng)藥的副作用，使得人們對(duì)開發(fā)生防制劑產(chǎn)生了更大的興趣［4］。微生物除草劑的產(chǎn)生，極大地改善了農(nóng)田藥害問(wèn)題，使得生物防治成為了農(nóng)田病蟲草害的最佳防治技術(shù)［5］。

前人對(duì)于微生物除草劑的報(bào)道已經(jīng)有很多。例如，強(qiáng)勝等［6］開發(fā)研制出的生物除草劑殺草毒素AAC-Toxin對(duì)雜草的防效兩天內(nèi)達(dá)100%。陳超［7］研究發(fā)現(xiàn)，從特定環(huán)境中篩選出了具有生防潛力的毛殼菌，該菌可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性。Thomas等［8］發(fā)現(xiàn)了一種馬纓丹柄銹菌可以防治馬纓丹，尤其在熱帶雨林地區(qū)特別成功。從向日葵上分離的鐮刀菌屬（Fusariumsp.）真菌能抑制列當(dāng)種子的萌發(fā)［9］。埃及科學(xué)家篩選出的鏈格孢屬真菌（Alternaria alter?nate）可有效控制水葫蘆，從該菌中分離得到的毒素還可以破壞某些植物的光合作用，例如紫莖澤蘭（Eupatorium edenophorum），從而對(duì)其產(chǎn)生毒害［10］。

隨著發(fā)酵技術(shù)的日趨優(yōu)化和成熟，優(yōu)化工藝配方為微生物除草劑的生產(chǎn)提供了技術(shù)支持，是微生物除草劑實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵，為生物農(nóng)藥提供了前所未有的發(fā)展契機(jī)［11］。梁玎玎［12］研究發(fā)現(xiàn)草莖點(diǎn)霉（Phoma herbrum）SYAU-06菌株經(jīng)過(guò)發(fā)酵優(yōu)化制成水乳劑對(duì)盆栽鴨跖草（Commelina communis）的防治效果達(dá)到51.36%。Li等［13-14］利用固體發(fā)酵方式對(duì)毛殼霉屬和曲霉屬真菌進(jìn)行發(fā)酵，從其代謝產(chǎn)物中分離得到了抗腫瘤物質(zhì)。王國(guó)平等［15］為了提高木霉菌素的產(chǎn)量，通過(guò)優(yōu)化得到了最佳培養(yǎng)基配方。朱海霞等［16］利用正交設(shè)計(jì)法對(duì)極細(xì)鏈格孢的最適碳氮源、初始含水量、接種量等優(yōu)化獲得了菌株發(fā)酵所需的最佳條件。

除草活性鏈格孢（Alternaria alternate）真菌HY-02菌株是從青海省湟源縣波航鄉(xiāng)采樣，由自然感病的巴天酸模（Rumex patientiaL.）葉片分離得到，經(jīng)過(guò)前期致病性和作物安全性研究發(fā)現(xiàn)，該菌株對(duì)惡性闊葉雜草藜（Chenopodium album）、豬殃殃（Galium spurium）、萹蓄（Polygonum aviculare）、酸模葉蓼（Polygonum lapathifolium）、冬葵（Malva verticillata）、密花香薷（Elsholtzia densa）均具有不同程度的致病性，對(duì)禾本科作物小麥、青稞表現(xiàn)安全。為了明確該菌株發(fā)酵所需的培養(yǎng)基配方和發(fā)酵工藝，本研究通過(guò)對(duì)HY-02菌株進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，旨在探究該菌株的最佳產(chǎn)孢量以及最佳發(fā)酵條件，為探究其除草活性組分奠定基礎(chǔ)，為下一步將其制成生防除草劑提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

菌株HY-02從自然感病的巴天酸模分離得到，此菌株被鑒定為鏈格孢（Alternaria alternate）真菌，將菌株培養(yǎng)于PDA斜面上，保存于青海省農(nóng)科院植保所有害生物綜合防治實(shí)驗(yàn)室。

1.2 菌株培養(yǎng)

取斜面上培養(yǎng)的菌絲于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，備用。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 固體培養(yǎng)基的篩選 選擇7種不同的固體培養(yǎng)基（表1），將培養(yǎng)好的菌株打菌餅（Φ=8 mm），接于7種培養(yǎng)基平板中央，放在25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，每天觀察并測(cè)量其菌落直徑及菌落形態(tài)，重復(fù)3次，選擇長(zhǎng)勢(shì)（菌落直徑和菌絲形態(tài)）最好的培養(yǎng)基為固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

表1 供試培養(yǎng)基及其配方Table 1 Test medium and its formula

1.3.2 培養(yǎng)基的優(yōu)化 以察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，對(duì)培養(yǎng)基各成分進(jìn)行單因素試驗(yàn)。將活化的培養(yǎng)基中打菌餅（Φ=8 mm）接于裝有基礎(chǔ)培養(yǎng)液的三角瓶（250 mL）中，于25℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)7 d，測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)λ=640 nm的D值，重復(fù)3次。培養(yǎng)基各成分及水平選擇如表2所示。

表2 單因素試驗(yàn)及水平Table 2 Factors and levels of single factor test (g·L-1)

1.3.3 成分及配比優(yōu)化 根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原理，對(duì)碳、氮源及無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行成分配比優(yōu)化，以單因素結(jié)果為中心點(diǎn)，菌株HY-02的D（D=600 nm）值為響應(yīng)值（Y），設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面（RSM）試驗(yàn)，其因素及水平如表3所示。

表3 中心復(fù)合設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素及水平Table 3 Test factors and levels of central composite design

1.3.4 發(fā)酵條件優(yōu)化 以優(yōu)化的培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，分別測(cè)定不同培養(yǎng)溫度（22、25、28、31和34℃）、搖床轉(zhuǎn)速（150、165、180、195和210 r/min）、初始發(fā)酵時(shí)間（1、2、3、4、5、6和7 d）、pH（5、6、7、8和9）和裝液量（75、100、125、150、175、200和225 mL/瓶）對(duì)菌株HY-02的OD值的影響，每處理重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用DPS 9.0、Design Expert 12和Excel對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用新復(fù)極差法比較差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基的篩選

7 d后，菌株HY-02在7種培養(yǎng)基上的形態(tài)如圖1所示，在PDA培養(yǎng)基上，菌落呈灰色，氣生菌絲不發(fā)達(dá)，邊緣不整齊，菌絲呈絮狀；在PSA培養(yǎng)基上，菌落呈灰黑色，菌落邊緣整齊，氣生菌絲發(fā)達(dá)，菌絲呈絮狀；在NB培養(yǎng)基上，菌落呈黃褐色，氣生菌絲發(fā)達(dá)，菌絲呈絨毛狀；在察氏培養(yǎng)基上，菌落白色，呈絨毛狀，長(zhǎng)至后期顏色變?yōu)榉奂t色，菌落邊緣整齊，氣生菌絲發(fā)達(dá)；在孟加拉紅培養(yǎng)基上，前期菌落表面呈白色，后期呈黃色，菌絲呈絨毛狀邊緣整齊，氣生菌絲不發(fā)達(dá)，菌落不擴(kuò)大生長(zhǎng)；在培養(yǎng)基Ⅰ上，菌落呈白色，菌絲呈雪花狀，邊緣不整齊，后期菌絲體退化；在培養(yǎng)基Ⅱ上，菌落呈灰白色，邊緣不整齊，菌絲呈絮狀，氣生菌絲不發(fā)達(dá)，生長(zhǎng)后期凹凸不平。

圖1 菌株HY-02在不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基上菌落形態(tài)Figure 1 Colony morphology of strain HY-02 on different basic media

菌株HY-02在7種培養(yǎng)基上菌落直徑大小比較如圖2和表4所示，5 d后，察氏培養(yǎng)基中菌落直徑最大，為5.70 cm；孟加拉紅培養(yǎng)基中直徑最小，為3.03 cm；7種培養(yǎng)基菌落直徑之間差異顯著。7 d后，7種培養(yǎng)基菌落直徑相比較差異顯著，察氏培養(yǎng)基中菌落直徑最大，為7.50 cm；菌絲體發(fā)達(dá)如圖1所示。

圖2 菌株HY-02在不同培養(yǎng)基上的菌落直徑比較Figure 2 Comparison of colony diameter of strain HY-02 on different media

表4 菌株HY-02在不同培養(yǎng)基上的菌落直徑比較Table 4 Comparison of colony diameter of strain HY-02 on different media

2.2 培養(yǎng)基單因素優(yōu)化

2.2.1 蔗糖 由圖3-A可知，隨著蔗糖含量增加，菌株HY-02的D值先降低后增加，當(dāng)蔗糖的含量是70 g/L時(shí)，D值最大，之后隨蔗糖含量增加，D值減小。說(shuō)明70 g/L的蔗糖為菌株HY-02發(fā)酵的最適碳源量。

2.2.2 硝酸鈉 由圖3-B可知，隨著硝酸鈉含量增加，菌株HY-02的D值先增加后降低，當(dāng)硝酸鈉含量為12 g/L時(shí)，D值最大，之后隨硝酸鈉含量增加，D值減小。說(shuō)明12 g/L的硝酸鈉為菌株HY-02發(fā)酵的最適氮源量。

圖3 菌株HY-02在不同蔗糖和硝酸鈉含量發(fā)酵液中的D值Figure 3 D value of strain HY-02 in fermentation broth with different sucrose and sodium nitrate content

2.2.3 K2HPO4由圖4-A可知，隨著無(wú)機(jī)鹽K2HPO4含量的增加，菌株HY-02的D值先增加后降低，當(dāng)K2HPO4含量為6 g/L時(shí)，D值最大，之后隨K2HPO4含量增加，D值減小。說(shuō)明6 g/L的K2HPO4為菌株HY-02發(fā)酵的最適含量。

2.2.4 KCl由圖4-B可知，隨著KCl含量增加，菌株HY-02的D值先降低后增加，當(dāng)KCl為1.5 g/L時(shí)，D值最大，之后隨KCl含量增加，菌株HY-02D的D值先降低再增加又降低。說(shuō)明1.5 g/L的KCl為菌株HY-02發(fā)酵的最適含量。

圖4 菌株HY-02在不同K2HPO4和KCl含量發(fā)酵液中的D值Figure 4 D value of strain HY-02 in fermentation broth with different potassium hydrogen phosphate and potassium chloride content

2.2.5 MgSO4·7H2O 由圖5-A可知，隨著MgSO4·7H2O含量增加，菌株HY-02的D值先降低后增加，當(dāng)MgSO4·7H2O含量為2.0 g/L時(shí)，D值最大，之后隨著MgSO4·7H2O含量增加，D值先增加后減小。說(shuō)明2.0 g/L的MgSO4·7H2O為菌株HY-02發(fā)酵的最適含量。

2.2.6 FeSO4由圖5-B可知，隨著FeSO4含量增加，菌株HY-02的D值呈增加趨勢(shì)，當(dāng)FeSO4含量為0.04 g/L時(shí)，D值最大，之后隨FeSO4含量增加，D值先減小后增加。說(shuō)明0.04 g/L的FeSO4為菌株HY-02發(fā)酵的最適含量。

圖5 菌株HY-02在不同MgSO4·7H2O和FeSO4含量發(fā)酵液中的D值Figure 5 D value of strain HY-02 in fermentation broth with different magnesium sulfate heptahydrate and ferrous sulfate content

2.3 成分配比及優(yōu)化

根據(jù)單因素優(yōu)化結(jié)果，對(duì)菌株HY-02的液體培養(yǎng)條件，利用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)，結(jié)果如表5所示。

表5 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 5 Design and results of central composite test

以菌株HY-02發(fā)酵液的D值（Y）為響應(yīng)值，根據(jù)中心組合的試驗(yàn)結(jié)果（表6）進(jìn)行分析得到D值與蔗糖（A）、NaNO3（B）、無(wú)機(jī)鹽（C）的二次多項(xiàng)回歸方程：

通過(guò)方差分析上述回歸模型可知（表6），回歸模型的P=0.001 5，失擬項(xiàng)的P值0.099 4>0.05，模型回歸檢驗(yàn)極顯著，失擬檢驗(yàn)不顯著，說(shuō)明未知因素對(duì)試驗(yàn)的干擾很小，模型穩(wěn)定，回歸方程的決定系數(shù)為94.23%，說(shuō)明該方程與實(shí)際情況符合，反映了菌株HY-02的D值與碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽之間的關(guān)系，該模型能夠?qū)闔Y-02的D值進(jìn)行分析和模擬。

表6 回歸模型方差分析Table 6 Analysis of variance of regression model

模型數(shù)據(jù)顯示，一次項(xiàng)B及交互項(xiàng)AB、AC及二次項(xiàng)A2、B2、C2影響顯著，各因子的影響主次順序：C2>B2>A2>B>AB>AC>BC>A>C。

根據(jù)試驗(yàn)因素間交互效應(yīng)三維立體響應(yīng)面和等高線圖（圖6~8），在確定一個(gè)因素的情況下，觀察其他兩個(gè)因素對(duì)OD值的影響，蔗糖、硝酸鈉、無(wú)機(jī)鹽三者交互作用響應(yīng)面為開口向下的凸形曲面，且交互效應(yīng)的等高線形狀為圓形，說(shuō)明兩兩之間的交互作用效果較顯著。利用回歸方程得到菌株HY-02液體發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)孢量的培養(yǎng)基條件為：蔗糖79.789 g/L，硝酸鈉8.763 g/L，無(wú)機(jī)鹽5.472 g/L（其中K2HPO43.442 g/L、KCl 0.860 g/L、MgSO4?7H2O 1.147 g/L、FeSO40.0229 g/L）。

圖6 蔗糖含量和硝酸鈉含量交互作用對(duì)D值影響的響應(yīng)面圖（左）和等高線（右）Figure 6 Response surface（left）and contour（right）of interaction between sucrose content and sodium nitrate content on D value

2.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.4.1 發(fā)酵溫度 由圖9-A可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，菌株HY-02的D值呈增加趨勢(shì)，當(dāng)溫度為25℃時(shí)，D值最大，之后隨溫度的升高，D值減小，說(shuō)明25℃為最佳發(fā)酵溫度。

圖7 蔗糖含量和無(wú)機(jī)鹽含量交互作用對(duì)D值影響的響應(yīng)面圖（左）和等高線（右）Figure 7 Response surface（left）and contour（right）of interaction between sucrose content and norganic salt content on D value

圖8 硝酸鈉含量和無(wú)機(jī)鹽含量交互作用對(duì)D值影響的響應(yīng)面圖（左）和等高線（右）Figure 8 Response surface（left）and contour（right）of interaction between sodium nitrate content and norganic salt content on D value

2.4.2 轉(zhuǎn)速 由圖9-B可知，隨著轉(zhuǎn)速的增加，菌株HY-02的D值也隨之升高，當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到165 r/min時(shí)，菌株HY-02的D值達(dá)到最大，之后隨轉(zhuǎn)速增加，D值逐漸減小。故菌株HY-02的最適轉(zhuǎn)速為165 r/min。

圖9 發(fā)酵溫度和轉(zhuǎn)速對(duì)菌株HY-02 D值的影響Figure 9 Effect of fermentation temperature and rotation speed on D value of strain HY-02

2.4.3 裝液量 根據(jù)錐形瓶容量的不同分別設(shè)置不同梯度的裝液量，由圖10-A可知，隨著裝液量的增加，菌株HY-02發(fā)酵液的D值先增加后減小，當(dāng)裝液量為200 mL/瓶時(shí)，菌株HY-02的D值最大，之后隨裝液量增加，D減小。說(shuō)明最適裝液量為200 mL/瓶。

2.4.4 發(fā)酵時(shí)間 分別于不同發(fā)酵時(shí)間測(cè)定菌株HY-02的OD值。由圖10-B可知，在發(fā)酵時(shí)間為1~3 d，菌株HY-02的D值先減小后變大，當(dāng)菌株發(fā)酵到第4天時(shí)，菌株的D值達(dá)到最大值，之后隨時(shí)間變長(zhǎng)，D值先減小后增加，但第7天測(cè)得的D值較最大值略小，所以，選擇發(fā)酵時(shí)間為4 d作為菌株HY-02的最適發(fā)酵時(shí)間。

圖10 裝液量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株HY-02 D值的影響Figure 10 Effect of liquid volume and fermentation time on D value of strain HY-02

2.4.5 pH 分別設(shè)置不同的pH梯度測(cè)定菌株HY-02的D值。由圖11可知，隨pH值增加，菌株D值呈增加趨勢(shì)，當(dāng)pH=7時(shí)，菌株D值最大，之后菌株D值也變小。故選擇pH=7為該菌株最適pH。

圖11 PH對(duì)菌株HY-02 D值的影響Figure 11 Effect of pH on D value of strain HY-02

3 討論與結(jié)論

微生物除草劑不僅可以消除化學(xué)農(nóng)藥的抗藥性、殘留等缺點(diǎn)，而且可以彌補(bǔ)菌株退化、貨架期短等的不足，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)很多便利。微生物的發(fā)酵會(huì)受到碳氮源、基質(zhì)含水量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、轉(zhuǎn)速、pH等發(fā)酵條件的影響，不同因素對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成產(chǎn)生不同的影響差異［17-18］。通過(guò)微生物發(fā)酵條件優(yōu)化，既能提高菌劑的防效，又能促進(jìn)活性物質(zhì)的產(chǎn)生［19-20］。

前人利用固體和液體發(fā)酵方式獲得活性物質(zhì)，例如Abouzied等［21］利用大米為基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)不同鐮刀菌進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化，并分離出了化合物。Ahsan等［22］篩選了鏈霉菌（Streptomycessp.）TA 1123菌株，并對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化，提高了菌株TA 1123的抗生素產(chǎn)量和質(zhì)量。在本研究中，菌株HY-02的最適碳源為蔗糖，這與杜艷麗等［23］的研究結(jié)果一致。尹艷楠等［24］對(duì)蠟樣芽孢桿菌（Bacilluscereus）NJSZ-13菌株進(jìn)行優(yōu)化，其用pH=7的條件發(fā)酵菌株，使菌株產(chǎn)孢量增加，與本研究結(jié)果相似。朱海霞等［25］通過(guò)對(duì)具有除草活性的生防菌株HZ-31進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，選擇無(wú)機(jī)氮源作為發(fā)酵優(yōu)化的最適氮源與本研究結(jié)果一致，能夠增加菌株HY-02的產(chǎn)孢量。楊瑩等［26］利用中心組合優(yōu)化PA-2菌株所用的無(wú)機(jī)鹽，與本研究中所采用的無(wú)機(jī)鹽的作用相似，均能起到調(diào)節(jié)作用，能促進(jìn)菌株產(chǎn)孢。本研究利用7種不同固體培養(yǎng)基篩選得到最適培養(yǎng)基為察氏培養(yǎng)基，以察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，對(duì)各組分進(jìn)行優(yōu)化得到最佳配比（蔗糖：79.789 g/L，NaNO3：8.763 g/L，無(wú)機(jī)鹽：5.472 g/L），為除草活性物質(zhì)的分離和純化奠定了基礎(chǔ)。

本研究對(duì)菌株HY-02發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳碳、氮源及無(wú)機(jī)鹽的成分配比為：蔗糖：79.789 g/L，NaNO3：8.763 g/L，無(wú)機(jī)鹽：5.472 g/L（其中K2HPO43.442 g/L、KCl 0.860 g/L、MgSO4?7H2O 1.147 g/L、FeSO40.022 9 g/L）。最適發(fā)酵條件為：溫度25℃，轉(zhuǎn)速165 r/min，裝液量200 mL，發(fā)酵時(shí)間4 d、pH=7。菌株HY-02的液體發(fā)酵優(yōu)化，為菌株的液體發(fā)酵提供了最優(yōu)配方和條件，但未對(duì)固態(tài)發(fā)酵條件探索，是否滿足工業(yè)生產(chǎn)和田間防除雜草還需要更多的發(fā)酵數(shù)據(jù)去驗(yàn)證。下一步將對(duì)該菌株的劑型、田間藥效、除草機(jī)理等進(jìn)行系統(tǒng)研究，為該菌的劑型研究以及以后菌劑的規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)參考，為菌株HY-02開發(fā)出新型生物除草劑奠定基礎(chǔ)。