高溫脅迫下半夏葉片的轉錄組分析

郭連安，莫讓瑜，譚均，潘媛，陳大霞

（重慶市中藥研究院，中國中醫(yī)科學院中藥資源中心重慶分中心，重慶市中藥良種選育與評價工程技術研究中心，重慶 400065）

全球變暖導致極端高溫天氣頻發(fā)，高溫已成為影響植物產量的主要因素之一。高溫不僅影響植物的表型，還會破壞細胞穩(wěn)態(tài)，嚴重影響植物的生長發(fā)育，甚至導致死亡［1］。研究表明，高溫脅迫會抑制植物各種生理和生化反應，包括水分利用、細胞膜穩(wěn)定性、光合作用、次級代謝產物和植物激素水平等變化［2］。因此，研究植物如何響應高溫脅迫對于提高植物耐熱性具有重要意義。

半夏（Pinellia ternate）是天南星科半夏屬植物，為我國傳統(tǒng)的常用大宗中藥材之一，具有悠久的藥用歷史，用于止咳祛痰、鎮(zhèn)吐、抗癌、抗早孕、抑制心律失常和炎癥等多種病癥［3］。目前，有關半夏的研究多集中于栽培技術［4］、有效成分［5］和藥理作用［6］等方面。半夏對高溫非常敏感，溫度過高會出現(xiàn)倒苗，人們逐漸關注到高溫對半夏的生理特性［7-8］、植物激素［9］和有效成分含量［10］等方面的影響。然而，從分子生物學水平上探究半夏在溫度脅迫下的應對機制，篩選半夏熱脅迫基因，提高半夏的耐熱性是減輕高溫對半夏生長造成傷害的最有效方法。

隨著生物技術的發(fā)展，轉錄組測序技術已普遍應用于藥用植物功能基因組的研究，能在單核苷酸水平對藥用植物的整體轉錄活動進行檢測，從而快速地獲取研究對象在某一狀態(tài)下的轉錄本信息［11-12］。轉錄組測序能研究藥用植物活性成分的生物合成與調控，挖掘參與逆境脅迫調控的重要功能基因，有助于天然藥物的開發(fā)和高產抗逆品種的選育。通過轉錄組測序，已獲得高溫脅迫下牡丹Paeo?nia suffruticosa［13］、薄荷Mentha haplocalyx［14］、黃花蒿Artemisisannua［15］等藥用植物轉錄組信息，為藥用植物的遺傳改良提供了豐富的基因資源。本研究對高溫脅迫下半夏葉片進行轉錄組測序分析，篩選和挖掘半夏熱脅迫基因，為培育半夏耐熱品種提供基因資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

半夏種源采自重慶市萬州區(qū)，經重慶市中藥研究院陳大霞研究員鑒定為天南星科半夏屬植物半夏（Pinellia ternate）的塊莖。選取大小一致的半夏塊莖播種于花盆中，培養(yǎng)基質為土壤∶蛭石=2∶1，每盆20顆，在人工氣候箱中培養(yǎng)，白天溫度25℃，晚上溫度20℃，光周期為12 h光照12 h黑暗，光照4 000 lx。待半夏植株長到約15 cm時，在人工氣候箱中進行38℃高溫處理，12 h后取半夏葉片，用錫箔紙包裹儲藏于液氮中，待用。

1.2 總RNA的提取、文庫的構建及測序

采用植物總RNA提取試劑盒（TIANGEN）提取半夏葉片總RNA，用Nanodrop超微量分光光度計（Thermo）檢測RNA的濃度和純度，利用瓊脂糖凝膠電泳（150 V，20 min）分析RNA質量。檢測合格的6個半夏葉片RNA樣品委托北京諾禾致源科技股份有效公司進行cDNA文庫構建和轉錄組測序。

1.3 轉錄組數(shù)據(jù)組裝

轉錄組原始數(shù)據(jù)經去除帶接頭和低質量的reads后，獲得Clean reads。利用Trinity軟件對Clean reads進行拼接和組裝，獲得不同大小的轉錄本（Transcripts）和基因（Unigenes）。

1.4 差異基因分析

采用FPKM值估算基因表達水平，采用Cuf?flinks軟件對測序得到的FPKM值進行分析［16-17］，以Padj<0.05（Padj為矯正后的P）且log2（fold change）≥2為標準篩選差異表達基因（DEGs）。

1.5 DEGs功能注釋及GO、KEGG富集分析

將DEGs與NR（NCBI non-redundant protein sequences）、NT（NCBI nucleotide sequences）、PFAM（Protein family）、KOG（euKaryotic Ortholog Groups）、Swiss Prot（Swiss Prot protein database）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）和GO（Gene Ontology）等數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得DEGs的功能注釋信息，并對DEGs做GO和KEGG富集分析。

1.6 qRT-PCR分析

采用Primer Premier 5.0軟件設計基因特異性引物，內參基因為PtGAPDH［7］（表1）。采用M 5 Super plus qPCR RT kit with gDNA remover試劑盒（Mei5bio），以500 ng RNA為模板反轉成cDNA。使用實時熒光定量試劑盒（Vazyme）進行qRT-PCR，20μL反應體系為：模板RNA 2μL、上游引物和下游引物各1μL（引物終濃度0.2μmol/L），10μL ChamQTMUniversal SYBR qPCR Master Mix，用ddH2O補足至20μL。所用程序為：94°C預變性5 min；94°C變性10 s，60°C退火30 s，72°C延伸40 s，40個循環(huán)。

表1 實時定量熒光基因引物序列Table 1 Real-time quantitative gene primer sequences

1.7 轉錄組序列號

全部轉錄組數(shù)據(jù)可在美國國家生物信息中心（NCBI）SRA數(shù)據(jù)庫中查詢（PRJNA781127）。

2 結果與分析

2.1 半夏轉錄組測序結果與數(shù)據(jù)組裝

經高溫脅迫處理后，半夏對照組（CK）和高溫處理組（T）樣本經轉錄組測序共獲得Raw reads 131 281 455條。將有接頭的、低質量的Raw reads進行過濾，對照組和高溫處理組分別獲得62 973 770條和65 240 619條Clean reads，共包含38.48 Gb Clean bases（表2）。經測序質量控制分析，6個半夏葉片測序樣本的Q20≥97.23%，Q30≥92.94%，GC con?tent≥48.84%（表2），表明這6個半夏葉片轉錄組測序的質量較高，可用于De novo組裝和數(shù)據(jù)分析。

表2 高溫脅迫下半夏轉錄組測序質量情況Table 2 Sequencing quality of transcriptome of Pinellia ternata under high temperature stress

通過Trinity軟件對過濾后的Clean reads進行拼接，共獲得281 189個轉錄本，總長度275 002 094 bp，平均長度978 bp，N50長度為1 270 bp（表3）。通過對所有轉錄本進行進一步聚類和組裝，共獲得91 526條Unigenes，總長度82 269 071 bp，平均長度899 bp，N50平均長度1 214 bp。Unigenes長度主要分布在300~500 bp，共有36 904個，占總數(shù)的40.32%；長度為500~1 000 bp的轉錄本29 243個，占比31.95%；長度為1 000~2 000 bp的轉錄本17 362個，占比18.97%；長度大于2 000 bp的轉錄本有8 017個，占比8.76%（表3）。轉錄本和Unigenes的分布趨勢不同，分布在500~1 000 bp的轉錄本最多，而Unigenes的數(shù)量隨序列長度的增加而減少。

表3 高溫脅迫下半夏轉錄組數(shù)據(jù)組裝統(tǒng)計Table 3 Assemble statistics of transcriptome data of Pinellia ternata under high temperature stress

2.2 轉錄組Unigenes的功能注釋

將Unigenes序列分別在不同的數(shù)據(jù)庫中進行比對，共有45 409條Unigenes獲得注釋，占比46.61%。其中獲得注釋比例前三的數(shù)據(jù)庫是NR、PFAM和GO，分別占比39.47%（36130條）、30.05%（27 506條）和30.05%（27 505條）（表4）。根據(jù)NR數(shù)據(jù)庫中的物種注釋比對，發(fā)現(xiàn)大部分Unigenes（27.3%）的E值分布于10-15~10-5（圖1A）；40.2%的Unigenes的序列相似度在60%~80%（圖1B）；此外，分別有12.5%和12.1%的Unigenes注釋到非洲油棕和海棗（圖1-C）。

圖1 Unigene的NR注釋Figure 1 NR annotation of transcriptome for Unigenes

表4 Unigene的注釋統(tǒng)計Table 4 Unigenes annotation statistics

2.3 差異表達分析

通過將對照組和高溫處理組的半夏葉片轉錄組數(shù)據(jù)進行比較分析，以Padj<0.05（Padj為矯正后的P）且|log2（fold change）|≥2為判斷標準篩選DEGs。圖2結果表明：對照組和高溫處理組之間共篩選到1 716個DEGs，與對照組相比，高溫處理組中有1 138個DEGs表達量上調，578個DEGs表達量下調。

圖2 差異表達基因的火山圖Figure 2 Volcano map of differentially expressed genes

2.4 DEGs的GO富集分析

將對照組與高溫處理組半夏葉片之間的DEGs進行GO（Gene ontology）功能注釋分析，611個DEGs被注釋到生物學過程、細胞組分和分子功能3大類，其中有356個DEGs表達量上調，255個DEGs表達量下調。圖3為DEGs在GO數(shù)據(jù)中顯著富集的GO term（P<0.005）。在生物學過程方面，除單有機體細胞器組織（22個，占3.60%）得到最顯著富集外，還有化學響應（20個，占3.27%）、激素響應（14個，占2.29%）、有機物響應（14個，占2.29%）和生長素響應（13個，占2.13%）等與逆境脅迫相關的GO term，說明高溫脅迫已影響半夏的正常生命活動。在細胞組分方面，DEGs主要富集在轉錄因子復合體（45個，占7.36%）、轉移復合體，轉移含磷基團（22個，占3.60%）和宿主細胞核（18個，占2.95%）等GO term。在分子功能方面，DEGs主要在內肽酶活性（27個，占4.42%）、血紅素結合（23個，占3.76%）和四吡咯結合（23個，占3.76%）等GO term得到顯著富集，說明高溫脅迫已導致植物細胞被破壞。

圖3 高溫脅迫處理下半夏轉錄組DEGS的GO分類Figure 3 Go classification of DEGs in Pinellia ternata transcriptome under high temperature stress treatment

2.5 DEGs的KEGG分類與通路富集分析

將對照組與高溫處理組半夏葉片之間的DEGs進行全基因組及代謝途徑調控網絡富集分析，共有194個DEGs注釋到細胞過程（3條）、環(huán)境信息處理（2條）、遺傳信息處理（15條）、代謝（41條）和生物系統(tǒng)（2條）5大類63條KEGG代謝通路，其中有120個DEGs表達量上調，74個DEGs表達量下調。圖4為DEGs富集程度排名前30的代謝通路，獲得DEGs注釋數(shù)量最多的3個代謝通路為內質網蛋白質加工（68個，占35.05%）、內吞作用（25個，占12.89%）和剪接體（23個，占11.86%）。進一步對上調和下調的DEGs進行代謝通路富集分析，發(fā)現(xiàn)高溫脅迫后半夏葉片中表達量上調的DEGs主要與內質網蛋白加工、內吞作用和剪接體有關（圖5A）；表達量下調的DEGs主要集中在氨基糖和核苷酸糖代謝、淀粉和蔗糖代謝及半胱氨酸和氮代謝等代謝通路（圖5B）。

圖4 高溫脅迫下DEGs富集程度排名前30的代謝通路Figure 4 Top 30 of metabolic pathways enrichment of DEGs under high temperature stress treatment.

圖5 高溫脅迫處理的半夏轉錄組DEGs KEGG通路富集分析Figure 5 KEGG pathway encichment of DEGs in Pinellia ternata transcriptome under high temperature stress treatment

2.6 差異表達基因功能鑒定

2.6.1 半夏葉片植物激素相關DEGs分析 高溫脅迫可能會引起植物細胞內激素代謝和信號轉導發(fā)生變化。通過轉錄組測序分析發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫下生長素應答蛋白基因PtARP1、赤霉素調控蛋白基因PtGRP1和脫落酸應答元件結合因子基因PtABF表達量上調，而11個生長素應答蛋白基因PtARP、2個細胞分裂素信號途徑負調控基因PtARR（PtARR1、PtARR2）和赤霉素調控蛋白基因PtGRP2表達量下調，說明高溫脅迫下不同植物激素響應基因的表達模式存在一定的差異。

2.6.2 半夏葉片氧化還原系統(tǒng)DEGs分析 高溫脅迫下，植物體內產生活性氧會破壞細胞膜，而保護酶系統(tǒng)可以清除活性氧，減輕活性氧所造成的細胞損傷。轉錄組分析發(fā)現(xiàn)：在高溫脅迫下，7個谷胱甘肽S轉移酶基因PtGST表達量不同程度上調，4個過氧化物酶基因PtPOD和2個過氧化氫酶基因PtCAT表達量下調（表6）。

表6 氧化還原系統(tǒng)DEGs分析Table 6 Analysis of DEGs involved in oxidation-reduction system

2.6.3 半夏葉片熱激蛋白DEGs分析 熱激蛋白是植物受到高溫脅迫后產生的一類新的蛋白質，可以提高植物的耐熱性。轉錄組分析發(fā)現(xiàn)：半夏葉片中有23個熱激蛋白基因PtHSP在高溫脅迫下表達量呈現(xiàn)不同程度的上調表達（表7）。這些結果表明高溫脅迫下，半夏葉片中的熱激蛋白基因表達量增加，對維持細胞穩(wěn)態(tài)、提高抵御高溫脅迫的能力具有重要作用。

表7 熱激蛋白相關DEGs分析Table 7 Analysis of DEGs encoding heat shock protein

2.7 實時熒光定量分析

為了進一步驗證轉錄組數(shù)據(jù)，隨機選取9個在高溫脅迫下上調和下調的DEGs，分別是3個生長素應答蛋白基因PtARP（PtARP3、PtARP5、PtARP12）、細胞分裂素信號途徑負調控基因PtARR1、過氧化物酶基因PtPOD1、谷胱甘肽S轉移酶基因PtGST2和3個熱激蛋白基因PtHSP（PtHSP1、PtHSP2、PtHSP23），使用qRT-PCR技術進行驗證。圖6的結果表明，9個DEGs在高溫脅迫下的表達量變化趨勢與轉錄組測序結果基本一致，表明轉錄組測序結果相對可信。

表5 植物激素信號轉導途徑DEGs分析Table 5 Analysis of DEGs involved in plant hormone signal transduction

圖6 高溫脅迫下DEGs的qRT-PCR分析Figure 6 qRT-PCR analysis of DEGs under high temperature stress

3 討論與結論

近年來，隨著全球氣候變暖加劇，短期或長期極端高溫天氣頻發(fā)，給植物的產量造成嚴重的影響。高溫脅迫會改變植物形態(tài)、生理生化過程和基因表達，阻礙植物的正常生長發(fā)育，提高植物耐熱性已成為研究熱點。半夏的生長發(fā)育極易受到高溫的傷害，在生長發(fā)育的關鍵時期，高溫脅迫會導致半夏地上部分倒苗，嚴重影響半夏的產量積累。薛建平等［18］研究發(fā)現(xiàn)，隨著高溫脅迫時間的延長，半夏葉片、葉柄和塊莖中的SOD和POD活性逐漸下降，葉片和葉柄中的MDA含量顯著增加。因此，進一步闡明半夏響應高溫脅迫的生物學機制，對于提高半夏的耐熱性具有重要的指導作用。本研究通過Illu?mina高通量測序技術對38℃高溫脅迫處理的半夏葉片進行轉錄組分析，樣本平均數(shù)據(jù)量為6.41 Gb，經Trinity軟件組裝獲得91 526條Unigene，平均長度899 bp，N50平均長度1 214 bp。半夏經高溫脅迫后共有1 716個DEGs差異表達，其中表達水平上調1 138個，下調578個。qRT-PCR分析表明9個DEGs在高溫脅迫下表達量變化趨勢與轉錄組結果基本一致，進一步驗證了轉錄組數(shù)據(jù)的可靠性。

GO功能注釋分析表明高溫脅迫下DEGs主要集中在轉錄因子復合體、內肽酶活性、血紅素結合和四吡咯結合。轉錄組因子是一類能夠以序列特異性方式結合真核基因啟動子區(qū)域并且調節(jié)轉錄的蛋白質，在植物逆境脅迫中起著重要作用，當植物遭受高溫、干旱等逆境脅迫時，通過激活基因的轉錄表達來調節(jié)植物對逆境脅迫信號的反應。在擬南芥Arabi?dopsisthaliana中，提高轉錄因子CBF1和CBF4的表達量可以激活冷脅迫相關基因的表達，并提高擬南芥的耐冷性［19-20］。在番茄Solanum lycopersicum中，過表達熱激轉錄因子HsfA1可提高番茄的耐熱性［21］。在GO分析中，富集DEGs最多的是轉錄因子復合體，說明高溫脅迫后半夏葉片中大量轉錄因子被激活，并通過誘導高溫脅迫基因的表達來調節(jié)半夏對高溫脅迫的應答。內肽酶是蛋白水解酶的一種，參與植物衰老、生物脅迫和非生物脅迫等生命活動。高溫脅迫下，內肽酶活性富集了較多的DEGs，表明高溫脅迫導致了半夏葉片內蛋白質代謝紊亂。KEGG代謝通路分析發(fā)現(xiàn)富集DEGs最多的代謝途徑是內質網蛋白質加工。內質網對蛋白質的加工主要包括糖基化、羥基化、?；投蜴I形成等，其中最主要的加工是糖基化，絕大部分內質網上合成的蛋白質都會被糖基化，蛋白質經過糖基化作用才能進行信號傳導和正確折疊。本研究中，內質網蛋白質加工代謝途徑富集了的DEGs最多，說明該代謝途徑在半夏響應高溫脅迫的過程中起著重要作用［22-23］。

高溫脅迫可引起植物體內激素含量和活性的變化，從而提高對逆境的抵抗或適應能力。半夏轉錄組DEGs注釋結果表明，生長素應答蛋白基因的表達受到高溫脅迫的雙向調控，其中表達水平下調的生長素應答蛋白DEGs明顯多于表達上調的DEGs。同時，高溫脅迫還促進了赤霉素調控蛋白基因Pt?GRP1和脫落酸應答元件結合因子基因PtABF的表達。研究表明，脫落酸應答元件結合因子ABF是一種bZIP轉錄因子，具有轉錄激活活性，參與植物非生物脅迫應答和脫落酸信號轉導，水稻Oryza sativa OsABF1/OsbZIP12受鹽、干旱和脫落酸等非生物脅迫誘導，上調其表達量可增加水稻的耐旱性［22-23］。本研究中，PtABF的表達量上調可能有助于提高半夏對高溫脅迫的抗性。

植物遭受逆境脅迫的主要特征是活性氧代謝的失調。高溫脅迫會導致植物細胞內活性氧大量積累，而酶促防御系統(tǒng)（包括超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶等）通過清除活性氧，減輕高溫造成的細胞膜和蛋白質損傷，增加對高溫脅迫的抗性。本研究中，7個谷胱甘肽S轉移酶基因PtGST的表達量在高溫脅迫脅迫下顯著增加，表明半夏通過谷胱甘肽S轉移酶清除高溫脅迫產生的活性氧和調控谷胱甘肽的代謝，以減輕高溫造成的損傷。

研究表明，高溫下植物產生的熱激蛋白HSPs可提高植物耐熱性，保護機體蛋白質免遭損傷或修復已受損傷的蛋白質，從而對植物起保護作用，并在維持內環(huán)境穩(wěn)態(tài)和抵御逆境脅迫等方面具有重要作用［24］。在擬南芥中，過表達百合Lilium lancifolium LlHSP70基因可提高轉基因擬南芥對高溫的耐受性［25］。在擬南芥中過表達菊花Chrysanthemum HSP70基因可提高擬南芥對高溫、干旱和鹽脅迫的抗性［26］。本研究表明，半夏經高溫脅迫后葉片中27個PtHSP表達水平顯著上調，且PtHSP1、PtHSP3、

PtHSP4、PtHSP7、PtHSP9、PtHSP11、PtHSP13、PtHSP19、PtHSP20、PtHSP21、PtHSP22和PtHSP23在高溫處理后表達量上調3倍以上，說明PtHSP基因能迅速響應高溫脅迫，以維持半夏葉片細胞的正常生理功能。綜上，通過對高溫脅迫后的半夏葉片進行高通量轉錄組測序分析，挖掘到植物激素信號轉導、氧化還原系統(tǒng)和熱激蛋白等候選基因，為培育半夏耐熱品種提供基因資源，也為一步深入研究高溫影響半夏的分子機制提供理論依據(jù)。