不同劑量PMSG對獺兔超數(shù)排卵效果及胚胎質量的影響

冉興榮，伏曉玉，鐵雅楠，王欣榮

（甘肅農業(yè)大學動物科學技術學院，甘肅 蘭州 730070）

對雌性哺乳動物注射促性腺激素會使其卵巢中較多的卵泡發(fā)育并誘發(fā)排卵，此方法為超數(shù)排卵，簡稱超排［1］。超數(shù)排卵是獲取大量卵子或胚胎的有效途徑之一，且雌性動物的超數(shù)排卵效果受到動物個體自身的遺傳、體況、年齡、發(fā)情周期階段、卵巢功能等多種因素的影響［2］。超排技術作為快速獲得卵子或胚胎的有效手段，隨著科學研究和動物生產的需要逐漸被應用到更多的領域中，并且通過與胚胎移植技術的結合，對畜牧業(yè)的高效生產帶來了革命性的變化。孕馬血清促性腺激素（PMSG），也稱為馬絨毛膜促性腺激素，具有促卵泡素（FSH）和促黃體素（LH）的雙重活性，并且有著比FSH更低的生產成本，因此常用來代替FSH作為超排常用的激素之一。但PMSG的化學結構特殊，有更長的半衰期，在動物體內代謝緩慢，特別在使用大劑量外源性PMSG進行超排處理時，會引起母畜諸多卵巢疾病，從而影響超排后的卵母細胞數(shù)量和質量［3-5］。動物超排所用到的FSH和PMSG的處理方法已在牛、馬、羊、兔、小鼠等開展了大量研究，且不同物種之間的效果差異很大。家兔作為生物學試驗常用的動物，前人已經使用了不同的處理方法，對多個家兔品種的卵巢排卵點數(shù)、充血卵泡數(shù)、排卵數(shù)等的超排效果開展了研究，篩選出適合在生產中應用的超排激素劑量。但對于一些特定品種如獺兔的研究，特別是超排后胚胎質量的研究報道尚不多見。本試驗對成年健康獺兔注射不同劑量PMSG進行超排處理，通過測定其平均排卵點數(shù)、充血卵泡數(shù)、胚胎收集數(shù)、胚胎畸形率等指標，比較在不同PMSG劑量下獺兔的超排效果，探討外源生殖激素對獺兔卵巢發(fā)育及胚胎發(fā)育質量的影響，為在生產實踐中制定科學的超排方案提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選擇體質量3~4 kg，7~8月齡獺兔母兔18只，以及體質量4~5 kg，9~10月齡獺兔公兔6只。所有試驗動物均已達到性成熟，單籠飼養(yǎng)。孕馬血清促性腺激素（PMSG）和人絨毛膜促性腺激素（hCG）均購自寧波第二激素廠。PBS沖卵液（PBS，100 IU/mL青霉素鈉，100 IU/mL硫酸鏈霉素，1%FBS）購自美國ICP公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗獺兔的分組 將獺兔隨機分為3組，分別為Ⅰ組（50 IU PMSG+100 IU hCG）、Ⅱ組（100 IU PMSG+100 IU hCG）和Ⅲ組（150 IU PMSG+100 IU hCG），每組6只母兔。

1.2.2 超數(shù)排卵處理方法 用1 mL注射器吸取相應劑量的PMSG，在獺兔大腿內側肌注，72 h后同法注射100 IU hCG，隨后與公兔1∶1合籠，自然交配，誘導其排卵及受精。

1.2.3 卵泡發(fā)育及胚胎的采集觀察 交配24 h后的母兔用耳緣靜脈注射空氣法處死，實驗室解剖后取出輸卵管和卵巢。首先觀察卵巢發(fā)育狀況，記錄卵巢上的排卵點數(shù)、卵泡囊腫數(shù)以及充血卵泡數(shù)。剝離卵巢與輸卵管連接處，將提前制備好的沖卵針從宮管結合處靠近子宮角方向約1 cm處刺入，將針頭預埋在輸卵管中，并用止血鉗固定好針頭。手持輸卵管，在輸卵管傘部下放置60 mm規(guī)格的一次性無菌培養(yǎng)皿，緩慢推入PBS沖卵液沖卵。將盛有培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿置于體視顯微鏡下觀察，按照胚胎形態(tài)學評級方法［6］，記錄優(yōu)質胚胎與劣級胚胎數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2010進行整理，然后采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件中的ANOVA進行單因素方差分析，差異顯著時用LSD法進行多重比較，P<0.05為差異顯著判斷標準。數(shù)據(jù)結果用±s標準差來表示。

2 結果與分析

2.1 不同劑量的PMSG對獺兔超數(shù)排卵的影響

由表1可知，Ⅰ組平均排卵點數(shù)和平均胚胎收集數(shù)均高于Ⅲ組（P<0.05）；Ⅲ組平均卵泡囊腫數(shù)顯著高于Ⅰ組（P<0.05）；Ⅲ組平均充血卵泡數(shù)顯著高于Ⅱ組，且Ⅱ組顯著高于Ⅰ組（P<0.05）。

表1 不同劑量PMSG對獺兔超數(shù)排卵的影響Table 1 Effects of different doses of PMSG on superovulation in rex rabbits

2.2 不同劑量的PMSG對獺兔早期胚胎質量的影響

由表2和圖1可知，Ⅰ組平均可用胚胎數(shù)顯著高于Ⅱ組和Ⅲ組（P<0.05），Ⅲ組胚胎畸形率顯著高于Ⅱ組，且Ⅱ組顯著高于Ⅰ組（P<0.05）。由圖2可知，A~C組分別為Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組獺兔超數(shù)排卵處理下獲得的優(yōu)質胚胎，D~F組為劣質胚胎。由A~C圖可見，Ⅰ組沖得的胚胎結構完整清晰，層黏蛋白顏色通透，且隨著PMSG劑量的增加，胚胎結構有畸形改變的趨勢。D~F組胚胎結構模糊不規(guī)則，細胞核隨著PMSG劑量的上升均出現(xiàn)不同程度的碎裂變形。

圖1 不同劑量PMSG對獺兔超數(shù)排卵回收率與畸形率的影響Figure 1 Effect of different doses of PMSG on retrieving rate and malformation rate of embryos under superovulation in rex rabbits

圖2 沖胚操作獲得的1-細胞期胚胎Figure 2 1-cell stage embryos obtained during flushing operation.

表2 不同劑量PMSG對獺兔早期胚胎發(fā)育的影響Table 2 Effects of different doses of PMSG on early embryonic development of rex rabbits

3 討論

不同劑量外源激素對獺兔的超數(shù)排卵效果具有一定的影響。Kennelly［7］指出，高劑量外源激素導致的卵子減少是因為仍有部分卵子殘留在卵泡當中。王田娟等［8］研究發(fā)現(xiàn)，用FSH、HMG（人絕經尿促性素）和PMSG分別與hCG組合對家兔進行超數(shù)排卵對比后發(fā)現(xiàn)，PMSG試驗組出現(xiàn)大量充血卵泡和囊腫，而同劑量的FSH組和HMG組較少。本試驗結果也顯示，Ⅱ組和Ⅲ組的平均充血卵泡數(shù)和平均卵泡囊腫數(shù)顯著高于Ⅰ組，可能是由于PMSG半衰期長，在動物體內長時間殘留難以代謝出去，大劑量使用后會產生不良效應，這與李存欣［9］等在用PMSG對獺兔超數(shù)排卵后的結果一致，超排處理后的獺兔充血卵泡數(shù)顯著增加。

動物的性活動主要受垂體的控制，通過人工注射外源性激素彌補了母畜內源性激素分泌量的不足，從而達到超數(shù)排卵的目的。本研究中Ⅰ組母兔的排卵點數(shù)顯著高于Ⅱ組和Ⅲ組，說明低劑量的外源激素能夠在一定程度上減少卵巢中同一時期的卵泡閉鎖現(xiàn)象，促使卵巢內的更多卵泡發(fā)育并排卵，這與林峰［10］等用PMSG對母兔進行超數(shù)排卵處理后的結果一致。但隨著激素劑量的不斷增加，卵巢出現(xiàn)了不同程度的“過刺激炎癥反應”，具體表現(xiàn)在Ⅱ組、Ⅲ組充血卵泡數(shù)和卵泡囊腫數(shù)明顯高于Ⅰ組。毛冠平等［11］分別用50 IU和100 IU 2種劑量對成年哈白兔進行超數(shù)排卵后發(fā)現(xiàn)，充血卵泡和囊腫卵泡液都逐漸增多。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是接受了外源性激素處理的母兔卵巢，由于過高的激素水平使得卵巢上大量卵泡生長發(fā)育，卵巢上的血管增生，基質增加，卵巢體積逐漸增大［8］。且PMSG的LH作用使卵巢上卵泡血管擴張，內壓升高，毛細血管破裂，導致內膜、顆粒膜破裂，血液流入管腔，形成大量充血卵泡。因此本研究結果也佐證了相關報道［12-13］。除此之外，為保證超數(shù)排卵效果，也需要注意激素之外的其他影響因素。例如，根據(jù)母兔的發(fā)情鑒定標準，需確保在注射hCG前母兔處于發(fā)情期。因母兔繁殖特點的特殊性，為確保母兔能夠成功排卵并受精，且胚胎的質量不受精液品質的影響，與母兔同籠交配的公兔需選取成年健壯、爬跨反應較好者。同時也要考慮輸卵管沖胚操作的影響，胚胎離開母體生理環(huán)境后較為脆弱，因此對外界環(huán)境的要求較高，PBS沖卵液只能提供胚胎臨時的營養(yǎng)供給，為避免人為因素和環(huán)境的變化對胚胎造成畸形，應在體視顯微鏡下迅速對含有胚胎的沖卵液進行挑選評級。

在相同激素水平下，注射劑量較低時不足以引起卵泡發(fā)育而排卵，當增加激素劑量，排卵率會隨著劑量的上升而呈現(xiàn)增加的趨勢，但過高的激素水平又會導致卵巢變態(tài)發(fā)育，卵泡無法排卵，導致超數(shù)排卵效果較差［14］。張金友等［15］用4種不同劑量PMSG對日本大耳超排后發(fā)現(xiàn)，隨著激素劑量的上升，充血卵泡中的顆粒細胞層數(shù)和直徑明顯增加。因此，要想獲得較好超數(shù)排卵效果，必須綜合考慮影響超數(shù)排卵的因素，選擇適宜的激素劑量［16-18］。本試驗結果證明，Ⅰ組超數(shù)排卵效果較好，可能是該劑量在獺兔超數(shù)排卵的適宜劑量范圍之內，促使更多的卵泡啟動發(fā)育，在卵泡能夠成熟排卵的同時，減弱了PMSG對卵巢的副作用。另外通過本研究可知，經過超數(shù)排卵后的胚胎細胞會出現(xiàn)畸形的情況，但PMSG劑量的不同，畸形的程度也不同。曹君君［19］同劑量的PMSG對日本大耳兔進行超排后發(fā)現(xiàn)，超排獲得的胚胎質量參差不齊，在交配后72 h所獲得的胚胎透明帶明顯彎曲變形，胚胎形狀不規(guī)則，且占所收集胚胎的30%以上。陳現(xiàn)偉等［20］應用FSH+LH組合對家兔超數(shù)排卵處理，在配種后32～40 h采卵并選擇發(fā)育良好的胚胎進行移植，發(fā)現(xiàn)胚胎移植成功率為58.02%，且所產仔兔體征健康。吳海鳳等［21］用PMSG對6周齡的羔羊超數(shù)排卵后發(fā)現(xiàn)，PMSG對早期胚胎的體外發(fā)育能力影響較大，但仍有11.4%的受精卵可發(fā)育至2細胞胚胎期。此外，相關研究報道［22］指出，對母畜進行超數(shù)排卵處理后獲得的胚胎或卵子質量，會出現(xiàn)不同程度的畸形發(fā)育，且畸形率隨劑量的增大而增加，在PMSG、FSH和HMG 3種激素的處理下，PMSG處理后的胚胎畸形率最高，胚胎移植后妊娠率最低，且伴隨著高劑量外源激素的超數(shù)排卵處理，對受體母畜的移植效果都不理想。排除受體母畜的飼養(yǎng)管理或遺傳因素，分析可能的原因，是由于PMSG在母畜體內的半衰期較長，后效應嚴重，高劑量的外源激素使卵巢的“過刺激炎癥反應”加劇，卵子發(fā)育環(huán)境的變化導致排出卵子的結構被破壞。

外源激素的正確使用是實現(xiàn)超數(shù)排卵技術的根本，但激素含量也決定著母體整個生殖活動的調控。本試驗對獺兔注射50 IU PMSG和100 IU hCG的組合雖然能獲得大量優(yōu)質胚胎，但也無法避免畸形胚胎的產生。有研究表明［23］，是由于外源激素的刺激使得卵子發(fā)育環(huán)境異常所致。PMSG所具有的LH效應也會影響卵子的質量，最終導致精卵結合后胚胎發(fā)育的異常。對于畸形胚胎結構異常的變化程度是否和外源激素的劑量有關，還需進一步研究探討。

4 結論

在獺兔超數(shù)排卵處理中，高劑量的PMSG會使卵巢出現(xiàn)過刺激炎癥反應，降低超數(shù)排卵效果并導致胚胎畸形率增高，從而影響胚胎質量。在生產實踐中，建議使用50 IU PMSG+100 IU hCG的超排處理組合，可取得較好效果。