8種發(fā)酵茶茶多酚含量及抗氧化活性分析

翟淑紅，黃錦悅，周婷鈺，石 慧，陳 濤

（1.武漢設(shè)計工程學(xué)院 食品與生物科技學(xué)院，湖北 武漢 430205；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

發(fā)酵茶一般指在茶葉制作中經(jīng)過生物酶氧化發(fā)酵或者微生物發(fā)酵的茶[1]，是我國的特色資源[2]。發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)水解、淀粉遞減、青氣物質(zhì)以及芳香物質(zhì)不斷增加，最終構(gòu)成發(fā)酵茶特有的風(fēng)味及香氣。茶多酚約占茶葉干燥后質(zhì)量的14%～24%[3-4]，其主要成分兒茶素可以調(diào)節(jié)細(xì)胞、抗衰老及抗氧化[5]，可以通過作用于酶體系達(dá)到抗癌、抗突變的作用。茶多酚的含量對茶葉品質(zhì)本身有較大影響，也是茶葉獨特風(fēng)味形成不可缺少的一種物質(zhì)[6]。

自由基是具有非偶電子的基團或原子，自由基過量會導(dǎo)致機體正常機能損傷，誘發(fā)各種疾病，如神經(jīng)變性和癌癥[7-8]。很多非天然的抗氧化劑在某種程度上對機體都存在毒副作用[9]，而天然的抗氧化活性物質(zhì)毒性小且抗氧化效果顯著，對過氧化氫、超氧自由基、羥自由基等有良好的清除效果。亞硝酸鹽是一種常用的食品添加劑，可作為發(fā)色劑或抗菌劑使用，但過量攝入亞硝酸鹽可導(dǎo)致機體缺氧和急性中毒，此外亞硝酸鹽可以轉(zhuǎn)變?yōu)橹掳┪飦喯醢?，清除食品中過量的亞硝酸鹽是一條有效保健措施[10-12]。目前，國內(nèi)研究人員對茶葉的各項研究主要集中在紅茶、普洱茶、綠茶等[13]。綠茶收斂性物質(zhì)較多，雖然抗氧化性以及亞硝酸鹽清除效果較好，但對胃部有較強的刺激性，而發(fā)酵茶的部分收斂性物質(zhì)已經(jīng)被氧化酶氧化，相比較之下更溫和，對胃的刺激較小，且這些氧化產(chǎn)物對人體消化吸收也有幫助。普洱茶、滇紅茶、茯磚茶、青磚茶等是發(fā)酵茶著名種類，試驗選取上述4種發(fā)酵茶，研究其茶多酚含量及抗氧化性活性，為發(fā)酵茶的保健功能提供實驗依據(jù)，為發(fā)酵茶的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

普洱茶樣品（2種）、滇紅茶樣品（2種）、茯磚茶樣品（2種）、青磚茶樣品（2種）：市售。

檸檬酸、酒石酸鐵、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、氨基苯磺酸、磷酸氫二鈉、亞硝胺等（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV2150紫外可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；FA1004B分析天平：上海佑科儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 茶浸提液的制備

分別稱取8種發(fā)酵茶樣品各3 g于三角瓶中，加入30 mL沸水，于80 ℃恒溫浸提20 min，過濾，共浸提3次，合并浸提液，冷卻，定容于100 mL容量瓶中。將8種發(fā)酵茶進(jìn)行編號，分別為普洱茶樣品1（T1）、普洱茶樣品2（T2）、滇紅茶樣品1（T3）、滇紅茶樣品2（T4）、茯磚茶樣品1（T5）、茯磚茶樣品2（T6）、青磚茶樣品1（T7）、青磚茶樣品2（T8）。

1.3.2 茶多酚含量測定

參考文獻(xiàn)[14]，采取酒石酸鐵比色法，于波長540 nm處測定茶浸提液反應(yīng)體系的吸光度值，并計算茶多酚含量，其計算公式如下：

式中：A1為浸提液的吸光度值；A2為空白對照的吸光度值；M為發(fā)酵茶質(zhì)量，g；V為浸提液稀釋倍數(shù)；1.957為吸光度值等于0.50時，相當(dāng)于每毫升浸提液中含有1.957 mg茶多酚。

1.3.3 DPPH自由基清除率的測定

參考文獻(xiàn)[15-16]并進(jìn)行修改：取10支10 mL比色管，各加入0、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL、9 mL發(fā)酵茶浸提液，蒸餾水稀釋至刻度線即為不同濃度浸提液，待用。再取10支10mL的比色管分別吸取3mL0.1mmol/L的DPPH溶液置于其中，再加入1 mL不同含量的發(fā)酵茶浸提液，充分混勻，室溫避光反應(yīng)30 min后，測定吸光度值，并計算DPPH自由基清除率，其計算公式如下：

式中：A1為DPPH溶液加發(fā)酵茶浸提液的吸光度值；A2為發(fā)酵茶浸提液的吸光度值；A0為未加浸提液時DPPH溶液的吸光度值。

1.3.4 亞硝酸鹽清除率的測定

參考文獻(xiàn)[17]并稍作修改：在10支25 mL比色管中分別加入2.0 mL質(zhì)量濃度為5.0 μg/mL的NaNO2標(biāo)準(zhǔn)液，再分別加入0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL、0.9 mL的發(fā)酵茶浸提液，于37 ℃恒溫水浴反應(yīng)20 min，依次加入氨基苯磺酸等試劑，于最大吸收波長處測定吸光度值，并計算亞硝酸鹽清除率，其計算公式如下：

式中：A0為未加浸提液時NaNO2標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度值；A1為NaNO2標(biāo)準(zhǔn)液加發(fā)酵茶浸提液的吸光度值。

1.3.5 亞硝胺合成阻斷率的測定

參考文獻(xiàn)[17]并稍作修改：模擬人體胃液生理條件下（37 ℃，pH約為3.0）亞硝胺合成阻斷率測定。分別吸取最初制取的發(fā)酵茶浸提液0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL、0.9 mL于10支25 mL比色管中，依次加入檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液等試劑，最后于37 ℃條件下恒溫水浴反應(yīng)1 h，即得亞硝胺溶液，備用。

取10支10 mL比色管，分別吸取1.0 mL亞硝胺溶液置于比色管中，依次加入Na2CO3溶液等，于最大吸收波長處測定其吸光度值，并計算亞硝胺合成阻斷率，其計算公式如下：

式中：A0為以蒸餾水代替浸提液時亞硝胺溶液的吸光度值；A1為發(fā)酵茶浸提液加亞硝胺溶液的吸光度值。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)平行測定3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。利用Origin 8.0作圖，利用Excel對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵茶茶多酚含量測定

由圖1可知，8種發(fā)酵茶樣品中T4（滇紅茶樣品2）茶多酚含量最高，為10%；T7（青磚茶樣品2）最低，為3.4%。茶多酚含量從高到低依次為滇紅茶＞普洱茶＞茯磚茶＞青磚茶。由于發(fā)酵過程中茶多酚會被氧化，故發(fā)酵茶茶多酚含量較低，而青磚茶、茯磚茶、普洱茶屬于后發(fā)酵茶，發(fā)酵時間較滇紅茶長，故茶多酚含量比滇紅茶要低。

圖1 8種發(fā)酵茶的茶多酚含量Fig. 1 Tea polyphenols contents of 8 fermented teas

2.2 發(fā)酵茶抗氧化活性測定

DPPH自由基是一種化學(xué)活性不高的自由基，溶于無水乙醇后溶液體系呈紫色，還原劑（或稱自由基清除劑）能夠清除單電子[19]，使體系顏色變化。

由表1可知，T1（普洱茶樣品1）的DPPH自由基清除率隨添加量的增加呈先增大后減少再增大的趨勢；當(dāng)加入0.9 mL/mL T1時，DPPH自由基清除率達(dá)80.5%。T2（普洱茶樣品2）的DPPH自由基清除率隨浸提液的增加而增加；當(dāng)加入0.9 mL/mL T2（普洱茶樣品2）時，DPPH自由基清除率為72.9%，清除能力較好。T3（滇紅茶樣品1）和T4（滇紅茶樣品2）的DPPH自由基清除率均隨浸提液的增加而增加，但變化趨勢較平緩；當(dāng)加入0.9 mL/mL T3、T4時，DPPH自由基清除率分別為70.8%、77.1%，自由基清除能力較好；浸提液含量相同時，T4對DPPH自由基的清除率顯著高于T3（P＜0.05）。T5（茯磚茶樣品1）和T6（茯磚茶樣品2）的DPPH自由基清除率均隨浸提液的增加而增加；當(dāng)加入0.9 mL/mL T5時，自由基清除率為64.2%；當(dāng)加入0.8 mL/mLT6時，DPPH自由基清除率達(dá)78.4%，當(dāng)加入茶浸提液＞0.8 mL/mL后，自由基清除率基本不變；浸提液含量相同時，T5對DPPH自由基的清除率顯著高于T3（P＜0.05）。T7（青磚茶樣品1）和T8（青磚茶樣品2）的DPPH自由基清除率隨浸提液的增加而增加。當(dāng)加入0.7 mL/mL T7時，DPPH自由基清除率達(dá)74.9%，加入茶浸提液＞0.7 mL/mL后清除率變化趨于平緩；當(dāng)加入0.9 mL/mL T8時，DPPH自由基清除率達(dá)71.1%。

表1 8種發(fā)酵茶浸提液對DPPH自由基清除率的影響Table 1 Effects of extracts of 8 fermented teas on DPPH radical scavenging rate

比較表1中T1～T8對DPPH自由基清除率的影響可知，0.1 mL/mL發(fā)酵茶浸提液對DPPH自由基的清除率均＞50%，且隨浸提液含量的增加而增加，但變化趨勢較平緩，不呈線性關(guān)系。

2.3 發(fā)酵茶亞硝酸鹽清除率的測定

NaNO2中的N元素處于中間價態(tài)，既可以被氧化也可以被還原，在一定條件下，可以生成具有致癌作用的N-亞硝基化合物[20]，對人體健康具有潛在威脅。目前，常用于檢測亞硝酸鹽含量的方法主要有固相萃取光譜法、離子色譜法以及分光光度法等[21]。

2.3.1 普洱茶亞硝酸鹽清除率的測定

由圖2可知，隨著普洱茶浸提液的增加，亞硝酸鹽清除率逐漸增加。當(dāng)加入0.9 mL/mL T1時，亞硝酸鹽清除率為33.4%；當(dāng)加入0.9 mL/mL T2時，亞硝酸鹽清除率為71.0%，具有較好的亞硝酸鹽清除能力。

圖2 普洱茶浸提液對亞硝酸鹽清除率的影響Fig. 2 Effect of extract of Pu'er tea on nitrite scavenging rate

2.3.2 滇紅茶亞硝酸鹽清除率的測定

由圖3可知，隨著滇紅茶浸提液的增加，亞硝酸鹽清除率逐漸增加，當(dāng)加入0.9 mL/mL T3時，亞硝酸鹽清除率為38%；當(dāng)加入0.9 mL/mL T4時，亞硝酸鹽清除率為58.2%，具有較好的亞硝酸清除能力。

圖3 滇紅茶浸提液對亞硝酸鹽清除率的影響Fig. 3 Effect of extract of Yunnan black tea on nitrite scavenging rate

2.3.3 茯磚茶亞硝酸鹽清除率的測定

由圖4可知，隨著茯磚茶浸提液的增加，亞硝酸鹽清除率逐漸增加。當(dāng)加入0.9 mL/mL T5、T6時，亞硝酸鹽清除率分別為38.9%、56.2%。

圖4 茯磚茶浸提液對亞硝酸鹽清除率的影響Fig. 4 Effect of extract of Fuzhuan tea on nitrite scavenging rate

2.3.4 青磚茶亞硝酸鹽清除率的測定

由圖5可知，隨著青磚茶浸提液的增加，亞硝酸鹽清除率逐漸增加。當(dāng)加入0.9 mL/mL T7時，亞硝酸鹽清除率為31.3%；當(dāng)茶浸提液含量到0.8 mL/mL后，清除率變化趨于平緩。在加入T8浸提液體積＞0.3 mL/mL之后，亞硝酸鹽清除率增加趨勢較快，當(dāng)加入0.9 mL/mL T8時，亞硝酸鹽清除率為53.2%。

圖5 青磚茶浸提液對亞硝酸鹽清除率的影響Fig. 5 Effect of extract of Qingzhuan tea on nitrite scavenging rate

綜上可知，亞硝酸鹽清除率隨茶浸提液含量的增加而增加，且線性關(guān)系較好，但當(dāng)加入茶浸提液含量一定時，亞硝酸鹽清除率變化趨勢逐漸趨于平緩，這與梁婧瑤等[22]研究結(jié)果相同。

2.4 發(fā)酵茶亞硝胺合成阻斷率測定

2.4.1 普洱茶亞硝胺合成阻斷率測定

由圖6可知，隨著普洱茶浸提液含量增加，亞硝胺合成阻斷率逐漸增加。當(dāng)加入T1、T2含量＞0.4 mL/mL之后，亞硝胺合成阻斷率增加趨勢較快，當(dāng)加入0.9 mL/mL T1、T2時，亞硝胺合成阻斷率分別為94.9%、85%。

圖6 普洱茶浸提液對亞硝胺合成阻斷率的影響Fig. 6 Effect of extract of Pu'er tea on blocking rate of nitrosamine synthesis

2.4.2 滇紅茶亞硝胺合成阻斷率測定

由圖7可知，隨著滇紅茶浸提液含量增加，亞硝胺合成阻斷率逐漸增加；前期亞硝胺合成阻斷率增加趨勢較快，在加入茶浸提液含量＞0.4 mL/mL之后，變化趨勢趨于平緩，當(dāng)加入0.8 mL/mL T3時，亞硝胺合成阻斷率為94.5%，可有效阻斷了亞硝胺合成，超過0.8 mL/mL后，阻斷率變化較平緩。當(dāng)加入0.7 mL/mL T4時，亞硝胺合成阻斷率為70.4%，超過0.7 mL/mL之后，變化趨勢趨于平緩。

圖7 滇紅茶浸提液對亞硝胺合成阻斷率的影響Fig. 7 Effect of extract of Yunnan black tea on blocking rate of nitrosamine synthesis

2.4.3 茯磚茶亞硝胺合成阻斷率測定

由圖8可知，隨著茯磚茶浸提液含量增加，亞硝胺合成阻斷率逐漸增加。在加入0.3 mL/mL T5前，亞硝胺合成阻斷率增加趨勢較快，當(dāng)加入0.7 mL/mL T5時，亞硝胺合成阻斷率為90%，說明T5有效地阻斷率了亞硝胺合成，超過0.7 mL/mL之后變化趨于平緩。在加入0.3 mL/mL T6后，亞硝胺合成阻斷率變化最快，在超過0.7 mL/mL之后，變化趨勢趨于平緩，當(dāng)加入0.9 mL/mL茶浸提液時，亞硝胺合成阻斷率為72.9%。

圖8 茯磚茶浸提液對亞硝胺合成阻斷率的影響Fig. 8 Effect of extract of Fuzhuan tea on blocking rate of nitrosamine synthesis

2.4.4 青磚茶亞硝胺合成阻斷率測定

由圖9可知，隨著青磚茶浸提液含量增加，亞硝胺合成阻斷率逐漸增加。在加入0.3 mL/mL T7前，亞硝胺合成阻斷率變化趨勢較快，當(dāng)加入0.7 mL/mL T7時，亞硝胺合成阻斷率為81.1%，亞硝胺合成阻斷能力良好，超過0.7 mL/mL后阻斷率變化趨于平緩。在加入0.5 mL/mL T8后，亞硝胺合成阻斷率變化趨勢最快，超過0.6 mL/mL后變化趨勢趨于平緩，當(dāng)加入0.6 mL/mL T8時，亞硝胺合成阻斷率為69.9%。

圖9 青磚茶浸提液對亞硝胺合成阻斷率的影響Fig. 9 Effect of extract of Qingzhuan tea on blocking rate of nitrosamine synthesis

3 討論

發(fā)酵茶是根據(jù)發(fā)酵程度不同來進(jìn)行分類[23]。發(fā)酵茶在其制作過程中葉綠素、茶多酚等受到一定程度的破壞，主要有效成分為咖啡因和沒食子酸，故較未經(jīng)發(fā)酵的茶而言，發(fā)酵茶茶多酚含量略低，這與吳警[24]研究結(jié)果相同。由結(jié)果分析可知，發(fā)酵茶的抗氧化活性與茶多酚含量有一定的相關(guān)性，但并不是完全呈正相關(guān)，如實驗中茶多酚含量最高的是滇紅茶，但DPPH自由基清除率最高的卻是普洱茶，這可能是由于茶葉中富含多種抗氧化活性成分，其總抗氧化活性與活性成分之間的協(xié)同作用密切相關(guān)。

發(fā)酵茶具有良好的亞硝酸鹽清除能力以及亞硝胺合成阻斷能力，具有潛在抗癌能力。發(fā)酵茶亞硝酸鹽清除能力及亞硝胺合成阻斷能力與加入茶浸提液體積呈線性相關(guān)，且這兩種能力與茶多酚含量也有一定的相關(guān)性，也有研究表明抗氧化劑對亞硝酸鹽清除能力較好[25]。

4 結(jié)論

實驗結(jié)果表明，8種發(fā)酵茶中滇紅茶樣品2浸提液的茶多酚含量最高，為10%，青磚茶樣品2最低，為3.4%。8種發(fā)酵茶浸提液含量為0.9 mL/mL時，普洱茶樣品1的DPPH自由基清除率較高，為80.5%，茯磚茶樣品1清除率較低，為64.2%；普洱茶樣品2亞硝酸鹽清除率較高，為71.0%，青磚樣品1清除率較低，為31.3%；滇紅茶樣品1亞硝胺合成阻斷率較高，為95%，青磚茶樣品2阻斷率較低，為69.9%；4種發(fā)酵茶的抗氧化活性、亞硝酸鹽清除能力及亞硝胺合成阻斷能力與茶多酚含量有關(guān)但并不完全呈正相關(guān)。

綜上可知，4種發(fā)酵茶中茶多酚含量較高且抗氧化能力、亞硝酸鹽清除能力及阻斷亞硝胺合成能力最好的是普洱茶和滇紅茶，在保健食品開發(fā)方面具有較大的潛力。實驗綜合分析了發(fā)酵茶抗氧化活性及潛在抗癌能力，為后續(xù)開發(fā)功能性茶飲料及發(fā)酵茶的深入研究提供了實驗依據(jù)。