含香蘭素冬蟲夏草發(fā)酵液的制備工藝研究

李力群，喬月梅，郭春生，郝 捷，張善林，紀(jì)旭東，田 數(shù)，柴 穎

（內(nèi)蒙古昆明卷煙有限責(zé)任公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020）

香蘭素（vanillin）又名香草醛，最早發(fā)現(xiàn)于墨西哥蘭科植物香莢蘭的豆莢中[1]。其是世界上產(chǎn)量最大的香料，具有抗菌作用[2]，能夠較好的賦予產(chǎn)品特殊的奶香風(fēng)味[3]，廣泛應(yīng)用于食品、日用化工、醫(yī)藥、煙草及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中[4-8]。目前市售的香蘭素絕大部分通過亞硝基法和乙醛酸法化學(xué)合成[4-6]，香蘭素不僅有天然提取和化學(xué)合成途徑，還可以通過微生物轉(zhuǎn)化法合成。研究發(fā)現(xiàn)，粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）轉(zhuǎn)化異丁香酚和丁香酚產(chǎn)香蘭素[9]，諾卡氏自養(yǎng)菌（Nocardiasp.）DSM 43100和菌株B2共同作用下將阿魏酸轉(zhuǎn)化為香蘭素[10]。微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)香蘭素主要通過在發(fā)酵過程中添加適宜底物促進(jìn)香蘭素的生產(chǎn)，如異丁香酚、丁香酚和阿魏酸等，但利用葡萄糖轉(zhuǎn)化生產(chǎn)香蘭素的菌株少見報道。

利用香氣成分提高產(chǎn)品的感官品質(zhì)是一種常用的技術(shù)手段。我國名貴中藥材冬蟲夏草雖具有補(bǔ)而不峻、溫而不火、滋而不膩的藥效[11]，且其含有的蟲草多糖[13]，具有清除羥基、超氧陰離子、脂質(zhì)過氧自由基及過氧化氫的能力[12]，但因其具有特殊的氣味需進(jìn)行賦香來增加其應(yīng)用范圍。

本研究期望篩選能夠利用冬蟲夏草中的葡萄糖產(chǎn)香蘭素的微生物，制備含香蘭素的冬蟲夏草料液，賦予冬蟲夏草相關(guān)產(chǎn)品特殊的奶香味，旨在擴(kuò)大冬蟲夏草應(yīng)用領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗樣品

高溫大曲、酒醅、醬醅及土壤：分別采自內(nèi)蒙古地區(qū)的酒廠、農(nóng)家和校園；冬蟲夏草：青海三神牛貿(mào)易公司。

1.1.2 試劑

葡萄糖、磷酸氫二銨、氯化鈉（均為分析純）：天津市智遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；胰蛋白胨、酵母提取粉、瓊脂（均為生化試劑）、乙二胺四乙酸二鈉（ethylene diamine tetraacetic acid-2Na，EDTA-2Na）、結(jié)晶紫、三羥甲基氨基甲烷（均為分析純）：廣東桓凱微生物科技有限公司；甲醇、三氟乙酸（均為色譜純）：天津市廣大化學(xué)試劑有限公司；香蘭素、香草酸（均為色譜純）：上海麥克林生化科技有限公司；瓊脂粉（生化試劑）：北京康倍斯科技有限公司；天根DP302-02試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

富集液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，酵母提取物3 g/L，瓊脂17 g/L。120 ℃滅菌20 min。

固體平板分離培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，酵母提取物5 g/L，瓊脂17 g/L。120 ℃滅菌20 min。

種子液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，酵母提取物5 g/L。120 ℃滅菌20 min。

葡萄糖發(fā)酵液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，酵母提取物3 g/L，葡萄糖30 g/L。120 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

HCB-1300V潔凈工作臺、THZ-98C恒溫振蕩器、DHG-9053A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SX-500全自動高壓滅菌鍋：上海新普儀器設(shè)備有限公司；真空抽濾裝置：天津津騰實驗設(shè)備有限公司；3-18KS Sigma高速離心機(jī)：上海成貫儀器有限公司；U3000高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀、Veriti96聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；7890氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國安捷倫科技有限公司；Synergy H1酶標(biāo)儀：美國伯騰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高產(chǎn)香蘭素微生物的篩選

根據(jù)文獻(xiàn)報道和數(shù)據(jù)庫檢索，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬可能利用葡萄糖轉(zhuǎn)化產(chǎn)生香蘭素。因此，本研究先篩選芽孢桿菌，再以葡萄糖為底物，篩選高產(chǎn)香蘭素的菌株。稱取樣品20 g，研磨后，用180 mL生理鹽水洗滌，150 r/min振蕩混勻30 min，混勻后在80 ℃水浴鍋中恒溫30 min。水浴后吸取5 mL液體接種于50 mL富集液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、150 r/min搖床富集培養(yǎng)24 h。富集培養(yǎng)結(jié)束后，用移液槍吸取1 mL菌懸液至9 mL生理鹽水的試管中稀釋，然后依次稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6菌懸液。吸取10-6的菌懸液涂布于固體平板分離培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。觀察菌落形態(tài)，挑取單一菌落接種于固體平板分離培養(yǎng)基中37 ℃再培養(yǎng)24 h，將純化后的單一菌落保藏于固體培養(yǎng)基中，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 高產(chǎn)香蘭素微生物的鑒定

取純化后的單菌落于5 mL試管種子培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min培養(yǎng)16 h。采用天根DP302-02試劑盒提取菌株的基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）。選擇25 μL聚合酶鏈反應(yīng)體系，利用通用引物（27F、1492R）擴(kuò)增菌種的16S rDNA，擴(kuò)增產(chǎn)物取1 μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳結(jié)果，送測序公司進(jìn)行測序。

根據(jù)測序得到的16S rDNA序列，利用美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）在線數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列檢索。作最大同源性比對分析，使用軟件MEGA-X中的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，同時進(jìn)行重復(fù)次數(shù)為1 000次的Bootstrap測試，確定目標(biāo)菌株的分類地位。

1.3.3 冬蟲夏草發(fā)酵液制備工藝優(yōu)化單因素試驗

發(fā)酵時間對香蘭素含量的影響：配制冬蟲夏草與葡萄糖發(fā)酵液體培養(yǎng)基的料液比為1∶40（g∶mL）、裝液量為20%，調(diào)pH7.0后121 ℃滅菌15 min，接種10%的種子液，200 r/min、43 ℃振蕩培養(yǎng)10 d，每天取樣測定發(fā)酵液中香蘭素的產(chǎn)量。

接種量對香蘭素含量的影響：配制冬蟲夏草與葡萄糖發(fā)酵液體培養(yǎng)基的料液比為1∶40、裝液量為20%，調(diào)pH7.0后121 ℃滅菌15 min，分別接種5.0%、7.5%、10.0%、12.5%、15.0%的種子液，200 r/min、43 ℃振蕩培養(yǎng)9 d后測定發(fā)酵液中香蘭素的產(chǎn)量。

料液比對香蘭素含量的影響：分別配制冬蟲夏草與葡萄糖發(fā)酵液體培養(yǎng)基料液比為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g∶mL），裝液量為20%，調(diào)pH7.0后121 ℃滅菌15 min，接種10%的種子液，200 r/min、43 ℃振蕩培養(yǎng)9 d后測定發(fā)酵液中香蘭素的產(chǎn)量。

1.3.4 冬蟲夏草發(fā)酵液制備工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken設(shè)計影響發(fā)酵液中香蘭素含量的3個因素接種量（A）、料液比（B）、發(fā)酵時間（C）進(jìn)行優(yōu)化，分別以-1、0、+1進(jìn)行水平編碼，以發(fā)酵液中香蘭素產(chǎn)量為響應(yīng)值（Y）設(shè)計3因素3水平響應(yīng)面試驗，響應(yīng)曲面試驗因素與水平見表1。

表1 冬蟲夏草發(fā)酵液制備工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design for optimization of preparation process of Cordyceps sinensis fermentation broth

1.3.5 測定方法

生長量測定：取發(fā)酵液1 mL，加入2 mL蒸餾水稀釋3倍，以不含菌液的發(fā)酵培養(yǎng)基作為空白參比，在波長600 nm處用紫外可見分光光度計測定發(fā)酵液的吸光度值（OD600nm值）。

香蘭素含量測定：參照趙建芬等[14]的方法，利用高效液相色譜法測定發(fā)酵液中香蘭素的含量。香蘭素標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取香蘭素標(biāo)品，加入體積分?jǐn)?shù)40%甲醇溶液配制成質(zhì)量濃度分別為100 mg/L、80 mg/L、60 mg/L、40 mg/L、20 mg/L、2 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。樣品前處理：取0.5 mL發(fā)酵液使用甲醇稀釋3倍，搖床中200 r/min振蕩1 h萃取，10 000 r/min離心5 min后，收集上清備用。HPLC條件：Thermo Scientific Hypersil GOLD HPLC色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為0.5%冰乙酸∶無水甲醇=60∶40（V/V），流速0.5 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測波長280 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)香蘭素微生物的篩選及鑒定

本研究從大曲、酒醅、醬醅和土壤中初篩獲得102株芽孢桿菌，以葡萄糖為底物復(fù)篩后，發(fā)現(xiàn)菌株B4-9產(chǎn)香蘭素含量最高，香蘭素產(chǎn)量為3.54 mg/L。經(jīng)過擴(kuò)增和測序后，構(gòu)建菌株B4-9的16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，菌株B4-9與Bacillus subtilisIISI-4（MK367797.1）和B.subtilisDK15（MT534533.1）處在同一分支上，置信水平為99.7%?；谝陨?，鑒定菌株B4-9為芽孢桿菌屬中的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

圖1 基于16S rDNA基因序列高產(chǎn)香蘭素菌株B4-9的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Phylogenetic tree of vanillin-producing strain B4-9 based on 16S rDNA gene sequences

2.2 含香蘭素冬蟲夏草發(fā)酵液的制備工藝優(yōu)化單因素試驗

2.2.1 發(fā)酵時間對菌株B4-9產(chǎn)香蘭素的影響

由圖2可知，隨著發(fā)酵時間的延長，冬蟲夏草發(fā)酵液的菌體生長量及香蘭素產(chǎn)量均呈先增加后減少的趨勢。當(dāng)發(fā)酵到第9天時，香蘭素產(chǎn)量達(dá)到最大，為4.3 mg/L；菌體生長量達(dá)到最大，OD600nm值為1.24。繼續(xù)延長發(fā)酵時間，香蘭素產(chǎn)量及菌體生長量均降低。因此選擇適宜的發(fā)酵時間為9 d。

圖2 發(fā)酵時間對菌株B4-9生長及香蘭素產(chǎn)量的影響Fig. 2 Effect of fermentation time on growth and vanillin yield of strain B4-9

2.2.2 接種量對菌株B4-9產(chǎn)香蘭素的影響

由圖3可知，隨著接種量的增加，發(fā)酵液中的香蘭素產(chǎn)量也不斷升高，當(dāng)接種量為10%時，香蘭素產(chǎn)量達(dá)到最大為3.9 mg/L。當(dāng)接種量＞10%后，發(fā)酵液中的香蘭素產(chǎn)量逐漸降低。菌體生長量也隨著接種量的增加呈現(xiàn)先增加減小的趨勢，在接種量為10%時達(dá)到最大的OD600nm值（1.15）。因此，選擇10%為最佳接種量。

圖3 接種量對菌株B4-9生長及香蘭素產(chǎn)量的影響Fig. 3 Effect of inoculum on growth and vanillin yield of strain B4-9

2.2.3 料液比對菌株B4-9產(chǎn)香蘭素的影響

冬蟲夏草中含有多種活性抑菌物質(zhì)，如蟲草素、蟲草酸。一定濃度的蟲草素對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌具有明顯的抑制作用[8]。因此，適宜的料液比是制備含香蘭素的冬蟲夏草發(fā)酵液的關(guān)鍵因素之一。由圖4可知，高料液比對菌株B4-9的生長具有一定抑制，發(fā)酵液中香蘭素產(chǎn)量較低。當(dāng)料液比為1∶30（g∶mL）時，菌株B4-9生長較旺盛（OD600nm值為1.02），發(fā)酵液中的香蘭素產(chǎn)量最高，為4.2 mg/L。當(dāng)料液比＜1∶30（g∶mL）時，發(fā)酵液中的香蘭素產(chǎn)量逐漸降低。高濃度的冬蟲夏草對菌株B4-9具有抑制作用。低濃度的冬蟲夏草由于所含的葡萄糖和營養(yǎng)物質(zhì)低，導(dǎo)致菌株生長緩慢，生成香蘭素產(chǎn)量降低。因此，選擇料液比1∶30（g∶mL）為菌株B4-9產(chǎn)香蘭素的最適料液比。

圖4 料液比對菌株B4-9生長及香蘭素產(chǎn)量的影響Fig. 4 Effect of solid-liquid ratio on growth and vanillin yield of strain B4-9

2.3 含香蘭素冬蟲夏草發(fā)酵液制備工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken試驗設(shè)計，以影響香蘭素的3個因素接種量（A）、料液比（B）和發(fā)酵時間（C）為自變量，以冬蟲夏草發(fā)酵液中的香蘭素含量為響應(yīng)值，設(shè)計3因素3水平的Box-Behnken試驗，考察各因素對菌株B4-9產(chǎn)香蘭素的影響。響應(yīng)面試驗設(shè)計方案和結(jié)果見表2，回歸模型方差分析見表3。

表2 冬蟲夏草發(fā)酵液制備工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of Box-Behnken experiments for optimization of preparation process of Cordyceps sinensis fermentation broth

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

利用Design-Expert 10.0.3軟件對Box-Behnken設(shè)計結(jié)果進(jìn)行分析后得出，3種因素與菌株B4-9產(chǎn)香蘭素含量的二次多項回歸模擬方程為：Y=4.58+0.064A+0.073B+0.076C+0.075AB-0.012AC+0.015BC-0.45A2-0.61B2-0.41C2。通過對模型分析發(fā)現(xiàn)，模型顯著（P＜0.05），失擬項不顯著（P＞0.05），能夠擬合試驗結(jié)果。模型決定系數(shù)R2=0.991 7與校正決定系數(shù)R2Adj=0.9810，能正確反映98.10%香蘭素產(chǎn)量的變化。因此，模型可用于優(yōu)化菌株B4-9產(chǎn)香蘭素的工藝優(yōu)化。

發(fā)酵時間、料液比和接種量間交互作用對菌株B4-9產(chǎn)香蘭素影響的響應(yīng)面及等高線見圖5。

圖5 料液比、發(fā)酵時間及接種量間交互作用對菌株B4-9產(chǎn)香蘭素影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig. 5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between solid-liquid ratio,fermentation time and inoculum on vanillin yield by strain B4-9

由圖5可知，在發(fā)酵時間為9 d、冬蟲夏草料液比為1∶30（g∶mL）的條件下，冬蟲夏草發(fā)酵液中香蘭素的產(chǎn)量隨接種量的增大而先增大后減小，且接種量在9.6%～10.7%范圍內(nèi)，香蘭素的產(chǎn)量均＞4.4 mg/L。在發(fā)酵時間為9 d、接種量為10%的條件下，冬蟲夏草發(fā)酵液中香蘭素的產(chǎn)量隨著料液比的不斷變化而先增大后減小。在冬蟲夏草料液比為1∶30（g∶mL）、接種量為10%的條件下，發(fā)酵時間為8.5～9.7 d時，冬蟲夏草發(fā)酵液中香蘭素含量均＞4.4 mg/L。發(fā)酵時間過短，發(fā)酵液中香蘭素積累較少，發(fā)酵時間過長，香蘭素可能被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化。

利用Design-Expert 10.0.3軟件對模型的最高值進(jìn)行預(yù)測后，得到發(fā)酵的最佳工藝為接種量10.07%，料液比1∶30.3（g∶mL），發(fā)酵時間9.1 d，在此工藝條件下，冬蟲夏草發(fā)酵液中香蘭素的理論預(yù)測值為（4.588±0.181）mg/L。為了滿足實際發(fā)酵工藝，將最優(yōu)發(fā)酵條件調(diào)整成接種量10%，料液比1∶30（g∶mL），發(fā)酵時間9 d。在此條件下進(jìn)行5組平行試驗，得到發(fā)酵液中香蘭素平均含量為4.6 mg/L。

3 討論

微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)香蘭素最關(guān)鍵的是菌種的選育，優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、穩(wěn)定的菌種是生產(chǎn)效率的決定性因素。目前通過微生物法合成香蘭素的底物主要有丁香酚、異丁香酚和阿魏酸[15]。以丁香酚或異丁香酚為底物合成香蘭素的菌株有惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）[16]、芽孢桿菌（Bacillussp.）[17]、紡錘芽孢桿菌（Bacillus fusiformis）[18]等，但丁香酚對于微生物的生長具有抑制作用[19]。阿魏酸轉(zhuǎn)化香蘭素最為常見的底物，主要菌株有黑曲霉（Aspergillus niger）[20]、食酸假單胞菌（Pseudomonas acidovorans）[21]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[22]等，通過一步法或兩步法合成香蘭素，但高濃度的阿魏酸在發(fā)酵中會降低香蘭素的含量[23]。

微生物合成香蘭素的途徑從最基礎(chǔ)的糖酵解和磷酸戊糖途徑開始，經(jīng)過莽草酸代謝途徑、苯丙氨酸代謝途徑和阿魏酸代謝途徑，最后經(jīng)過香蘭素次生代謝產(chǎn)物的生物合成途徑合成香蘭素。所以作為最常見的發(fā)酵原料葡萄糖也是香蘭素合成的底物之一。目前有關(guān)利用葡萄糖為碳源，微生物一步合成香蘭素的研究鮮有報道，僅限于基因工程大腸桿菌中通過補(bǔ)料發(fā)酵法。利用重組大腸桿菌將葡萄糖先轉(zhuǎn)化成香蘭素酸，再經(jīng)粗脈胞菌中分離的芳醛脫氫酶催化還原成香蘭素[24]。

冬蟲夏草含有多種成分，在眾多領(lǐng)域得到了應(yīng)用。如在固相雙發(fā)酵中可以提高發(fā)酵人參的穩(wěn)定性[25]，在與煙葉的發(fā)酵中可以改善煙葉感官質(zhì)量[26]。本研究中，篩選的菌株具以葡萄糖為底物產(chǎn)香蘭素的能力，可利用冬蟲夏草本身含有的葡萄糖制備天然香蘭素，這為進(jìn)一步開發(fā)奶香型冬蟲夏草產(chǎn)品奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究篩選獲得一株能夠在冬蟲夏草發(fā)酵液中合成香蘭素的菌株B4-9，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。在單因素試驗的研究基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面優(yōu)化得到菌株B4-9發(fā)酵冬蟲夏草產(chǎn)香蘭素的工藝為料液比1∶30（g∶mL）、裝液量20%、pH 7、接種量10%、培養(yǎng)溫度43 ℃、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，發(fā)酵時間9 d時，在此條件下，香蘭素產(chǎn)量為4.6 mg/L。