瀉肺利水方醇提物不同給藥途徑對斑馬魚心力衰竭模型心功能的影響*

龔韜 ，佟彤 ，周德勇 ，嚴文利 ，夏波 ，楊怡雯 ，曹慧卓 ，劉紅旭

（1.北京市中醫(yī)藥研究所，北京 100035；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010；3.杭州環(huán)特生物科技股份有限公司，杭州 310051）

心力衰竭是指由于心臟發(fā)生了結(jié)構(gòu)和（或）功能異常，損害了心室充盈和（或）射血能力而導(dǎo)致的復(fù)雜臨床綜合征，是心血管疾病的終末期表現(xiàn)和最主要的死亡原因[1]，發(fā)病率仍在增長，已成為人類較為關(guān)注的心血管疾病之一。首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院許心如教授在國內(nèi)率先提出“瀉肺利水法”治療心力衰竭，以《金匱要略》葶藶大棗瀉肺湯和防己黃芪湯為主方組成心力衰竭系列合劑，用于心力衰竭病的治療并取得了良好的臨床療效[2]。在此基礎(chǔ)上，北京中醫(yī)醫(yī)院心內(nèi)科劉紅旭主任根據(jù)多年臨床經(jīng)驗，進一步對處方進行了精簡化裁，形成了黃芪、葶藶子、桑白皮等5味藥組成的瀉肺利水方，用于臨床治療。本研究采用鹽酸維拉帕米誘導(dǎo)的心力衰竭斑馬魚模型，評價瀉肺利水方醇提物不同給藥途徑對斑馬魚心功能的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物 瀉肺利水方由黃芪6 g、南葶藶子6 g、桑白皮3 g、防己3 g和香加皮6 g組成，其醇提物（批號20210330）為70%乙醇提取物（1 g 70%乙醇提取物相當于5.62 g生藥），由北京市中醫(yī)藥研究所中藥化學(xué)室提供。瀉肺利水方醇提物注射給藥，用二甲基亞砜（DMSO）配制成100 mg/mL母液，臨用時按需稀釋，-20℃儲存；瀉肺利水方醇提物水溶給藥，用標準稀釋水配制成2.00 mg/mL母液，現(xiàn)配現(xiàn)用。復(fù)方丹參滴丸，棕色滴丸，批號200749，天士力醫(yī)藥集團股份有限公司，陰涼儲存；臨用時用標準稀釋水配制成20.0 mg/mL母液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 實驗動物 野生型AB品系斑馬魚，以自然成對交配繁殖方式進行。年齡為受精后2 d（2 dpf）的斑馬魚用于樣品心力衰竭改善功效最大檢測劑量（MTD）和最大檢測濃度（MTC）測定及其功效評價（表型和血流動力學(xué)）。斑馬魚均飼養(yǎng)于28℃的養(yǎng)魚用水中（水質(zhì)：每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導(dǎo)率為 450～550 μS/cm；pH 為 6.5～8.5；硬度為50～100 mg/L CaCO3），由杭州環(huán)特生物科技股份有限公司養(yǎng)魚中心繁殖提供，實驗動物使用許可證號為：SYXK（浙）2012-0171，飼養(yǎng)管理符合國際AAALAC認證（認證編號：001458）的要求。

1.3 儀器與主要試劑 解剖顯微鏡（SZX7，OLYMPUS公司，日本）；CCD相機（VertA1，上海土森視覺科技有限公司，中國）；精密電子天平（CP214，OHAUS公司，美國）；心跳血流分析儀（ZebraBlood 3.4，ViewPoint Life Sciences公司，法國）。

DMSO，批號30072418，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；鹽酸維拉帕米（批號K1629078）、甲基纖維素（批號B2006074），均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 最大檢測劑量（MTD）和最大檢測濃度（MTC）測定 隨機選取2 dpf野生型AB品系斑馬魚于6孔板中，每孔（實驗組）均處理30尾斑馬魚。分別靜脈竇注射和水溶給予樣品，劑量和濃度見表1。同時分別設(shè)置正常對照組和模型對照組，每孔容量為3 mL。樣品處理4 h后，除正常對照組外，其余各實驗組均水溶給予鹽酸維拉帕米建立斑馬魚心力衰竭模型。28℃處理0.5 h后，測定樣品對模型斑馬魚的MTD和MTC。

1.4.2 心力衰竭改善功效評價（表型） 隨機選取2dpf野生型AB品系斑馬魚于6孔板中，每孔（實驗組）均處理30尾斑馬魚。分別靜脈竇注射和水溶給予樣品，劑量和濃度見表2、3。陽性對照復(fù)方丹參滴丸250μg/mL濃度，同時設(shè)置正常對照組和模型對照組，每孔容量為3 mL。樣品處理4 h后，除正常對照組外，其余各實驗組均水溶給予鹽酸維拉帕米建立斑馬魚心力衰竭模型。28℃處理0.5 h后，每個實驗組隨機選取10尾斑馬魚置于解剖顯微鏡下拍照，使用NIS-Elements D 3.20高級圖像處理軟件采集數(shù)據(jù)，分析斑馬魚心臟面積和靜脈淤血面積，以該指標的統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果評價樣品心力衰竭改善功效。

1.4.3 心力衰竭改善功效評價（血流動力學(xué)） 隨機選取2 dpf野生型AB品系斑馬魚于6孔板中，每孔（實驗組）均處理30尾斑馬魚。分別靜脈竇注射和水溶給予樣品，劑量和濃度見表4、5。陽性對照復(fù)方丹參滴丸250 μg/mL濃度，同時設(shè)置正常對照組和模型對照組，每孔容量為3 mL。樣品處理4 h后，除正常對照組外，其余各實驗組均水溶給予鹽酸維拉帕米建立斑馬魚心力衰竭模型。28℃處理0.5 h后，每個實驗組隨機選取10尾斑馬魚置于心跳血流分析儀下錄制視頻，使用ViewPoint Application Manager軟件采集數(shù)據(jù)，分析斑馬魚血流速度和心輸出量，以該指標的統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果評價樣品心力衰竭改善功效。

1.4.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗結(jié)果采用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。P<0.05表明差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTD和MTC測定 各組斑馬魚均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，結(jié)果見表1。瀉肺利水方醇提物對于心力衰竭斑馬魚注射給藥的最大耐受給藥劑量為100 ng/尾；水溶給藥濃度為1 000 μg/mL和2 000 μg/mL時，給藥組較模型對照組狀態(tài)差，因此水溶給藥的最大耐受給藥濃度為500 μg/mL。故本研究中采用100、50、25 ng/尾作為注射給藥的高、中、低劑量組的干預(yù)劑量；采用500、250、125 μg/mL作為水溶給藥的高、中、低劑量組的干預(yù)濃度。

表1 心力衰竭改善功效劑量摸索實驗結(jié)果Tab.1 Experimental results of exploring effective dose for improving heart failure

2.2 心力衰竭改善功效評價（表型） 瀉肺利水方醇提物注射給藥對斑馬魚均具有明顯的心力衰竭改善功效，主要表現(xiàn)為對心臟面積和靜脈淤血面積有明顯的改善，低、中、高劑量組在心臟面積方面的改善率分別為33%、41%、34%，在靜脈淤血面積方面的改善率分別為44%、57%、56%。水溶給藥對心臟面積和靜脈淤血面積改善不明顯，低、中、高劑量組在心臟面積方面的改善率分別為-5%、7%、28%，在靜脈淤血面積方面的改善率分別為-18%、-6%、-1%。詳見表2、3。樣品處理后斑馬魚心臟面積與靜脈淤血面積典型圖見圖1。

圖1 樣品處理后斑馬魚心臟面積與靜脈淤血面積典型圖Fig.1 Typical diagram of heart area and venous congestion area of zebrafish after sample treatment

表2 樣品心臟面積改善功效評價實驗結(jié)果（±s）Tab.2 Experimental results of evaluation on the effect of sample heart area improvement（±s） 像素

表2 樣品心臟面積改善功效評價實驗結(jié)果（±s）Tab.2 Experimental results of evaluation on the effect of sample heart area improvement（±s） 像素

注：與模型對照組（水溶）比較，**P<0.01；與模型對照組（注射）比較，##P<0.01。

組別 動物數(shù) 濃度/劑量 心臟面積正常對照組 10 - 9 936±335**##模型對照組（水溶） 10 - 15 237±436模型對照組（注射） 10 - 15 966±404復(fù)方丹參滴丸 10 250 μg/mL 12 090±466**##瀉肺利水方醇提物注射給藥 10 25.0 ng/尾 14 001±378##10 50.0 ng/尾 13 470±343##10 100 ng/尾 13 936±305##瀉肺利水方醇提物水溶給藥 10 125 μg/mL 15 517±352 10 250 μg/mL 14 860±649 10 500 μg/mL 13 770±331

表3 樣品靜脈淤血面積改善功效評價實驗結(jié)果（±s）Tab.3 Experimental results of evaluation on the effect of improving venous congestion area of samples（±s） 像素

表3 樣品靜脈淤血面積改善功效評價實驗結(jié)果（±s）Tab.3 Experimental results of evaluation on the effect of improving venous congestion area of samples（±s） 像素

注：與模型對照組（水溶）比較，**P<0.01；與模型對照組（注射）比較，##P<0.01。

組別 動物數(shù) 濃度/劑量 靜脈淤血面積正常對照組 10 - 693±86**##模型對照組（水溶） 10 - 9 466±382模型對照組（注射） 10 - 9 525±421復(fù)方丹參滴丸 10 250 μg/mL 5 699±353**##瀉肺利水方醇提物注射給藥 10 25.0 ng/尾 5 609±305##10 50.0 ng/尾 4 533±424##10 100 ng/尾 4 571±470##瀉肺利水方醇提物水溶給藥 10 125 μg/mL 11 028±532 10 250 μg/mL 10 017±568 10 500 μg/mL 9 570±466

2.3 心力衰竭改善功效評價（血流動力學(xué)） 瀉肺利水方醇提物注射給藥和水溶給藥對斑馬魚均具有明顯的心力衰竭改善功效，主要表現(xiàn)為對血流速度和心輸出量有明顯的改善。注射給藥低、中、高劑量組對血流速度的改善率分別為33%、48%、58%，對心輸出量的改善率分別為28%、38%、72%；水溶給藥低、中、高劑量組對血流速度的改善率分別為23%、24%、28%，對心輸出量的改善率分別為22%、22%、31%。詳見表 4、5。

表4 樣品血流速度改善功效評價實驗結(jié)果（±s）Tab.4 Experimental results of sample blood flow velocity improvement efficacy evaluation（±s） μm/s

表4 樣品血流速度改善功效評價實驗結(jié)果（±s）Tab.4 Experimental results of sample blood flow velocity improvement efficacy evaluation（±s） μm/s

注：與模型對照組（水溶）比較，**P<0.01；與模型對照組（注射）比較，##P<0.01。

組別 動物數(shù) 濃度/劑量 血流速度正常對照組 10 - 722±27.4**##模型對照組（水溶） 10 - 295±28.8模型對照組（注射） 10 - 308±29.5復(fù)方丹參滴丸 10 250 μg/mL 516±29.3**##瀉肺利水方醇提物注射給藥 10 25.0 ng/尾 446±29.6 10 50.0 ng/尾 505±14.4##10 100 ng/尾 549±20.9##瀉肺利水方醇提物水溶給藥 10 125 μg/mL 394±16.0**10 250 μg/mL 399±13.3**10 500 μg/mL 416±22.2**

表5 樣品心輸出量改善功效評價實驗結(jié)果（±s）Tab.5 Experimental results of sample cardiac output improvement efficacy evaluation（±s）nL/s

表5 樣品心輸出量改善功效評價實驗結(jié)果（±s）Tab.5 Experimental results of sample cardiac output improvement efficacy evaluation（±s）nL/s

注：與模型對照組（水溶）比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型對照組（注射）比較，#P<0.05，##P<0.01。

組別 動物數(shù) 濃度/劑量 心輸出量正常對照組 10 - 0.266±0.011**##模型對照組（水溶） 10 - 0.104±0.009模型對照組（注射） 10 - 0.111±0.015復(fù)方丹參滴丸 10 250 μg/mL 0.170±0.009**#瀉肺利水方醇提物注射給藥 10 25.0 ng/尾 0.155±0.010 10 50.0 ng/尾 0.170±0.006 10 100 ng/尾 0.222±0.011##瀉肺利水方醇提物水溶給藥 10 125 μg/mL 0.140±0.008*10 250 μg/mL 0.140±0.005*10 500 μg/mL 0.155±0.010**

3 討論

心力衰竭歸屬于中醫(yī)“心衰”“心悸”“怔忡”等范疇，其多因氣血陰陽虛衰、臟腑功能失調(diào)導(dǎo)致，而心失所養(yǎng)、心血不運，則血脈瘀滯甚至血瘀水停。本病不僅對患者的生活質(zhì)量和功能狀況都造成了嚴重影響[3]，而且還帶來了沉重的經(jīng)濟負擔。目前對于心力衰竭的治療，西藥和非藥物干預(yù)方法比較完善，但很多心力衰竭患者的病情惡化趨勢及病死率并未得到有效控制。廣大中醫(yī)工作者通過大量臨床實踐發(fā)現(xiàn)，將中西醫(yī)有效結(jié)合，可明顯提高臨床療效，顯示出中醫(yī)藥在心力衰竭臨床治療方面的獨特性及優(yōu)勢[4-5]。許心如教授結(jié)合中醫(yī)經(jīng)典理論和臨床實踐，體會氣虛血瘀水停是心力衰竭的重要病機，首創(chuàng)了瀉肺利水法治療心力衰竭，以《金匱要略》葶藶大棗瀉肺湯和防己黃芪湯為主方組成心力衰竭系列合劑，根據(jù)患者的不同時期不同癥候特點，加減使用，在臨床中起到了很好的療效[2]。為更好地將瀉肺利水法應(yīng)用于臨床，方便于患者的用藥，劉紅旭主任將處方進一步精簡為由黃芪、南葶藶子、桑白皮、防己和香加皮（瀉肺利水方）組成，方中主藥黃芪益氣固表利水；南葶藶子、桑白皮瀉肺平喘，利水化飲；防己、香加皮利水消腫。

目前，日常用于治療心力衰竭的中西藥物主要以口服給藥為主，少有其他給藥方式，如栓劑直腸給藥。栓劑直腸給藥對于心力衰竭患者而言，即避免了在湯劑和顆粒劑的服藥過程中需服用一定量的水液，減少了水的攝入，又避免肝臟的首過效應(yīng)，提高了藥物的生物利用度，起到減量增效的作用。尤其對于臥病在床的老年患者，提高了藥物使用的依從性。本研究通過比較瀉肺利水方醇提物不同給藥途徑對斑馬魚心力衰竭模型心功能的影響，以探討栓劑直腸給藥的安全性及有效性。因斑馬魚無法做到直腸給藥，僅有水溶給藥和注射給藥兩種方式，水溶給藥對應(yīng)于常規(guī)的口服給藥；注射給藥雖不能等同于直腸給藥，但比較接近。

斑馬魚是目前生命科學(xué)研究中重要的模式脊椎動物之一，既有與哺乳動物類似的生理生化特征，又有高效、快速、大規(guī)模的優(yōu)勢。斑馬魚的心血管系統(tǒng)在解剖結(jié)構(gòu)和生理功能上與哺乳動物相似，包括心房和心室，血液通過動、靜脈循環(huán)，有單獨的淋巴循環(huán)。斑馬魚模型因具有對小分子的良好滲透性，可視性強等優(yōu)勢，因此在中藥治療心血管藥理學(xué)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用日益增多[6]。如通過異丙腎上腺素（ISO）、馬兜鈴酸（AA）、阿霉素（DOX）等藥物可誘發(fā)斑馬魚心力衰竭模型[7]。Zhu等[8]報道，用濃度為200 μmol/L的維拉帕米處理2 df的斑馬魚30 min，則出現(xiàn)心包水腫和靜脈淤血，同時心輸出量和血流速度顯著降低，與心力衰竭患者的臨床特征較為相似，為目前常用且較為成熟的斑馬魚心力衰竭模型。

由于斑馬魚是通過水溶（浸泡）給藥和顯微注射給藥，與人類給藥途徑有所不同，因此可能影響藥物在臨床應(yīng)用上的藥效評估。斑馬魚對藥物比較敏感，一旦不能耐受就會出現(xiàn)卵黃囊變黑和心率減慢等不良反應(yīng)，同時受藥物溶解性的影響，斑馬魚的給藥劑量無法像其他實驗動物一樣根據(jù)人用劑量進行折算，所以在進行功效評價之前，需先進行最大給藥劑量或最大給藥濃度的檢測，在此基礎(chǔ)上來設(shè)定功效評價的低、中、高劑量，而非根據(jù)臨床給藥劑量進行設(shè)定。本研究結(jié)果顯示，對于注射給藥，受樣品溶解度所限，瀉肺利水方醇提物最大給藥劑量僅可達到100 ng/尾，在此劑量下斑馬魚狀態(tài)良好，故此劑量為最大耐受劑量。與模型對照組（注射）比較，瀉肺利水方醇提物各劑量組均可顯著降低心力衰竭斑馬魚心臟擴大和靜脈淤血面積；中、高劑量組顯著改善血流速度；高劑量組可明顯增加心輸出量。對于水溶給藥，當給藥濃度達到1 000 μg/mL以上時，給藥組斑馬魚較模型對照組狀態(tài)差，因此水溶給藥的最大耐受濃度為500 μg/mL。與模型對照組（水溶）比較，瀉肺利水方醇提物各劑量組對降低心力衰竭斑馬魚心臟擴大和靜脈淤血面積無顯著影響，但可增加血流速度和心輸出量，尤其是高劑量組效果更為顯著。兩種不同給藥途徑的藥效結(jié)果有所差異，可能與斑馬魚對藥物的吸收有關(guān)，水溶給藥可能會造成某些成分未真正全部溶解在水中，從而未進入到斑馬魚體內(nèi)。同時受藥物溶解度限制，注射給藥最大給藥劑量僅達到100 ng/尾，并未檢測到真正的最大耐受劑量，從而并未給予到最佳的給藥劑量。因此還有待進一步對瀉肺利水方醇提物進行更深入的研究，從而能闡明其作用機制。