尿毒清對慢性腎臟病3～4期患者腸道微生態(tài)影響的臨床研究*

翟留玉，韓鸚贏，路玲，張文玉，孫娜，常文秀

（天津市第一中心醫(yī)院腎科，天津 300192）

慢性腎臟?。–KD）已經(jīng)成為全球性的公共健康問題，具有患病率和病死率高、知曉率低、預(yù)后差及醫(yī)療費(fèi)用高等特點(diǎn)，中國CKD總患病率高達(dá)10.8%，其進(jìn)展嚴(yán)重影響患者的生存和生活質(zhì)量[1]。CKD進(jìn)展至終末期腎?。‥SRD）階段，治療方面主要包括減少合并癥及使用替代療法，如腹膜透析、血液透析和腎臟移植。因此，尋找可控的危險(xiǎn)因素進(jìn)而采取針對性的治療措施延緩其持續(xù)進(jìn)展，成為近些年來研究的目標(biāo)和方向。

近年來，腸道菌群被認(rèn)為參與了慢性腎臟病的發(fā)生發(fā)展過程，CKD患者腸道功能屏障受到破壞，一些腸源性代謝毒素和細(xì)菌移位進(jìn)入體循環(huán)，從而加重CKD全身炎癥反應(yīng)，促進(jìn)其心腦血管并發(fā)癥的發(fā)生[2-3]。因此，以腸道菌群為靶點(diǎn)延緩慢性腎臟病進(jìn)展的新型治療方式越來越受到研究者們的關(guān)注。中醫(yī)藥在調(diào)節(jié)腸道功能及改善腸黏膜屏障方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢，而尿毒清顆粒是治療腎功能不全的常用中成藥。本研究旨在探討尿毒清顆粒對CKD患者腸道菌群及微炎癥狀態(tài)的影響，為中醫(yī)藥通過腸道干預(yù)緩解慢性腎臟病進(jìn)展提供新的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 一般資料 選取就診于本院門診的60例慢性腎臟病3～4期未透析患者作為研究對象，納入標(biāo)準(zhǔn)：1）符合2012年美國腎臟病基金會（KDIGO）定義的CKD診斷標(biāo)準(zhǔn)：以下任一表現(xiàn)持續(xù)>3個(gè)月，腎臟損傷標(biāo)志（1個(gè)或多個(gè)）白蛋白尿[尿白蛋白排泄率（AER）≥30 mg/24 h；尿白蛋白肌酐比值（ACR）≥30 mg/g]；尿沉渣異常；腎小管功能紊亂導(dǎo)致的電解質(zhì)及其他異常；組織學(xué)檢測異常；影像學(xué)檢查結(jié)構(gòu)異常；腎移植病史。2）男性及女性。3）年齡20～75歲。4）CKD 3～4期：eGFR 15～60 mL/（min·1.73 m2）。5）無胃腸道疾病，可接受口服藥物治療。6）自愿參與試驗(yàn)并簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：1）急性腎損傷、腎病綜合征、梗阻性腎病等不穩(wěn)定患者。2）已接受血液透析、腹膜透析或腎移植患者。3）妊娠或哺乳期婦女。4）合并惡性腫瘤患者。5）3個(gè)月內(nèi)進(jìn)行其他臨床試驗(yàn)的患者。6）腹瀉患者。將上述納入的研究對象隨機(jī)分為CKD組30例，尿毒清組30例，其中，CKD組和尿毒清組分別有2例和3例失訪，最終分別納入28例和27例，兩組臨床資料比較見表1。另外還征集了10例健康志愿者10名作為對照組。本試驗(yàn)已通過本院倫理學(xué)委員會審核。

表1 CKD組與尿毒清組患者臨床資料比較Tab.1 Comparison of clinical data of patients in CKD group and Niaoduqing group

1.2 治療方案 CKD組患者給予CKD綜合管理包括低蛋白低鹽飲食、控制血壓、糾正貧血、調(diào)節(jié)血脂、維持電解質(zhì)及酸堿平衡等，尿毒清組在CKD一般治療基礎(chǔ)上予以口服常規(guī)劑量尿毒清顆粒[GYZ20073256，尿毒清購于湯臣藥業(yè)（內(nèi)蒙古）有限責(zé)任公司，5 g/袋]，每日 4 次，分別于 6、12、18 時(shí)各服1袋，22時(shí)服2袋。

1.3 研究方法

1.3.1 觀察指標(biāo) 分別于試驗(yàn)前和試驗(yàn)后3個(gè)月進(jìn)行以下指標(biāo)檢測：1）一般情況：患者性別、年齡、吸煙飲酒史、家族史、基礎(chǔ)疾病、血壓、脈搏、體重指數(shù)（BMI）。2）大便菌群結(jié)構(gòu)及多樣性分析：利用16S rRNA基因測序法對各組大便菌群結(jié)構(gòu)及數(shù)量比例進(jìn)行分析。3）血清尿毒素及炎癥因子水平：測定各組血清硫酸吲哚酚（IS）及C反應(yīng)蛋白（CRP）水平。4）腎功能指標(biāo)：檢測各組血清尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）水平及ACR的變化。

1.3.2 樣本采集 1）糞便標(biāo)本采集：分別于試驗(yàn)前和試驗(yàn)后3個(gè)月采集各組研究對象的新鮮糞便置于1.5mL的無菌EP管中，為了避免污染和微生物生長，立即將糞便標(biāo)本置于-80℃冰箱低溫保存。2）血液標(biāo)本采集：分別于試驗(yàn)前和試驗(yàn)后3個(gè)月采集各組研究對象的晨起空腹靜脈血，并通過離心處理收集血清置于-20℃冰箱保存，采用臨床全自動生化分析儀檢測各組血清尿毒素、炎癥因子及腎功能指標(biāo)變化。

1.3.3 糞便DNA的提取及16S rRNA測序分析 標(biāo)本檢測由天津中正生物科技有限公司完成，利用16S rRNA基因測序法對3組研究對象的大便菌群結(jié)構(gòu)及數(shù)量比例進(jìn)行分析。具體檢測方法為：以目的腸道菌群16S rDNA為特異性的引物，以提取的糞便總DNA為模板，特異性進(jìn)行PCR擴(kuò)增以獲得目的腸道菌群的16S rRNA基因片斷，并對其進(jìn)行測序分析。其定量試劑采用 SYBR Green PCR Master Mix，反應(yīng)體系20 μL。根據(jù)所擴(kuò)增的16S區(qū)域特點(diǎn)，構(gòu)建小片段文庫，基于Illumina NovaSeq測序平臺對該文庫進(jìn)行雙末端測序（Paired_End）。經(jīng)過 Reads拼接過濾，OTUs（Operational Taxonomic Units）聚類，可以進(jìn)行物種注釋及豐度分析；通過α多樣性（Alpha Diversity）和β多樣性（Beta Diversity）分析，可以得到樣品菌群豐富度和多樣性以及樣本間群落結(jié)構(gòu)的差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，服從正態(tài)分布的兩組間比較采用兩樣本獨(dú)立t檢驗(yàn)，不服從正態(tài)分布的則采用Wilcox秩和檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)。應(yīng)用R軟件包Vegan進(jìn)行相似性分析（ANOSIM），并計(jì)算R值，R值接近1.0表明組間存在差異。3組間血清學(xué)指標(biāo)數(shù)據(jù)采用[M（P25，P75）]表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）及LSD檢驗(yàn)進(jìn)行分析，不服從正態(tài)分布或方差不齊的則采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。以上均以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 16S rRNA基因測序法對各組腸道菌群進(jìn)行分析

2.1.1 腸道菌群豐富度和多樣性分析 α多樣性分析結(jié)果顯示，在試驗(yàn)前的基線水平，與對照組相比，CKD組及尿毒清組兩組的OTUs均顯著下降（P<0.05），CKD組較對照組的Chao1指數(shù)及Shannon指數(shù)也顯著下降（P<0.05）；在試驗(yàn)后3個(gè)月，尿毒清組較CKD 組的 OUTs顯著升高（P<0.05），Chao1、Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見圖1。

圖1 試驗(yàn)前后各組腸道菌群豐富度和多樣性分析Fig.1 Analysis of intestinal flora richness and diversity in each group before and after the test

β多樣性分析結(jié)果顯示，主坐標(biāo)分析（PCoA）二維坐標(biāo)圖顯示，在試驗(yàn)前的基線水平，對照組與CKD組、尿毒清組組間呈現(xiàn)顯著分離，而尿毒清組和CKD組間未呈現(xiàn)分離；在試驗(yàn)后3個(gè)月，尿毒清組與CKD組間呈現(xiàn)分離，而與健康對照組的距離變近。另外，基于Unweighted Unifrac的ANOSIM顯示，試驗(yàn)3個(gè)月后，尿毒清組與 CKD組相比（R=0.89，P=0.034），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果表明，慢性腎臟病患者的腸道菌群發(fā)生了顯著的變化，經(jīng)尿毒清干預(yù)促使CKD患者腸道菌群多樣性增加，且更加接近健康對照組的菌群分布。

2.1.2 腸道菌群物種組成分析 結(jié)果顯示，在試驗(yàn)前，屬水平上，CKD組及尿毒清組較對照組的擬桿菌（Bacteroides）、布勞特氏菌（Blautia）、乳桿菌（Lactobacillus）、羅氏菌（Roseburia）、丁酸菌（Butyricicoccus）的豐度降低，而大腸桿菌-志賀菌（Escherichia-Shigella）、艱難梭菌（Clostridioides）、放線菌屬（Actinobacteria）、普雷沃氏菌 _9（Prevotella_9）的豐度增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在試驗(yàn)后3個(gè)月，與CKD組相比，尿毒清組Bacteroides、Blautia、Butyricicoccus的豐度明顯增加，而 Escherichia-Shigella的豐度顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），見圖2。以上結(jié)果表明CKD患者存在腸道菌群失調(diào)，尿毒清干預(yù)可在一定程度上調(diào)節(jié)慢性腎臟病患者的這種腸道菌群紊亂。

圖2 試驗(yàn)前后屬水平上各組腸道菌群物種組成分析Fig.2 Analysis of species composition of intestinal flora at genus level before and after test

2.2 受試者血清尿毒素，炎癥因子水平及腎功能指標(biāo)情況

2.2.1 試驗(yàn)前各組血清尿毒素、炎癥因子及腎功能指標(biāo)比較 結(jié)果顯示，與對照組相比，尿毒清組和CKD 組的 IS、CRP、BUN、Scr及 ACR 水平均明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；尿毒清組和CKD組組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。見表2。

表2 試驗(yàn)前各組血清尿毒素、炎癥因子及腎功能比較[M（P25，P75）]Tab.2 Comparison of serum urotoxins，inflammatory factors and renal function in each group before the test[M（P25，P75）]

2.2.2 試驗(yàn)后3個(gè)月各組血清尿毒素、炎癥因子及腎功能指標(biāo)比較 結(jié)果顯示，與CKD組相比，尿毒清組患者，IS及部分腎功能指標(biāo)如Scr、ACR水平顯著下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。見表3。

表3 試驗(yàn)后3個(gè)月各組血清尿毒素，炎癥因子及腎功能比較[M（P25，P75）]Tab.3 Comparison of serum urotoxins，inflammatory factors and renal function in each group 3 months after the test[M（P25，P75）]

3 討論

腸道菌群作為人體重要的組成部分，其在宿主消化、營養(yǎng)、代謝、免疫等方面均發(fā)揮著極其重要的作用[4]。在正常生理?xiàng)l件下，腸道微生物群與人體之間存在動態(tài)平衡。當(dāng)這種動態(tài)平衡被打破時(shí)，腸道微生物群將使機(jī)體致病[5]。目前，越來越多的研究表明，人類多種疾病與腸道菌群的改變或某些細(xì)菌的富集有關(guān)，如肥胖、抑郁癥、惡性腫瘤、炎癥性腸病、多發(fā)性硬化癥、自身免疫性疾病等[6-7]。近年來，腸道菌群微生態(tài)失調(diào)在CKD進(jìn)展中的作用逐漸被認(rèn)識，調(diào)節(jié)腸道菌群成為延緩CKD進(jìn)展的新靶向手段。

CKD患者普遍存在腸道菌群紊亂[8]。在一項(xiàng)研究中，Vaziri等[9]發(fā)現(xiàn)終末期腎臟?。‥SRD）患者的腸道放線菌、變形菌和厚壁菌數(shù)量明顯增加，他們還觀察到CKD患者的致病性腸道細(xì)菌定植增加，這些細(xì)菌表達(dá)尿素酶、色氨酸酶并將芳香族氨基酸轉(zhuǎn)換產(chǎn)生PCS和IS。而腸源性尿毒素PCS、IS水平的升高又會進(jìn)一步損傷腸道的黏膜屏障結(jié)構(gòu)，繼而導(dǎo)致腸黏膜屏障功能受損，細(xì)菌及內(nèi)毒素移位至體循環(huán)引起菌血癥及內(nèi)毒素血癥，均會加劇CKD患者系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)狀態(tài)，其結(jié)果可引起CKD進(jìn)展、心腦血管疾病發(fā)生，最終導(dǎo)致患者預(yù)后惡化[10]。由此提示腸道菌群失調(diào)在CKD的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著一定作用，是導(dǎo)致慢性腎臟病進(jìn)展的一個(gè)重要因素。本研究基于此點(diǎn)，探討尿毒清顆粒對CKD 3～4期非透析患者腸道菌群和炎癥因子水平及腎功能的影響，為CKD患者行腸道干預(yù)治療有效性提供新的理論依據(jù)。

在本研究中，與健康對照組相比，CKD組患者的腸道菌群多樣性降低，菌群結(jié)構(gòu)也發(fā)生了顯著的變化。在屬水平上，CKD組及尿毒清組較對照組的Bacteroides、Blautia、Lactobacillus、Roseburia、Butyricicoccus的豐度降低，而 Escherichia-Shigella、Clostridioides、Actinobacteria、Prevotella_9 的豐度增加。Lactobacillus是一種存在于人體內(nèi)的益生菌，可幫助機(jī)體消化，有助于人體腸道健康，被廣泛用于制造液態(tài)酸奶等[11]。另有研究表明，Blautia是一種具有潛在益生菌特征的厭氧細(xì)菌，可促進(jìn)短鏈脂肪酸（SCFAs）產(chǎn)生等維持腸道穩(wěn)態(tài)活性[12]。SCFAs是腸道菌群的主要代謝產(chǎn)物，除了維持腸道穩(wěn)態(tài)，SCFAs還參與胃腸生理、免疫功能以及宿主代謝，甚至與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)有關(guān)[13-14]。此外，有研究顯示SCFAs在CKD中也發(fā)揮著重要作用[15]。而Escherichia-Shigella作為一種條件致病菌，與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。有研究表明，炎癥性腸病患者腸道菌群與健康對照組存在顯著差異，主要由變形桿菌和Escherichia-Shigella組成的病原菌數(shù)量顯著增加[16]。因此，上述結(jié)果驗(yàn)證了CKD患者腸道菌群失調(diào)的存在，主要為幾種相關(guān)益生菌數(shù)量的減少及致病菌如Escherichia-Shigella的增加，這與既往研究的部分結(jié)果是一致的[17]。

CKD患者腸道菌群的改變可能是由于腸道微生態(tài)環(huán)境改變所致[18]，其中可能包括以下幾個(gè)方面的原因：1）CKD患者飲食結(jié)構(gòu)的改變，如食物中纖維素的攝入量減少可使腸道內(nèi)益生菌與致病菌之間的平衡被打破。2）CKD患者大多存在便秘癥狀，其結(jié)腸轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間較長，條件致病菌在結(jié)腸內(nèi)大量繁殖。3）尿毒血癥導(dǎo)致腸道對蛋白質(zhì)的吸收障礙使得結(jié)腸內(nèi)蛋白分解細(xì)菌獲得的蛋白質(zhì)量增加、腸道pH值改變以及藥物等因素的作用引起結(jié)腸內(nèi)微生物菌群從數(shù)量到菌群比例均發(fā)生了改變。4）尿毒素在腸道的蓄積導(dǎo)致腸黏膜組織結(jié)構(gòu)損傷，黏膜屏障功能受損，其通透性增加[19]。

尿毒清是國家食品藥品監(jiān)督管理總局（SFDA）最早批準(zhǔn)的治療腎臟病藥物，由大黃、黃芪、桑白皮、苦參等16味中藥組成，是目前臨床上治療腎功能不全的常用中成藥。多項(xiàng)臨床研究證實(shí)，在慢性腎功能不全、糖尿病腎病等多種腎臟疾病中，尿毒清顆?？山档图◆?、尿素氮，穩(wěn)定腎功能，延緩進(jìn)入腎衰竭的時(shí)間，且可改善腎性貧血，但其具體的作用機(jī)制尚不明確[20-22]。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)尿毒清干預(yù)有促使CKD患者腸道菌群多樣性增加的趨勢，可顯著改善CKD患者腸道菌群組成，使其更加接近健康人群的菌群分布。由此推測，尿毒清可在一定程度上調(diào)節(jié)CKD患者的腸道菌群失調(diào)，可能是其腎臟保護(hù)作用的機(jī)制之一。另外，從血清尿毒素、炎癥因子及腎功能等指標(biāo)變化情況，發(fā)現(xiàn)尿毒清干預(yù)可減少腸源性尿毒素IS的產(chǎn)生，從而減輕CKD患者的微炎癥狀態(tài)，緩解腎功能的進(jìn)展。綜合以上結(jié)果分析，尿毒清延緩慢性腎臟病進(jìn)展的可能機(jī)制為尿毒清通過調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂，增加腸道有益菌的含量，減少了腸道微生態(tài)失衡導(dǎo)致的腸源性尿毒素產(chǎn)生，抑制了腸道黏膜屏障損傷及繼發(fā)的菌群移位，從而緩解系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)的發(fā)生，在一定程度上阻礙了腎功能減退和腸道菌群紊亂之間的惡性循環(huán)。

本研究尚有一些局限性，沒有闡明腸道菌群失調(diào)影響尿毒癥毒素生成的具體機(jī)制，以及不同菌種與不同炎性因子的相關(guān)性，未來需要更多研究進(jìn)一步證實(shí)不同腸道菌群與尿毒癥毒素血清濃度之間的相互作用。此外，由于尿毒清是含有多種中藥成分的復(fù)方制劑，今后將進(jìn)行單成分提取做進(jìn)一步的深入研究。綜上所述，尿毒清可調(diào)節(jié)CKD患者腸道菌群紊亂，減輕微炎癥狀態(tài)從而緩解腎功能進(jìn)展，腸道干預(yù)將成為未來延緩CKD進(jìn)展的新手段。