狼瘡性腎炎病人血清簇分化抗原36、微小RNA-335水平與疾病活動度的關系

杜鵬舉，郭琴，潘春勤，劉杰

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種能夠引起多系統(tǒng)、多臟器功能受損的免疫性疾病，好發(fā)于20～40歲育齡期婦女［1］。狼瘡腎炎是SLE 最常見的并發(fā)癥之一，主要是由于SLE 過程中產(chǎn)生的自身免疫性抗原-抗體復合物沉積在腎臟中造成的損害所致，臨床表現(xiàn)為血尿、蛋白尿、水腫等［2］。簇分化抗原36（CD36）是一種清道夫受體，廣泛存在于多種組織細胞中，在自身免疫反應、炎癥反應、脂質(zhì)代謝中有重要作用［3-4］。研究表明CD36 與慢性腎臟病的發(fā)生發(fā)展有關［5］。微小RNA（miRNA）是一種內(nèi)源性的非編碼RNA，與自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展有關［6］。Perez-Hernandez 等［7］研究表明與健康對照組比較，狼瘡腎炎病人尿液外泌體中微小RNA-335（miR-335）表達顯著上調(diào)。狼瘡腎炎病人不同疾病活動度評分，決定不同劑量激素的使用及不同免疫制劑的選擇。本研究通過檢測狼瘡腎炎病人血清CD36、miR-335 水平，分析二者與狼瘡腎炎病人疾病活動度的關系，可能為臨床狼瘡腎炎疾病活動度的診斷提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取仙桃市第一人民醫(yī)院2017 年5 月至2020 年6 月收治的SLE 病人138 例為研究對象，其中男42 例，女96 例，年齡（31.26±9.85）歲，范圍為18～51歲，體質(zhì)量指數(shù)（BMI）為（24.28±3.12）kg/m2；同期選取在該院進行健康體檢人員120 例為對照組，其中男43 例，女77 例，年齡（32.45±9.12）歲，范圍為18～50歲，BMI為（23.65±2.68）kg/m2。兩組性別、年齡、BMI比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

納入標準：（1）符合中國狼瘡腎炎診斷和治療指南編寫組制定的狼瘡腎炎診斷標準［8］；（2）經(jīng)穿刺活檢確診；（3）≥18 歲。排除標準：（1）合并類風濕性關節(jié)炎等其他自身免疫性疾病病人；（2）妊娠期及哺乳期婦女；（3）合并惡性腫瘤病人；（4）合并心、肝等重大臟器功能不全者。

所有研究對象或其近親屬簽署知情同意書，本研究經(jīng)仙桃市第一人民醫(yī)院倫理委員會審核、批準后實施（批號20170523）。

1.2 主要試劑及儀器RNA 提取試劑盒（貨號DP419），天根生化科技（北京）有限公司，逆轉錄試劑盒（貨號RR047A）、實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）試劑盒（貨號RR820B），日本Takara 公司；酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）CD36 試劑盒（貨號ab267614），英國abcam 公司；引物，生工生物工程（上海）股份有限公司；qRT-PCR 儀CFX96，美國BIO-RAD 公司；Nanodrop one 2000 分光光度計，賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 血液樣品采集 狼瘡腎炎病人于住院次日清晨，健康體檢者于體檢當日清晨采集空腹靜脈血3 mL，置于離心管中，4 ℃，3 000 r/min，離心10 min，轉移上清并分裝至新離心管中，-80 ℃超低溫冰箱保存用于后續(xù)實驗。

1.3.2 一般資料收集及實驗室指標檢測 收集狼瘡腎炎病人性別、年齡、BMI 及SLE 疾病活動指數(shù)（SLEDAI）評分。采用全自動生化分析儀檢測狼瘡腎炎病人血清白蛋白、血肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白；全自動特定蛋白分析儀檢測C 反應蛋白（CRP）、補體C3、補體C4；血細胞自動分析儀檢測白細胞、紅細胞沉降率（ESR）；全自動尿沉渣定量分析儀檢測尿沉渣紅細胞數(shù)。

1.3.3 狼瘡腎炎疾病活動度分組 根據(jù)ISN/RPS 關于狼瘡腎炎活動評分系統(tǒng)分級法［9］對腎小球、腎小管進行定量評分，活動指數(shù)為腎小球、腎小管各項指標之和。根據(jù)活動指數(shù)將狼瘡腎炎病人分為非活動組（0～4 分）46 例，活動組92 例，其中輕度組（＞4～8 分）29 例，中度組（＞8～12 分）37 例，重度組（＞12分）26例。

1.3.4 qRT-PCR 檢測血清miR-335 的水平 RNA提取試劑盒對血清RNA 進行提取，逆轉錄試劑盒將提取的RNA 逆轉錄成互補DNA（cDNA），qRT-PCR檢測血清miR-335 水平，循環(huán)條件為：95 ℃60 s；95 ℃30 s，58 ℃45 s，72 ℃30 s，共40 個循環(huán)。以U6 為內(nèi)參，引物序列：miR-335 正向引物5’-3’為AGCCGTCAAGAGCAATAACGAA，反向引物5’-3’為GTGCAGGGTCCGAGGT；U6 正向引物5’-3’為GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT，反向引物5’-3’為CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT。采 用2-ΔΔCt法計算血清miR-335相對表達量。

1.3.5 ELISA 檢測血清CD36 水平 利用ELISA 試劑盒檢測所有受試者血清CD36 的水平，實驗操作嚴格按照試劑說明書進行。

1.4 統(tǒng)計學方法采用軟件SPSS 20.0 進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布計量資料采用± s 描述，兩組間比較采用兩獨立樣本t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多組間的兩兩比較采用SNK-q檢驗；不符合正態(tài)分布計量資料采用中位數(shù)（下、上四分位數(shù)）［M（P25，P75）］描述，組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗。計數(shù)資料采用例數(shù)描述，組間比較采用χ2檢驗；Pearson 相關性分析檢驗狼瘡腎炎病人血清CD36、miR-335與一般資料的相關性；受試者工作特征曲線（ROC 曲線）分析血清CD36、miR-335 對狼瘡腎炎疾病活動度的診斷價值，聯(lián)合診斷與CD36、miR-335 對狼瘡腎炎疾病活動度診斷價值的比較采用Z檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組受試者血清CD36、miR-335 水平比較與對照組比較，狼瘡腎炎病人血清CD36、miR-335水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組血清中CD36、miR-335水平比較/± s

表1 兩組血清中CD36、miR-335水平比較/± s

注：CD36為簇分化抗原36。

組別對照組狼瘡腎炎組t值P值例數(shù)120 138 CD36/（μg/L）67.49±8.64 147.25±11.43 62.48＜0.001 miR-335 1.00±0.00 1.58±0.23 27.62＜0.001

2.2 不同疾病活動度狼瘡腎炎病人一般資料比較與非活動組比較，活動組狼瘡腎炎病人性別、年齡、BMI、白細胞、CRP、ESR 比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；尿素氮、血肌酐、24 h尿蛋白、尿沉渣紅細胞、SLEDAI、活動指數(shù)均顯著升高，補體C3、C4、白蛋白顯著降低（P＜0.05）。見表2。

2.3 不同疾病活動度狼瘡腎炎病人血清CD36、miR-335 水平比較與非活動組比較，活動組狼瘡腎炎病人血清CD36、miR-335 水平均顯著升高，且隨著疾病活動度的增加，血清CD36、miR-335 水平均逐漸升高（P＜0.05），見表3。

表3 不同疾病活動度狼瘡腎炎病人血清CD36、miR-335的比較/± s

表3 不同疾病活動度狼瘡腎炎病人血清CD36、miR-335的比較/± s

注：CD36為簇分化抗原36。①與非活動組比較，P＜0.05。②與輕度組比較，P＜0.05。③與中度組比較，P＜0.05。

組別非活動組輕度組中度組重度組F值P值例數(shù)46 29 37 26 CD36/（μg/L）128.49±3.65 135.42±2.98①146.71±3.19①②157.36±4.12①②③441.40＜0.001 miR-335 1.32±0.11 1.44±0.14①1.60±0.15①②1.72±0.18①②③53.02＜0.001

2.4 血清CD36、miR-335 水平與狼瘡腎炎病人一般資料的相關性Pearson 分析結果表明，血清CD36、miR-335 水平均與狼瘡腎炎病人白細胞、CRP、ESR、尿素氮無關（P＞0.05），與白蛋白、補體C3、C4呈負相關，與血肌酐、尿蛋白、尿沉渣紅細胞、SLEDAI、活動指數(shù)呈正相關（P＜0.05），見表4。

表2 不同疾病活動度狼瘡腎炎病人一般資料比較

表4 血清CD36、miR-335水平與狼瘡腎炎病人一般資料的相關性

2.5 ROC 曲線分析血清CD36、miR-335 水平對狼瘡腎炎病人疾病活動度的診斷價值結果顯示，血清CD36、miR-335 水平診斷狼瘡腎炎病人疾病活動度的曲線下面積（AUC）分別為0.83［95%CI：（0.75，0.90）］、0.80［95%CI：（0.73，0.88）］，二者聯(lián)合診斷AUC 為0.94［95%CI：（0.90，0.98）］，聯(lián)合診斷對狼瘡腎炎病人疾病活動度的診斷價值高于CD36、miR-335，見表5。

表5 血清CD36、miR-335水平對狼瘡腎炎病人活動度的診斷價值

3 討論

SLE 是一種多系統(tǒng)損傷的慢性自身免疫性疾病，發(fā)病機制比較復雜，與遺傳、環(huán)境、感染等多種因素有關［10］。狼瘡腎炎是SLE常見的器官損傷并發(fā)癥，50%～80%的SLE 病人會出現(xiàn)腎損傷，可在5 年內(nèi)發(fā)展為終末期腎病，嚴重威脅病人健康［2］。疾病活動度是影響狼瘡腎炎病人腎臟預后的重要因素，對狼瘡腎炎病人疾病活動度的早期評價對改善病人預后至關重要。腎組織活檢是診斷狼瘡腎炎最有效的方法，可以判斷狼瘡腎炎病人病理類型及疾病活動度，然而腎組織活檢屬于有創(chuàng)性檢測手段，不能重復進行檢測［11］。因此尋找有效的檢測狼瘡腎炎病人疾病活動度的生物標志物，有利于臨床上判斷狼瘡腎炎病人的疾病進展，從而針對病人病情進行有效治療，改善病人預后。

CD36是一種多功能受體，是細胞表面的一種單鏈跨膜糖蛋白，也是腎臟脂肪酸攝取系統(tǒng)的主要組成成分，在慢性腎臟疾病的發(fā)展中有重要的作用，有研究表明在患有急性或慢性損傷的腎臟中CD36水平顯著升高［12-13］。本研究結果表明狼瘡腎炎病人血清CD36 水平顯著高于對照組，且狼瘡腎炎活動組病人血清CD36 水平顯著高于非活動組，并隨著疾病活動度的升高而升高，提示CD36 可能與狼瘡腎炎的發(fā)生發(fā)展有關。補體是血清中具有酶活性的一種球蛋白，與先天性免疫有關，補體C3和C4水平的降低表明補體活化功能異常，被認為是狼瘡腎炎疾病活動度增加的指標［14］。Bonegio 等［15］研究表明沉積的免疫復合物能夠激活補體吸引中性粒細胞并增強其反應，引起SLE腎臟受累。尿蛋白、尿沉渣水平與腎臟病變程度有關。本研究結果表明與非活動組比較，活動組狼瘡腎炎病人尿素氮、血肌酐、尿蛋白、尿沉渣紅細胞、SLEDAI、活動指數(shù)均顯著升高，而補體C3、C4、白蛋白顯著降低。研究表明CD36 通過影響嗜中性粒細胞的功能和先天性免疫反應，在狼瘡腎炎的發(fā)病和發(fā)展中發(fā)揮重要作用［12］。Pearson 相關性分析結果表明，狼瘡腎炎病人血清CD36 水平與白蛋白、補體C3、C4 呈負相關，與血肌酐、尿蛋白、尿沉渣紅細胞、SLEDAI、活動指數(shù)呈正相關，提示CD36 可能通過病人體內(nèi)免疫反應和炎癥反應參與狼瘡腎炎的發(fā)病。5A 肽是一種拮抗CD36 的新型肽，研究表明5A 肽可改善腎臟炎癥和腎小管間質(zhì)纖維化［16］。Yang 等［17］研究表明CD36的沉默通過抑制炎性應激誘導的脂肪酸攝取和脂質(zhì)毒性抑制肥胖小鼠慢性腎臟病的發(fā)展。本研究ROC 曲線分析表明CD36 診斷狼瘡腎炎疾病活動度具有較高的靈敏度和特異度，提示CD36 可能是診斷狼瘡腎炎疾病活動度潛在的生物標志物。

狼瘡腎炎病人存在著多種miRNA 的差異性表達［18］，miR-335 是一種與脂質(zhì)形成有關的miRNA，與脂肪酸代謝和脂肪形成有關，在多種免疫性疾病中存在差異表達。Ebrahimiyan 等［19］研究表明與健康對照組比較，類風濕關節(jié)炎病人外周血單個核細胞中miR-335 水平顯著上調(diào)。Martini 等［20］研究表明原發(fā)性干燥綜合征miR-335-5p 表達顯著高于健康志愿者。本研究結果發(fā)現(xiàn)狼瘡腎炎病人血清miR-335水平顯著高于對照組，與Perez-Hernandez 等［7］研究結果相似，miR-335 與狼瘡腎炎病人補體C3、C4、尿蛋白、尿沉渣、SLEDAI、活動指數(shù)有關，提示miR-335 可能與狼瘡腎炎的發(fā)病有關，具體機制需要進一步研究。本研究結果還發(fā)現(xiàn)狼瘡腎炎活動組血清miR-335 水平顯著高于非活動組，且隨著病人疾病活動度的升高，血清miR-335水平顯著升高，進一步ROC 曲線分析結果表明，miR-335 對狼瘡腎炎病人疾病活動度有較高的診斷價值，提示miR-335 可能是狼瘡腎炎發(fā)生發(fā)展的潛在診斷標志物。本研究利用血清miR-335 與CD36 水平對狼瘡腎炎疾病活動度進行聯(lián)合診斷，結果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合診斷狼瘡腎炎的靈敏度和特異度均高于二者分別診斷，提示血清miR-335 和CD36 聯(lián)合診斷可能是狼瘡腎炎疾病活動度診斷的潛在方法。

綜上所述，血清CD36、miR-335 在狼瘡腎炎病人血清中存在差異性表達，與病人疾病活動度有關，對狼瘡腎炎疾病活動度有一定的診斷價值。然而本研究僅從臨床水平上探討了CD36、miR-335 在狼瘡腎炎病人血清中的表達差異，而CD36、miR-335在狼瘡腎炎發(fā)生發(fā)展中具體作用機制還需進一步深入探討。