番茄SlSL1重組蛋白的表達(dá)、純化及體外泛素化活性檢測(cè)

徐煥煥, 張芳毓, 劉 茜, 欒能能, 王穎格, 牛向麗

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

泛素(Ubiqutin,Ub)是一種廣泛存在于真核細(xì)胞中、包含有76個(gè)氨基酸的高度保守的小分子蛋白[1-2]。泛素化修飾是泛素分子在一系列酶的作用下與靶標(biāo)蛋白上的一個(gè)或多個(gè)賴氨酸殘基共價(jià)結(jié)合,形成的蛋白質(zhì)翻譯后修飾。由于泛素蛋白自身也具有賴氨酸殘基,它們之間可以通過(guò)這些位點(diǎn)互相連接,形成多泛素鏈修飾的蛋白質(zhì)。多泛素化修飾介導(dǎo)蛋白質(zhì)的26S蛋白酶體降解,在基因轉(zhuǎn)錄[3]、激素信號(hào)傳導(dǎo)[4-5]、細(xì)胞周期[6-7]、植物抗病抗逆[8-9]以及生長(zhǎng)發(fā)育[10]等所有生命活動(dòng)過(guò)程中均發(fā)揮著重要作用。

蛋白質(zhì)的泛素化由E1泛素激活酶、E2泛素結(jié)合酶和E3泛素連接酶通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)共同完成[11-12]。E1利用ATP與泛素分子形成高能硫酯鍵,并將活化后的泛素轉(zhuǎn)移到E2,然后結(jié)合有E2的泛素分子被E3轉(zhuǎn)移到靶蛋白上進(jìn)行標(biāo)記[13-14]。其中,E3泛素連接酶是一個(gè)種類繁多的大家族,主要功能是對(duì)靶標(biāo)蛋白進(jìn)行特異性識(shí)別,并對(duì)其進(jìn)行泛素化修飾,然后在26S蛋白酶體催化下使泛素化的靶蛋白發(fā)生降解。目前在擬南芥中已鑒定超過(guò)1 400個(gè)E3泛素連接酶[15-16],水稻中E3泛素連接酶基因也有1 300多個(gè)[17-18]。由于E3泛素連接酶被認(rèn)為是泛素化途徑中最重要的組成部分[19-20],也是目前泛素化研究中的熱點(diǎn),因此對(duì)E3泛素連接酶展開深入研究具有重要意義。

多數(shù)E3泛素連接酶具有的典型反應(yīng)特征就是能夠與E2泛素結(jié)合酶協(xié)作,催化自身的泛素化。體外泛素化實(shí)驗(yàn),即通過(guò)體外添加泛素化反應(yīng)中的必需成分(E1、E2、E3、Ub等),利用實(shí)驗(yàn)體系模擬生物體內(nèi)的泛素化反應(yīng)過(guò)程,可以通過(guò)該實(shí)驗(yàn)方法發(fā)現(xiàn)可能的E3連接酶、驗(yàn)證靶蛋白的泛素化。本研究通過(guò)克隆推測(cè)具有E3泛素連接酶功能的番茄SlSL1基因編碼序列、構(gòu)建原核表達(dá)載體、體外誘導(dǎo)標(biāo)簽重組蛋白表達(dá)、分離純化,獲得SlSL1重組蛋白,并利用體外泛素化實(shí)驗(yàn)體系,對(duì)SlSL1的泛素連接酶活性進(jìn)行檢測(cè),為后續(xù)進(jìn)一步探討SlSL1利用泛素化途徑在番茄中的調(diào)控作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌(Escheriachiacoli)菌株Rosetta、原核表達(dá)載體pMAL-C2,均保存于本實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑

DNA產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒,均購(gòu)于北京天根生化科技有限公司;高保真 DNA 聚合酶、Easy Taq酶、dNTP、DNA marker,均購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司;限制性內(nèi)切酶(EcoRⅠ、SaIⅠ)、淀粉樹脂購(gòu)于NEB公司;maltose、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、FLAG標(biāo)簽小鼠單克隆抗體,均購(gòu)于Sigma公司;Flag-Ub、重組蛋白E1、E2,均購(gòu)于Boston Biochem公司;Bacterial Protease inhibitor購(gòu)于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;ECL化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)于Thermo Fisher Scientific公司;引物設(shè)計(jì)采用Primmer Premmier 5.0軟件,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成;其他試劑均為國(guó)外原裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1SlSL1原核表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)番茄SlSL1基因序列(Solyc03g042550)設(shè)計(jì)引物,引物序列為:

SL1F:5’-CCGGAATTCATGGCGAGATTTTCAGTTG-3’;

SL1R: 5’-GCGTCGACTCATTCCTTCTCTTCTATGAGAACATC-3’。

引入EcoRⅠ、SaIⅠ酶切位點(diǎn),根據(jù)所設(shè)計(jì)引物對(duì)SlSL1基因全長(zhǎng)編碼序列進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)高保真擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)?98 ℃熱啟動(dòng)2 min、98 ℃變性20 s、54 ℃退火20 s、72 ℃延伸30 s,共 30 個(gè)循環(huán),最后一個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸5 min。

擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、純化后,以EcoRⅠ、SaIⅠ進(jìn)行雙酶切。酶切片段進(jìn)行膠回收,然后與同樣酶切回收的pMAL-C2載體片段進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化Rosetta菌株感受態(tài)細(xì)胞。挑選單克隆,對(duì)其進(jìn)行菌落PCR鑒定、質(zhì)粒抽提,并將經(jīng)雙酶切鑒定后質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序,完成重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒pMAL-SlSL1的構(gòu)建。

1.2.2 SlSL1重組蛋白的誘導(dǎo)純化

挑取陽(yáng)性重組菌株單克隆于2 mL含有50 mg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中,37 ℃搖床中過(guò)夜培養(yǎng)。再將培養(yǎng)菌液以1∶100比例轉(zhuǎn)接于50 mL 含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)2～3 h 至OD600為0.5～0.6。吸取0.5 mL菌液,12 000 r/min離心2 min,棄上清,液氮速凍,保存于-80 ℃冰箱,用于制備誘導(dǎo)前的蛋白樣品。剩余菌液加入20 μL 0.5 mol/L IPTG于28 ℃、200 r/min搖床中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)6～8 h(IPTG誘導(dǎo)條件一般為28 ℃、6 h,促進(jìn)重組蛋白在大腸桿菌中的高效可溶性表達(dá)),3 000 r/min離心6 min收集菌體。用5 mL蛋白提取緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl、200 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1×Bacterial protease inhibitor)重懸菌體,冰上放置,超聲破碎10 s,間歇20 s,共重復(fù)10次。隨后12 000 r/min、4 ℃離心10 min,保留上清液(粗提取液)。將5 mL粗提液與0.5 mL淀粉樹脂于4 ℃緩慢旋轉(zhuǎn)孵育4～6 h后,4 ℃離心機(jī)3 000 r/min 離心5 min,棄上清,加入提取緩沖液對(duì)樹脂進(jìn)行清洗,離心棄上清,重復(fù)洗滌3次。用含有10 mmol/L maltose的洗脫緩沖液洗脫帶有MBP(maltose binding protein)標(biāo)簽的SlSL1蛋白2～4 h后,離心并收集上清,獲得SlSL1純化蛋白溶液。在IPTG誘導(dǎo)前、后菌液所制備的蛋白樣品和純化SlSL1蛋白樣品中加入上樣緩沖液,混勻后于95 ℃加熱5 min,進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。電泳結(jié)束后以考馬斯亮藍(lán)對(duì)蛋白凝膠染色3 h,然后進(jìn)行脫色直至出現(xiàn)較為清晰干凈的蛋白條帶,拍照記錄。

1.2.3 體外泛素化反應(yīng)及蛋白免疫印跡分析

首先進(jìn)行泛素化反應(yīng),總反應(yīng)體系體積為30 μL,包括超純水14.5 μL、20×buffer(1 mol/L Tris (pH值 7.5)、40 mmol/L ATP、100 mmol/L MgCl2、600 mmol/L creatine phosphate、1 mg/mL creatine phosphokinase)1.5 μL、E1 1 μL、E2 1 μL、SlSL1純化蛋白10 μL、Flag-ub 2 μL,于28 ℃反應(yīng)2 h,然后在樣品中加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液,于95 ℃加熱5 min,得到反應(yīng)樣品。

然后進(jìn)行蛋白免疫印跡分析。將上述所得反應(yīng)產(chǎn)物以7.5% SDS-PAGE進(jìn)行電泳,電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜,將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后在室溫下用5% 脫脂牛奶封閉1 h,然后室溫孵育anti-Flag 標(biāo)簽抗體1 h,以1×TBST緩沖液(20 mmol/L Tris(pH 值7.4)、150 mmol/L NaCl、20 % Tween-20)洗膜,每次10 min,重復(fù)3次。加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑(V(A液)∶V(B液)=1∶1),將其置于化學(xué)發(fā)光儀(美國(guó)GE Healthcare凝膠成像系統(tǒng)ImageQuant LAS 4000mini)進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 原核表達(dá)載體pMAL-SlSL1的構(gòu)建分析

利用特異引物SL1F/R對(duì)SlSL1基因編碼序列進(jìn)行PCR全長(zhǎng)擴(kuò)增,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示,獲得預(yù)期大小(1 083 bp)條帶。圖1中, M代表DNA Marker，下同。

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后,以EcoRⅠ和SalⅠ限制性酶進(jìn)行雙酶切。將酶切片段進(jìn)行膠回收后與同樣酶切的原核表達(dá)載體pMAL-C2片段進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta,并進(jìn)行菌落PCR鑒定,結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，表明獲得了連入SlSL1基因的陽(yáng)性克隆。圖2中，P為正對(duì)照,SlSL1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;N為負(fù)對(duì)照,pMAL-C2空載體擴(kuò)增產(chǎn)物;1～6為轉(zhuǎn)化單克隆擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖1 SlSL1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 pMAL-SlSL1大腸桿菌落PCR鑒定

選取2號(hào)克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提及酶切鑒定,結(jié)果如圖3所示。酶切后獲得預(yù)期大小的SlSL1片段,將酶切鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒送測(cè)序。序列經(jīng)GenBank比對(duì)一致,未出現(xiàn)突變和移位,表明pMAL-SlSL1重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建完成。圖3中:1為以EcoRⅠ和SalⅠ酶切的重組質(zhì)粒;2為未酶切pMAL-SlSL1質(zhì)粒。

圖3 pMAL-SlSL1陽(yáng)性質(zhì)粒酶切鑒定

2.2 SlSL1重組蛋白的純化與檢測(cè)分析

將上述含有pMAL-SlSL1重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒的Rosetta陽(yáng)性克隆進(jìn)行培養(yǎng)、IPTG誘導(dǎo),然后利用重組蛋白所帶有的MBP標(biāo)簽序列,通過(guò)淀粉樹脂對(duì)SlSL1蛋白進(jìn)行純化。SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果如圖4所示。圖4中:1為誘導(dǎo)前菌體總蛋白;2為IPTG誘導(dǎo)6 h菌體總蛋白;3為純化的SlSL1蛋白。

從圖4可以看出,IPTG誘導(dǎo)后SlSL1蛋白的表達(dá)升高,經(jīng)淀粉樹脂特異親和吸附后獲得了條帶較為單一的預(yù)期大小SlSL1蛋白。但仍有一些雜蛋白條帶,可能是淀粉樹脂的非特異吸附造成的。當(dāng)加入maltose洗脫緩沖液再次洗脫可使SlSL1蛋白純度進(jìn)一步提高。

圖4 SlSL1重組蛋白的誘導(dǎo)與純化

2.3 體外泛素化反應(yīng)及蛋白免疫印跡分析結(jié)果

按照上述體外泛素化反應(yīng)體系加入各組分,以未連接目標(biāo)基因的MBP標(biāo)簽蛋白設(shè)置對(duì)照樣品,28 ℃反應(yīng)2 h,然后進(jìn)行蛋白免疫印跡分析,結(jié)果如圖5所示,圖5中:1為SlSL1純化蛋白的體外泛素化反應(yīng);2為未連接目標(biāo)基因的MBP標(biāo)簽蛋白對(duì)照反應(yīng)體系。

圖5 SlSL1蛋白的體外泛素化

從圖5可以看出,當(dāng)以anti-Flag抗體孵育結(jié)合時(shí),SlSL1蛋白因連接上了帶有Flag標(biāo)簽的多個(gè)泛素分子Flag-Ub,顯示出分子量逐漸增加的彌散狀的多泛素化條帶;而加入MBP的對(duì)照樣品反應(yīng)體系則無(wú)相應(yīng)泛素化條帶。表明SlSL1蛋白可進(jìn)行自身泛素化,具有E3連接酶活性,因此可能通過(guò)番茄泛素化修飾發(fā)揮調(diào)控功能。

3 討 論

E3泛素連接酶能夠特異識(shí)別底物蛋白,并促進(jìn)泛素向底物蛋白轉(zhuǎn)移,是泛素化反應(yīng)過(guò)程的關(guān)鍵酶。根據(jù)其結(jié)構(gòu)域的不同及與底物的結(jié)合方式可將E3泛素連接酶分為HECT型(homologous to e6-associated protein C-terminus)、U-box型、RING型(really interesting new gene)及CRLs型4大類。其中HECT、RING和U-box型E3泛素連接酶為單亞基E3連接酶,而CRLs型是由cullin、RING-box以及靶標(biāo)蛋白識(shí)別蛋白共同組成的一個(gè)復(fù)合體。目前對(duì)植物泛素化系統(tǒng)的研究表明,這些不同類別的E3連接酶家族成員均可參與植物防御反應(yīng)[21-24]、生殖發(fā)育、胞吞作用、DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡、亞細(xì)胞定位等生命活動(dòng)過(guò)程[25-26]。

本研究通過(guò)原核表達(dá)載體構(gòu)建和標(biāo)簽重組蛋白體外誘導(dǎo)及分離純化,并利用體外泛素化實(shí)驗(yàn)體系初步驗(yàn)證了SlSL1的E3泛素連接酶活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SlSL1不需形成E3復(fù)合體,即可發(fā)揮泛素化連接酶活性,但其作用靶蛋白、作用機(jī)制等尚未明確。因此,本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步探討番茄SlSL1基因利用泛素化途徑對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育、環(huán)境應(yīng)答等方面的可能調(diào)控功能提供了研究基礎(chǔ)和線索。