HCV 跨膜蛋白（P7）重組表達(dá)及化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)HCV 感染者血清中抗P7抗體的建立與評(píng)價(jià)①

吳 婕 戴玉柱 張英杰 成 軍 （蚌埠醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，蚌埠 233000）

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是引起丙型肝炎的病原體，可導(dǎo)致肝臟慢性炎癥壞死和纖維化，部分患者可發(fā)展為肝硬化甚至肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）［1］。HCV 的核衣殼蛋白（Core）、包膜蛋白（E1、E2）及跨膜蛋白（P7）是構(gòu)成HCV 外殼蛋白骨架的主要部分，其中P7 是由HCV 基因組2 580~2 768 核苷酸編碼63 個(gè)氨基酸殘基組成的小疏水性蛋白，其編碼基因位于結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白之間，在細(xì)胞體內(nèi)表達(dá)后整合于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，形成六聚體的陽(yáng)離子通道，以利于成熟的病毒顆粒釋放，對(duì)HCV 病毒顆粒釋放有一定促進(jìn)作用，與HCV 病毒顆粒合成、HCV 感染的機(jī)制密切相關(guān)［2］。為了解 P7 蛋白在 HCV 感染者體內(nèi)的免疫應(yīng)答情況及應(yīng)答產(chǎn)物抗P7（anti-P7）抗體及循環(huán)免疫復(fù)合物（P7-IC）與HCV 不同基因型、不同臨床分期、抗病毒治療前后的相關(guān)性，本文重組表達(dá)P7蛋白和建立檢測(cè)HCV 感染者血清中抗P7 抗體的方法，并進(jìn)行應(yīng)用評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 重組表達(dá)P7 蛋白的相關(guān)材料 含HCV1b基因型P7 核酸序列（Accession No：AJ238800）的質(zhì)粒PUC-P7（杭州擎科生物技術(shù)有限公司合成）；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3，本實(shí)驗(yàn)室保存）；限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ、HindⅢ（美國(guó)NEB 公司）；KODPLUS 系列高保真性聚合酶（日本ToYoBo 生物公司）；T4 DNA連接酶（上海生工生物工程股份有限公司）；谷胱甘肽S 轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferases，GST 蛋白，100 μg，北京義翹神州科技股份有限公司）；D2000 DNA Marker（100~2 000 bp）、D5000 DNA Marker（100~5 000 bp，莫納生物科技有限公司）；蛋白Marker（14.4~116.0 kD，美國(guó)Thermo Scientific公司）；Ni-NTA-agarose親和層析柱（德國(guó)QIAGEN公司）。

1.1.2 檢測(cè)血清中抗P7抗體的相關(guān)材料 微孔板Nunc（美國(guó)Thermo Fisher 公司）；包被液（pH=7.4 的0.02 mol/L 磷酸緩沖液）、封閉液（含5%牛血清白蛋白、1%蔗糖、4%明膠、0.2%Proclin 300 防腐劑、pH=7.4 的0.01 mol/L 磷酸緩沖鹽溶液）、洗液（含0.5% 吐溫-20、0.2%Proclin 300 防腐劑、pH=7.4 的0.01 mol/L 磷酸緩沖鹽溶液）、樣本稀釋液（含20%牛血清、pH=7.4 的0.01 mol/L 磷酸緩沖鹽溶液）、底物液 B（含 0.3 g/L 過(guò)氧化脲、pH=7.4 的 0.2 mol/L 磷酸緩沖液）、底物液A（含0.8 g/L 魯米諾、0.008 g/L鄰苯基苯酚、0.025 g/L 4-咪唑苯酚、pH=9.0 的0.1 mol/L 碳酸緩沖液）、酶標(biāo)記抗體稀釋液（含5%牛血清白蛋白、0.5%酶穩(wěn)定劑、0.1%吐溫-20、5μg/ml抗鼠抗體阻斷劑、1μg/L 紅色色素、0.2%Proclin 300防腐劑、pH=7.4 的0.01 mol/L 磷酸緩沖鹽溶液）、酶標(biāo)志物工作液（酶標(biāo)記抗體稀釋液對(duì)1 mg/ml辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗人IgG 標(biāo)記物原液稀釋所得，原液購(gòu)自杭州隆基生物科技有限公司）、陰性、陽(yáng)性對(duì)照分別為熱滅活的非HCV 感染者（抗P7 抗體陰性）和HCV 感染者（抗P7 抗體陽(yáng)性）混合血清或血漿（含0.2%ProClin 300防腐劑），且人類免疫缺陷病毒抗體、梅毒螺旋體抗體、乙型肝炎病毒表面抗原測(cè)試呈陰性，上述所有化學(xué)試劑、藥品均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.3 主要儀器 JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Mini-Protean Tetra電泳儀（美國(guó)伯樂(lè)公司）；Tanon 3500 全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；TZDCL-200S 化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（廈門(mén)天中達(dá)生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 收集血清 隨機(jī)采集2019 年8 月至2020 年10 月于聯(lián)勤保障部隊(duì)第903 醫(yī)院就診的門(mén)診、住院HCV 感染者45 例（廈門(mén)新創(chuàng)公司試劑篩查抗HCV抗體陽(yáng)性，研究組）和同期在聯(lián)勤保障部隊(duì)第903醫(yī)院健康體檢中心體檢的健康體檢者50 例（抗HCV抗體陰性，對(duì)照組）靜脈血，收集血清，或用EDTA 抗凝收集血漿，1 周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)的血清或血漿樣本可于2~8 ℃存放，如需長(zhǎng)時(shí)間存放置于?20 ℃保存，避免反復(fù)凍融和交叉污染。

1.2.2 HCV 全長(zhǎng) P7 的 PCR 擴(kuò) 增 P7 基因 引 物序列（P7 F：5'-ATCGGATCTGGTTCCGCGTGGATCCACCCTAGAGAACCTGGTGGTCC-3'，P7 R：5'-TTAGT?GGTGGTGGTGGTGGTGGGCGTATGCTTGTGGTGGTAA-3'，P7 R1：5'-AGTCAGTCACGATGAATTAAGCTTTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTG-3'），引物中分別引入Bam HⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)（斜體部分），在反向引物P7 R1 中引入6 個(gè)His（組氨酸）及終止密碼子TAA（黑體部分）。以合成的PUC-P7 質(zhì)粒為模板，以P7 F和P7 R為引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，再以第一輪擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物為模板，以P7 F 和P7 R1 為引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。兩輪PCR 擴(kuò)增參數(shù)均為94 ℃2 min 預(yù)變性，94 ℃ 15 s、53 ℃ 30 s、68 ℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 7 min延伸。

1.2.3 PCR 產(chǎn)物鑒定與重組質(zhì)粒pGEx-KG-P7 構(gòu)建 采用限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ和HindⅢ酶切PCR 產(chǎn)物和表達(dá)載體pGEx-KG，酶切體系為50 μl：PCR 產(chǎn)物/pGEX-KG 43 μl，Bam HⅠ 1 μl，HindⅢ1μl，酶切緩沖液NE Buffer 2.1 5μ（l含1 mol/L NaCl、100 mmol/L MgCl2、10 mmol/L DTT、pH=7.9的0.5 mol/L Tris-HCl緩沖鹽溶液）；混勻后37 ℃水浴消化3~4 h，酶切完成后，瓊脂糖凝膠回收所需目的片段和載體片段；回收結(jié)束取出PCR 管，加入上樣緩沖液6×Loading Buffer 9μ（l含0.05%溴酚藍(lán)、0.05%二甲苯腈藍(lán)FF、36%甘油、30 mmol/L EDTA，用2 mol/L NaOH 調(diào)整pH=7.0），混勻，上樣于1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳（150 V，8 min），電泳完畢后將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察PCR 擴(kuò)增片段大小是否約為189 bp。切下含目的片段凝膠，轉(zhuǎn)至2 個(gè)新的無(wú)菌1.5 ml離心管，將凝膠塊切碎，采用AXYGEN膠回收試劑盒進(jìn)行DNA片段回收。限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ和HindⅢ酶切后的目的片段和表達(dá)載體pGEX-KG用T4 DNA 連接酶連接（16 ℃，8~12 h），送杭州擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，與P7目的片段序列比較是否一致。

1.2.4 P7 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將質(zhì)粒P703 轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3），在含 100 mg/L 氨芐青霉素的2×酵母膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)3~4 h，OD600為1.0~2.0時(shí)添加1 mmol/L異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo)培養(yǎng)3 h。

1.2.5 P7 蛋白提取和純化 離心收集菌體，重懸于緩沖液A（含0.2 mol/L NaCl、pH=8.0的50 mmol/L Tris-HCl 緩沖鹽溶液）中超聲波破碎；離心后的包涵體沉淀采用緩沖液B（含0.15 mol/L NaCl、1%Triton X-100、pH=8.0 的 50 mmol/L Tris-HCl 緩沖鹽溶液）洗滌1 次；洗滌離心的沉淀采用緩沖液C（含0.5 mol/L NaCl、8 mol/L 尿 素 、10 mmol/L 咪 唑 、pH=8.0 的 50 mmol/L Tris-HCl 緩沖鹽溶液）重懸溶解后經(jīng)Ni-NTA-agarose 親和層析柱純化，SDS-PAGE電泳，收集目的蛋白。

1.2.6 P7 蛋白復(fù)性 將1.2.5 收集的純化蛋白處理后透析復(fù)性，純化蛋白標(biāo)定為1.0 mg/ml，添加1 mmol/L 二硫蘇糖醇（DTT）室溫反應(yīng)30 min；加入0.1%SDS 室溫反應(yīng)15 min，反應(yīng)結(jié)束后裝入含透析緩沖液的透析袋按1∶100 進(jìn)行透析，透析緩沖液為pH=7.5的0.01 mol/L磷酸緩沖液。

1.2.7 抗P7蛋白抗體和GST 蛋白抗體檢測(cè)微孔板制備 以間接法原理制備微孔板，重組HCV 跨膜蛋白P7 抗原最適包被濃度采用方陣（棋盤(pán)）滴定法選擇，將重組HCV 跨膜蛋白P7 抗原采用包被液稀釋至最適工作濃度（GST 蛋白相同濃度），將稀釋后的HCV 跨膜蛋白P7 抗原 100 μl 加入微孔板（2~8 ℃，20~24 h），300 μl/孔加入洗液洗去未吸附到板上的蛋白，反復(fù)洗 3 遍，拍干；200 μl/孔加入封閉液（2~8 ℃，20~24 h）；拍干貼上封板膜，放入密封袋，加入干燥劑2~8 ℃保存待用。

1.2.8 最適酶標(biāo)志物工作液制備 采用酶標(biāo)記抗體稀釋液對(duì)1 mg/ml 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG 標(biāo)志物原液進(jìn)行稀釋，方陣（棋盤(pán)）滴定法選擇最適酶標(biāo)志物工作液。

1.2.9 血清中抗P7抗體和抗GST蛋白抗體檢測(cè)①加樣：將包被的微孔板固定于板架，每次檢驗(yàn)設(shè)陰性對(duì)照2 孔、陽(yáng)性對(duì)照1 孔，分別加入陰、陽(yáng)性對(duì)照各100 μl，另設(shè)空白對(duì)照孔1 孔，不加任何樣本，其余孔加入樣本稀釋液100μl，再平行加入待測(cè)樣本各10 μl 于抗P7 抗體和抗GST 蛋白抗體微孔板，蓋上封板膜振蕩混勻，（37±1）℃孵育30 min，洗滌除去未結(jié)合組分；②加酶標(biāo)志物工作液：除空白對(duì)照孔外，其余孔內(nèi)加入100μl酶標(biāo)志物工作液（兩種微孔板相同的酶標(biāo)記工作液）；③孵育：蓋上封板膜振蕩混勻，（37±1）℃孵育30 min；④洗滌：棄孔內(nèi)液體，將洗液注滿各孔，靜置時(shí)間不超過(guò)60 s，棄孔內(nèi)洗液，重復(fù)洗5 次后拍干；⑤顯色：每孔依次加入底物液B、底物液A 各50μl，振蕩混勻，室溫避光放置15 min；⑥檢測(cè)：TZD-CL-200S 化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)量各孔相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度值（relative luminous intensity value，RLIV），計(jì)算各孔R(shí)LIR=樣本RLIV/陰性對(duì)照RLIV均值。

1.2.10 結(jié)果判斷 ①當(dāng)抗P7 抗體微孔板中樣本RLIV 陰性對(duì)照 RLIV 均值≥2.1，且抗 GST 抗體微孔板中樣本RLIV 陰性對(duì)照RLIV 均值<2.1 時(shí)，為陽(yáng)性；當(dāng)抗P7 抗體微孔板中樣本RLIV 陰性對(duì)照RLIV均值≥2.1，且抗GST 抗體微孔板中樣本RLIV/陰性對(duì)照RLIV 均值≥2.1 時(shí)（患者體內(nèi)存在抗GST 抗體），或當(dāng)抗P7 抗體微孔板中樣本RLIV 陰性對(duì)照RLIV 均值<2.1，且抗GST 抗體微孔板中樣本RLIV陰性對(duì)照RLIV 均值<2.1 時(shí)，則為陰性；②質(zhì)量控制：空白值應(yīng)<30 000 RLIV，各陰性對(duì)照值應(yīng)≤115 000 RLIV，且2 個(gè)陰性對(duì)照孔讀數(shù)與陰性對(duì)照均值差異≤10%，各陽(yáng)性對(duì)照值應(yīng)>231 500 RLIV，否則實(shí)驗(yàn)無(wú)效，需重復(fù)檢驗(yàn)。

1.2.11 抗HCV 跨膜蛋白P7 抗體檢測(cè)試劑盒方法學(xué)指標(biāo)評(píng)價(jià)［3-4］①精密度試驗(yàn)，批內(nèi)不精密度：取已篩查到的高、低濃度樣本，分別重復(fù)檢測(cè)20 次（孔），計(jì)算RLIR 均值和SD，計(jì)算批內(nèi)CV%（<10%為合格）；批間不精密度：取已篩查到的高、低濃度樣本，每天上午、下午各檢測(cè)1 次，共進(jìn)行10 d 20 批檢測(cè)，計(jì)算RLIR 均值和SD，計(jì)算批間CV%（<15%為合格）；②空白限和檢出限，空白限：選擇5份未感染HCV 受檢者血清，每天測(cè)2 批，共檢測(cè)6 d，記錄RLIR 值，共得到60 個(gè)結(jié)果；按Ⅰ類錯(cuò)誤（α=0.05），即LoB有5%可能性含有待測(cè)物；采用非參數(shù)檢驗(yàn)將空白樣品的結(jié)果由小到大排序，第95百分位數(shù)值即為空白限LoB；檢出限：選擇期望濃度為1~5 倍LoB的血清標(biāo)本5 份作為低濃度樣本，每天檢測(cè)2 次，連續(xù)測(cè)定6 d，采用非參數(shù)分析法計(jì)算LoD；5份低濃度樣本連續(xù)12 次測(cè)定，結(jié)果呈非正態(tài)分布，使用非參數(shù)程序估計(jì)LOD，即 LoD=LOB+Ds. β，Ds. β 為低濃度樣品測(cè)定值中位數(shù)（M）和第5 個(gè)百分位數(shù)值的差值；③線性評(píng)價(jià)及分析測(cè)量范圍（AMR）［5］：取未感染HCV 受檢者血清（低值L：1.252 RLIR）和HCV 感染者anti-P7 抗體血清（高值H：18.774 RLIR），按5L、4L+1H、3L+2H、2L+3H、1L+4H、5H 比例配制6 份樣本，每份標(biāo)本檢測(cè)2次取均值，以預(yù)期均值和實(shí)測(cè)均值分別為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析（r2>0.95）；④準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)［6］：取濃度為 37.5 RLIR 的抗 P7 抗體血清（經(jīng)U-Tube 蛋白超濾濃縮得到）分別按5%、10%加至抗P7 陰性血清，平行檢測(cè)3 次，計(jì)算平均CV（90%~110%為合格）；⑤干擾實(shí)驗(yàn)：將類風(fēng)濕因子、乙型肝炎病毒表面抗體、乙型肝炎病毒e 抗體、梅毒螺旋體抗體、人類免疫缺陷病毒Ⅰ型和（或）Ⅱ型抗體陽(yáng)性的血清標(biāo)本與anti-P7 抗體陽(yáng)性（9.332 RLIR）等量混合，同時(shí)以樣本稀釋液為對(duì)照，觀察結(jié)果有無(wú)交叉反應(yīng)；⑥穩(wěn)定性觀察：將同一批號(hào)的抗HCV跨膜蛋白P7抗體檢測(cè)試劑盒（內(nèi)含獨(dú)立包裝的已包被微孔板、樣本稀釋液、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、酶標(biāo)記物工作液、底物液A、底物液B 及洗液）置于2~8 ℃保存，分別于0、3、6、9、12、15、18 個(gè)月檢測(cè)同一份陽(yáng)性對(duì)照血清，每次重復(fù)3次取均值，觀察其穩(wěn)定性（與初次比較<10%為合格）；⑦實(shí)例應(yīng)用：采用制備好的抗HCV 跨膜蛋白P7 抗體和抗GST 蛋白抗體檢測(cè)試劑盒，分別對(duì)45 例HCV 感染者和50 例健康體檢者的血清進(jìn)行抗P7抗體檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)和比較兩組人群抗P7抗體陽(yáng)性率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 研究組與對(duì)照組抗P7抗體檢測(cè)結(jié)果比較采用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 P7 基因擴(kuò)增及表達(dá)載體pGEX-KG 構(gòu)建 以合成的PUC-P7 質(zhì)粒為模板，經(jīng)PCR 擴(kuò)增出含全長(zhǎng)的P7基因（圖1），酶切后電泳鑒定表明P7核酸片段插入大小約為189 bp（不含HIS），與預(yù)期大小相符（圖 2），將 PCR 產(chǎn)物連接至 pGEX-KG 載體，測(cè)序正確（圖3），得到質(zhì)粒pGEX-KG-P7。

圖1 兩輪PCR擴(kuò)增P7基因產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of two rounds of PCR amplified P7 gene products by agarose gel electrophoresis

圖2 P7重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of P7 recombinant protein expression plasmid by restriction enzyme digestion

圖3 連接到pGEX-KG載體上的P7基因測(cè)序圖Fig.3 Sequencing map of P7 gene linked to pGEX-KG vector

2.2 P7 基因在大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）中的表達(dá)、純化及復(fù)性 將質(zhì)粒pGEX-KG-P7 轉(zhuǎn)染至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3），誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生分子量為34 kD 的GST融合蛋白（圖4），呈高表達(dá)。菌體經(jīng)超聲波破碎后，SDS-PAGE 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，表達(dá)蛋白在沉淀中形成包涵體。通過(guò)包涵體裂解及Ni-NTA-agarose 親和層析柱層析后透析復(fù)性，得到穩(wěn)定的蛋白。

圖4 誘導(dǎo)表達(dá)的P7融合蛋白電泳圖（34 kD）Fig.4 Electrophoretogram of induced expression P7 fusion protein（34 kD）

2.3 重組HCV 跨膜蛋白P7 抗原最適包被濃度及酶標(biāo)志物工作液選擇 采用方陣（棋盤(pán)）滴定法選擇重組HCV 跨膜蛋白P7 抗原最適包被濃度及酶標(biāo)志物工作液分別為0.5、0.05 μg/ml，最適加樣量均為100μl（表1）。

表1 方陣滴定法篩選最優(yōu)抗原包被與酶標(biāo)志物濃度（RLIV）Tab.1 Screening the optimal concentration of antigen coating and enzyme marker by square array titration（RLIV）

2.4 試劑盒方法學(xué)指標(biāo)評(píng)價(jià) ①精密度試驗(yàn)：批內(nèi)CV%<10%，批間CV%<15%（表2），精密度較好；②空白限和檢出限分別為1.56 RLIR、5.99 RLIR；③線性回歸方程為y=1.099 1x-0.341 2（圖5），回歸系數(shù)為0.97~1.03，r≥0.975（r2≥0.95），AMR為1.252~18.774 RLIR；④準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)：平均回收率為97.8%；⑤干擾試驗(yàn)：類風(fēng)濕因子、乙型肝炎病毒表面抗體、乙型肝炎病毒e抗體、梅毒螺旋體抗體、人類免疫缺陷病毒Ⅰ型和（或）Ⅱ型抗體陽(yáng)性的血清標(biāo)本對(duì)本試驗(yàn)無(wú)交叉反應(yīng)；⑥穩(wěn)定性結(jié)果：15 個(gè)月內(nèi)試劑盒結(jié)果穩(wěn)定；⑦實(shí)例應(yīng)用：對(duì)隨機(jī)收集的45 例HCV 感染者血清和50 例健康體檢者血清進(jìn)行抗跨膜蛋白P7 抗體檢測(cè)，抗P7 蛋白抗體陽(yáng)性率分別為20%（9/45）和0，而抗GST抗體陽(yáng)性率為0（表3）。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果（n=20）Tab.2 Statistical results of precision experiment（n=20）

表3 HCV感染者抗P7抗體檢測(cè)結(jié)果（n）Tab.3 Detection results of anti-P7 antibody in HCV infected patients（n）

3 討論

丙型肝炎主要由HCV 經(jīng)血液（輸血、針刺、毒品）、性、母嬰及其他途徑傳播，呈全球性流行，未來(lái)10 余年內(nèi)，HCV 感染相關(guān)死亡率（肝衰竭及肝細(xì)胞癌導(dǎo)致的死亡）仍將繼續(xù)提高，危害患者健康和生命，已成為較嚴(yán)重的社會(huì)和公共衛(wèi)生問(wèn)題［1］。在慢性丙型肝炎感染中，宿主免疫因子及HCV 蛋白成分促進(jìn)病毒持久性和免疫系統(tǒng)失調(diào)對(duì)丙型肝炎的免疫發(fā)病機(jī)制具有重要影響，因此了解這些蛋白成分及宿主產(chǎn)生的抗體有助于進(jìn)一步研究丙型肝炎致病機(jī)制［7］。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)抗P7 抗體檢測(cè)的化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒及相關(guān)技術(shù)研究尚屬空白，國(guó)外學(xué)者采用重組Core、E1、E2、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B 蛋白建立免疫印跡法檢測(cè)HCV 感染者血清相應(yīng)蛋白抗體，結(jié)果表明：HCV 感染者中不同蛋白抗體陽(yáng)性率存在差異，本課題組分析可能與HCV 感染者不同病程進(jìn)展、不同基因型、DAA 治療前后及血清中存在循環(huán)免疫復(fù)合物有關(guān)［8］。由于免疫印跡法靈敏度不高，常規(guī)用于臨床診斷丙型肝炎的試劑盒均采用HCV 核衣殼區(qū)重組蛋白C-22、非結(jié)構(gòu)蛋白NS3區(qū)重組蛋白C-200抗原、非結(jié)構(gòu)蛋白NS4區(qū)重組蛋白C-200 和NS5 等作為混合包被抗原的第4 代試劑檢測(cè)抗體，檢測(cè)方法主要有ELISA、膠體金法、化學(xué)發(fā)光方法等，但這些試劑盒僅能檢測(cè)HCV 感染者血清中的混合抗體，且不含抗P7 抗體，也無(wú)法區(qū)分是何種蛋白成分的抗體，無(wú)法全面揭示單個(gè)HCV 蛋白成分在HCV 感染者病情監(jiān)測(cè)、預(yù)后評(píng)估和流行病學(xué)研究等方面的臨床意義［9］。

本研究制備的化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)HCV 感染者血清抗P7 抗體試劑盒中的微孔板，包被了重組的GST融合P7 蛋白，基于文獻(xiàn)［10-11］，P7 蛋白片段較小，直接重組表達(dá)無(wú)法實(shí)現(xiàn)，僅融合P7 蛋白可成功表達(dá)；另外GST 對(duì)P7 蛋白的空間結(jié)構(gòu)無(wú)影響（同樣形成六聚體），因此，本研究選擇GST 和HIS 雙標(biāo)簽融合表達(dá)P7蛋白。采用血清抗P7抗體試劑盒對(duì)45例HCV 感染者血清進(jìn)行檢測(cè)，有9 例抗P7 抗體呈陽(yáng)性（抗GST 抗體陰性），表明HCV 感染者體內(nèi)存在一定比例的抗P7抗體（表3），提示跨膜蛋白P7存在免疫應(yīng)答現(xiàn)象，這些研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示跨膜蛋白P7刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體（anti-P7）和循環(huán)免疫復(fù)合物（P7-IC），以及在HCV 感染者不同基因型及亞型、不同臨床分期（慢性、肝硬化、肝癌）、抗病毒治療前后是否存在差異提供了技術(shù)手段。因此，建立檢測(cè)HCV 感染者血清中抗P7 抗體或P7 循環(huán)免疫復(fù)合物中相應(yīng)抗體的高靈敏度檢測(cè)方法用于HCV 感染者治療、病情監(jiān)測(cè)、預(yù)后評(píng)估和流行病學(xué)研究具有重要意義，為評(píng)價(jià)P7 作為一種新型疫苗靶向誘導(dǎo)表達(dá)病毒抗原的肝細(xì)胞多功能CD4+和CD8+T 細(xì)胞效果或?yàn)橹泻捅砦灰呙绲难芯刻峁┝丝陀^驗(yàn)證指標(biāo)［12-13］。

本研究建立的化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)HCV感染者血清中抗P7抗體基于ELISA 間接法原理：微孔內(nèi)預(yù)先包被重組P7抗原，受檢標(biāo)本血清中待測(cè)抗P7 抗體與固相載體表面的相應(yīng)抗原結(jié)合，通過(guò)洗滌使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開(kāi)，再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)二抗結(jié)合于固相載體，最后加入反應(yīng)底物魯米諾，魯米諾在堿性環(huán)境下被辣根過(guò)氧化物酶氧化而處于激發(fā)態(tài)，當(dāng)從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)，輻射出最大發(fā)射波長(zhǎng)為425 nm 的光，酶促發(fā)光產(chǎn)生的光信號(hào)通過(guò)光電倍增管進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)換后得到相應(yīng)信號(hào)值，以RLIR 表示，待測(cè)抗P7 抗體濃度與化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度在一定條件下呈線性關(guān)系。另外，本研究采用兩種化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑（鄰苯基苯酚和4-咪唑苯酚）發(fā)揮協(xié)同增強(qiáng)效應(yīng)，顯著降低本底信號(hào)及使魯米諾發(fā)光信號(hào)在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定，間接放大了免疫應(yīng)答結(jié)果，使測(cè)定方法具有較高的敏感度和穩(wěn)定性［14］。

為得到有效濃度的P7抗體陽(yáng)性對(duì)照血清，本研究收集HCV 感染者混合血清或血漿（人類免疫缺陷病毒抗體、梅毒螺旋體抗體、乙型肝炎病毒表面抗原測(cè)試呈陰性），并對(duì)其進(jìn)行熱滅活，由于抗P7抗體在HCV 感染者中陽(yáng)性率僅為20%左右，故采用U-Tube 蛋白超濾濃縮（30 kD）管濃縮 IgG 抗體（50 ml 濃縮至10 ml），濃縮后的 HCV 感染者混合血清或血漿中加入0.2%ProClin 300防腐劑，以提高特異P7抗體檢出率。

本研究對(duì)HCV 感染者血清抗P7 抗體的化學(xué)發(fā)光免疫分析法進(jìn)行了方法學(xué)評(píng)價(jià)，結(jié)果表明：各項(xiàng)指標(biāo)符合方法學(xué)要求，該試劑盒可用于HCV 感染者篩查診斷、病情監(jiān)測(cè)、預(yù)后評(píng)估、疾病機(jī)制和流行病學(xué)研究。