紫杉醇通過調控JAK2/STAT3通路對肝纖維化模型大鼠Th17/Treg影響的研究

馮 錦 吳建紅 熊響蓮 莫 若 徐容軍 （武漢市金銀潭醫(yī)院肝病科，武漢 430010）

乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）是引起肝纖維化的主要原因之一，若纖維化進程無法得到有效控制，則會發(fā)展為肝硬化甚至肝癌［1］。在肝纖維化過程中，Janus 激活激酶 2（Janus-activating kinase 2，JAK2）表達和活性增加，促進信號轉導和轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3），誘導 IL-6 及 TGF-β1 表達，促進纖維化［2］。紫杉醇是最重要的抗癌藥物之一，可用于治療不同類型的癌癥。研究顯示，抑制JAK2/STAT3信號通路會提高紫杉醇對肺癌細胞的殺傷作用［3］。最近研究發(fā)現(xiàn)紫杉醇有望用于治療纖維化類疾病，一項Ⅱ期臨床研究顯示，紫杉醇的應用有助于緩解肺癌患者的肺間質纖維化情況［4］。也有體內實驗顯示，紫杉醇會通過抑制TGF-β1 表達緩解大鼠腎纖維化［5］，但關于紫杉醇對肝纖維化的影響及作用機制仍不明確。研究顯示，免疫炎癥反應在肝纖維化進程中發(fā)揮重要作用，在肝纖維化患者體內存在T 淋巴細胞亞群的改變，具有抗炎作用的T 輔助細胞17（T helper cells 17，Th17）比例提高，而具有抗炎作用的調節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Treg）水平則降低［6］。最新一項研究顯示，Th17/Treg 平衡受JAK2/STAT3 通路調控［7］。本研究主要分析紫杉醇對HBV 相關肝纖維化大鼠T 淋巴細胞亞群的影響，并分析其對JAK2/STAT3通路的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF 級雄性HBV 轉基因小鼠（北京維通利華動物公司，中國）；四氯化碳、TRIzol（Sigma 公司，美國）；HE染色、Masson染色和ELISA試劑盒（碧云天公司，中國）；PrimeScript-RT 和SYBR Premix Ex Taq 試劑盒（TaKaRa 公司，日本）；RIPA 裂解緩沖液（Beyotime，中國北京）；BCA 試劑盒（武漢博斯特生物技術有限公司，中國）；抗體（Abcam 公司，美國）。PVDF 膜（Bio-Rad 公司，美國）；流式細胞儀及小鼠Treg/Th17 表型抗體試劑（Becton Dickinson 公司，美國）；免疫磁珠（Invitrogen 公司，美國）；酶標儀（Model 680，Bio-Rad，美國）；組織勻漿機（Thermo Fisher Scientific公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 分組、建模和干預 36 只大鼠隨機分為對照組、模型組和紫杉醇組（n=12）。模型組和紫杉醇組小鼠根據(jù)參考文獻［8］的方法構建HBV 相關肺纖維化模型。將四氯化碳溶解于橄欖油，濃度為10%，腹腔注射，每次1 ml/kg，每周2次，連續(xù)8周，對照組注射等量生理鹽水。建模期間，紫杉醇組每日尾靜脈注射紫杉醇［5］，在第 6、7、8 周進行，劑量為2 mg/kg，1 次/d，連續(xù)3 周。對照組和模型組幼鼠使用等量的生理鹽水干預。

1.2.2 ELISA 檢測肝功能 取小鼠眼眶血，以3 000 r/min 離心15 min，收集上清液，根據(jù)試劑盒說明書加入抗體和顯色劑，終止顯色反應后15 min 內通過酶標儀檢測450 nm 處的吸光度值，然后根據(jù)標準曲線計算AST和ALT的濃度。

1.2.3 HE 染色檢測肺組織損傷 小鼠經(jīng)頸椎脫臼處死，收集肺動脈血管組織并置于多聚甲醛固定48 h。將固定好的組織樣本利用梯度濃度乙醇脫水，然后加入二甲苯透明處理并包埋至石蠟中，使用切片機切成4μm 厚的切片。切片水化后制成玻片標本，加入蘇木精孵育5 min，然后加入0.5%的伊紅染色5 min，洗滌后透化，固定，在顯微鏡下觀察。

1.2.4 Masson 染色檢測纖維化 將1.2.2 中的玻片標本加入Masson 三色染料進行染色，根據(jù)試劑盒說明書方法操作，最后在顯微鏡下觀察并拍照，利用IPP6.0 圖像分析系統(tǒng)計算膠原蛋白的體積分數(shù)（CVF）。

1.2.5 RT-qPCR 檢 測 mRNA TRIzol 法 獲 得 肝 組織中的總RNA，采用逆轉錄試劑盒將1 μg 的RNA逆轉錄為cDNA（42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min，然后 4 ℃保存）。使用SYBR Green PCR Master Mix 和PCR 檢測系統(tǒng)進行 qPCR 實驗（95 ℃ 10 min，40 個循環(huán)，94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，4 ℃保存）。以GAPDH 為內參，通過比較循環(huán)閾值分析mRNA 的表達水平。

1.2.6 Western blot 檢測蛋白 將心肌組織用勻漿機均勻研磨并萃取出總蛋白，通過BCA 試劑盒測定濃度。分別取40 μg 總蛋白行10%SDS-PAGE 電泳（80~120 V，90 min）。在100 mV 的恒定電壓下濕轉至PVDF 膜。將 1∶500 稀釋的anti-TLR4、anti-NF-κB加入分離的蛋白質，并在4 ℃下孵育過夜。洗滌后室溫下添加二抗孵育1 h。然后加入化學發(fā)光試劑顯影。以GAPDH 為內參，Image J 軟件分析目標條帶的灰度值。

1.2.7 流式細胞術檢測Th17 和Treg 外周血經(jīng)密度梯度離心后抽吸淋巴細胞層，獲得單個淋巴細胞懸浮液。細胞用20μl預冷的1×BD Mouse緩沖液在暗室、4 ℃條件下固定30 min，然后洗滌固定劑并收集細胞。細胞中加入200μl 通透緩沖液，并將細胞在37 ℃下避光孵育30 min。洗滌后將細胞分別與20μl 小鼠Treg/Th17 表型抗體試劑或對照抗體在室溫下孵育30 min。然后洗掉抗體，將細胞重懸并通過FACS Calibur 流式細胞儀檢測，分析Th17 和Treg的百分比。

1.2.8 Western blot 檢測淋巴細胞中JAK2/STAT3通路 首先通過密度梯度離心法分離單個核細胞，使用免疫磁珠分離T 淋巴細胞，然后根據(jù)1.2.6 方法檢測JAK2和STAT3蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學處理 統(tǒng)計分析使用SPSS19.0 軟件。數(shù)據(jù)以表示。多組間比較進行單因素方差分析，兩兩比較使用SNK-q檢驗。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 紫杉醇對肝纖維化模型小鼠肝功能指標的影響 三組小鼠肝功能指標比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。模型組ALT 和AST 水平顯著高于對照組（P<0.05），紫杉醇組ALT 和AST 水平顯著低于模型組（P<0.05），見表1。

表1 紫杉醇對肝纖維化模型小鼠肝功能指標的影響（）Tab.1 Effect of paclitaxel on liver function indexes of hepatic fibrosis model mice（）

表1 紫杉醇對肝纖維化模型小鼠肝功能指標的影響（）Tab.1 Effect of paclitaxel on liver function indexes of hepatic fibrosis model mice（）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

AST/（U·L?1）114.68±9.67 275.12±28.061）186.34±21.342）67.473 0.000 Groups Control Model Paclitaxel n 12 12 12 F P ALT/（U·L?1）37.95±4.06 147.42±16.881）80.28±9.472）93.624 0.000

2.2 紫杉醇對肝纖維化模型小鼠肝組織損傷的影響 如圖1所示，對照組肝組織染色均勻，細胞和呈圓形，細胞排列有序，肝小葉結構清晰。模型組肝細胞膨大，肝小葉結構遭到破壞，并出現(xiàn)嚴重的出血和炎癥浸潤。紫杉醇組可觀察到肝小葉結構，炎癥浸潤情況較模型組輕。

圖1 HE 染色檢測紫杉醇對肝纖維化小鼠肝組織損傷的影響（×200）Fig.1 HE staining to detect effect of paclitaxel on liver tissue damage in mice with hepatic fibrosis（×200）

2.3 紫杉醇對肝纖維化模型小鼠肝纖維化的影響 如圖2所示，紅色為細胞，藍色為被染色的膠原蛋白等纖維化組織。三組CVF 水平比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。模型組CVF 水平顯著高于對照組（P<0.05），紫杉醇組CVF 水平顯著低于模型組（P<0.05），見表2。

表2 紫杉醇對肝纖維化模型小鼠肝纖維化的影響（）Tab.2 Effects of paclitaxel on liver fibrosis in model mice with hepatic fibrosis（）

表2 紫杉醇對肝纖維化模型小鼠肝纖維化的影響（）Tab.2 Effects of paclitaxel on liver fibrosis in model mice with hepatic fibrosis（）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

CVF（%）0.89±0.14 11.24±1.641）4.15±0.982）167.743 0.000 Groups Control Model Paclitaxel n 12 12 12 F P

圖2 Masson 染色檢測紫杉醇對肝纖維化小鼠肝纖維化的影響（×200）Fig.2 Masson staining to detect effect of paclitaxel on liver fibrosis in mice with hepatic fibrosis（×200）

2.4 紫杉醇對肝纖維化模型小鼠肝組織中IL-6 和TGF-β1 蛋白表達水平的影響 三組小鼠肝組織中IL-6 和TGF-β1 蛋白表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。模型組IL-6 和TGF-β1 蛋白水平顯著高于對照組（P<0.05），紫杉醇組 IL-6 和TGF-β1 蛋白水平顯著低于模型組（P<0.05），見圖3、表3。

表3 紫杉醇對肝纖維化模型小鼠肝組織中IL-6和TGF-β1蛋白表達的影響（）Tab.3 Effect of paclitaxel on expressions of IL-6 and TGF-β1 protein in liver tissue of hepatic fibrosis model mice（）

表3 紫杉醇對肝纖維化模型小鼠肝組織中IL-6和TGF-β1蛋白表達的影響（）Tab.3 Effect of paclitaxel on expressions of IL-6 and TGF-β1 protein in liver tissue of hepatic fibrosis model mice（）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

TGF-β1 0.72±0.07 3.87±0.351）2.18±0.202）215.743 0.000 Groups Control Model Paclitaxel n 12 12 12 F P IL-6 0.64±0.06 2.47±0.221）1.57±0.132）175.883 0.000

圖3 Western blot檢測紫杉醇對肝纖維化模型小鼠肝組織中IL-6和TGF-β1蛋白表達的影響Fig.3 Effect of paclitaxel on expressions of IL-6 and TGF-β1 protein in liver tissue of hepatic fibrosis model mice were detected by Western blot

2.5 紫杉醇對肝纖維化模型小鼠肝組織中JAK2和STAT3 mRNA 表達水平的影響 三組小鼠肺組織JAK2 和STAT3 mRNA 表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。模型組JAK2 和STAT3 mRNA 表達水平顯著高于對照組，紫杉醇組JAK2 和STAT3 mRNA表達水平顯著低于模型組，見表4。

表4 紫杉醇對肝纖維化模型小鼠肝組織中JAK2 和STAT3 mRNA表達的影響（）Tab.4 Effect of paclitaxel on expressions of JAK2 and STAT3 mRNA in liver tissues of model mice with hepatic fibrosis（）

表4 紫杉醇對肝纖維化模型小鼠肝組織中JAK2 和STAT3 mRNA表達的影響（）Tab.4 Effect of paclitaxel on expressions of JAK2 and STAT3 mRNA in liver tissues of model mice with hepatic fibrosis（）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

STAT3 mRNA 1.82±0.17 5.15±0.501）3.27±0.312）217.239 0.000 Groups Control Model Paclitaxel n 12 12 12 F P JAK2 mRNA 1.75±0.17 4.89±0.481）3.21±0.322）203.431 0.000

2.6 紫杉醇對肝纖維化模型小鼠肝組織JAK2/STAT3通路中蛋白表達水平的影響 三組小鼠肺組織JAK2/STAT3 通路中蛋白表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。模型組JAK2 和STAT3 蛋白表達水平顯著高于對照組，紫杉醇組JAK2 和STAT3蛋白表達水平顯著低于模型組，見圖4、表5。

圖4 Western blot檢測紫杉醇對肝纖維化模型小鼠肝組織中JAK2和STAT3蛋白表達水平的影響Fig.4 Effect of paclitaxel on expression levels of JAK2 and STAT3 protein in liver tissue of hepatic fibrosis model mice were detected by Western blot

表5 紫杉醇對肝纖維化模型小鼠肝組織中JAK2 和STAT3蛋白表達的影響（）Tab.5 Effect of paclitaxel on expressions of JAK2 and STAT3 protein in liver tissues of model mice with hepatic fibrosis（）

表5 紫杉醇對肝纖維化模型小鼠肝組織中JAK2 和STAT3蛋白表達的影響（）Tab.5 Effect of paclitaxel on expressions of JAK2 and STAT3 protein in liver tissues of model mice with hepatic fibrosis（）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

STAT3 0.98±0.09 3.11±0.301）2.06±0.192）171.096 0.000 Groups Control Model Paclitaxel n 12 12 12 F P JAK2 0.84±0.08 3.05±0.281）2.14±0.202）175.473 0.000

2.7 紫杉醇對肝纖維化模型小鼠T 淋巴細胞亞群的影響 如圖5 所示，IL-17+CD4+細胞為Th17；如圖6所示，F(xiàn)OXO3+CD25+細胞為Treg。三組小鼠T淋巴細胞亞群比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。模型組小鼠Th17 和Th17/Treg 水平顯著高于對照組，Treg 水平顯著低于對照組（P<0.05）。紫杉醇組Th17和Th17/Treg水平顯著低于模型組，Treg水平顯著高于模型組（P<0.05），見表6。

圖5 紫杉醇對肝纖維化模型小鼠Th17亞群的影響Fig.5 Effect of paclitaxel on Th17 subsets in hepatic fibro?sis model mice

圖6 紫杉醇對肝纖維化模型小鼠Treg亞群的影響Fig.6 Effect of paclitaxel on Treg subsets in hepatic fibro?sis model mice

表6 紫杉醇對肝纖維化模型小鼠T 淋巴細胞亞群的影響（）Tab.6 Effects of paclitaxel on T lymphocyte subsets in model mice with hepatic fibrosis（）

表6 紫杉醇對肝纖維化模型小鼠T 淋巴細胞亞群的影響（）Tab.6 Effects of paclitaxel on T lymphocyte subsets in model mice with hepatic fibrosis（）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

Th17/Treg 0.31±0.04 1.77±0.231）0.73±0.872）97.356 0.000 Groups Control Model Paclitaxel n 12 12 12 F P Th17（%）1.05±0.16 2.75±0.381）1.94±0.202）86.586 0.000 Treg（%）3.41±0.51 1.55±0.251）2.67±0.382）92.074 0.000

2.8 紫杉醇對肝纖維化模型小鼠單個核細胞中JAK2/STAT3 通路的影響 分離外周血單個核細胞進行Western blot 實驗，結果顯示，三組小鼠單個核細胞中JAK2 和STAT3 蛋白表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。模型組單個核細胞中JAK2 和STAT3 蛋白水平顯著高于對照組（P<0.05），紫杉醇組單個核細胞中JAK2 和STAT3 蛋白顯著低于模型組（P<0.05），見圖7、表7。

圖7 Western blot 檢測紫杉醇對肝纖維化模型小鼠單個核細胞中JAK2和STAT3蛋白表達水平的影響Fig.7 Effect of paclitaxel on expression levels of JAK2 and STAT3 protein in monocytes of hepatic fibrosis model mice were detected by Western blot

表7 紫杉醇對肝纖維化模型小鼠單個核細胞中JAK2/STAT3通路的影響（）Tab.7 Effect of paclitaxel on JAK2/STAT3 pathway in monocytes of hepatic fibrosis model mice（）

表7 紫杉醇對肝纖維化模型小鼠單個核細胞中JAK2/STAT3通路的影響（）Tab.7 Effect of paclitaxel on JAK2/STAT3 pathway in monocytes of hepatic fibrosis model mice（）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

STAT3 0.91±0.09 3.48±0.331）1.85±0.182）94.228 0.000 Groups Control Model Paclitaxel n 12 12 12 F P JAK2 0.97±0.09 3.65±0.341）1.53±0.152）97.365 0.000

3 討論

肝纖維化可由多種因素誘發(fā)，是慢性肝損傷的傷口愈合反應，肝纖維化參與肝損傷、肝硬化抑制腫瘤的病理過程。HBV 感染是引起肝炎、肝纖維化、肝硬化的最主要因素之一，肝纖維化嚴重影響患者的生活質量和生命健康，但目前尚無治療肝纖維化的特效療法［9］。因此，尋找能夠有效緩解肝纖維化的方法具有重要的臨床意義。

作為一種天然產(chǎn)物，紫杉醇在治療惡性腫瘤中具有廣泛應用，其可通過影響微管蛋白二聚體的動態(tài)平衡誘導細胞凋亡并抑制增殖［10］。近年來研究顯示，低于細胞毒性濃度的紫杉醇具有抗纖維化作用。最新研究結果顯示，對于牛血清白蛋白誘導的肝纖維化模型，紫杉醇具有緩解肝損傷和抑制纖維化進程作用［11］。也有研究顯示，霧化紫杉醇脂質體吸入可緩解博來霉素誘導的大鼠肺纖維化［12］。但對于HBV 相關的肝纖維化，紫杉醇是否發(fā)揮作用仍不清楚。本研究利用感染HBV 的小鼠誘導肝纖維化模型，并通過HE 染色和Masson 染色驗證了建模結果。結果表明，紫杉醇干預可明顯抑制肝組織損傷，保護肝功能，抑制纖維化。提示紫杉醇對于HBV 相關的肝纖維化也具有緩解作用。此外，本研究還顯示模型組小鼠肝組織中JAK2、STAT3 mRNA和蛋白水平顯著升高，而紫杉醇會抑制JAK2 和STAT3 的轉錄和翻譯。JAK2/STAT3 通路的激活可提高纖維化執(zhí)行因子IL-6和TGF-β1的表達水平，研究顯示，JAK2/STAT3通路的提高會引起腫瘤細胞對紫杉醇的抗性，且紫杉醇對JAK2/STAT3 通路也具有抑制作用［13-15］。提示紫杉醇可能通過抑制JAK2/STAT3 通路抑制STAT3 的轉錄功能，從而減少IL-6和TGF-β1 的表達水平，進而抑制纖維化，保護肝功能。

近年來研究顯示，HBV 感染會誘導Th17/Treg平衡失調，在合并HBV 感染的肝纖維化患者外周血中，Th17/Treg 平衡向 Th17 偏移［16］。Th17 細胞比例的升高可誘導巨噬細胞、中性粒細胞等活化并誘發(fā)炎癥反應；此外，Th17 可通過誘導 IL-6 和 TGF-β1 表達促進纖維化［17］。Treg 可拮抗 Th17 及其細胞因子的功能，從而抑制纖維化［18］。重要的是，T 淋巴細胞的分化也受JAK2/STAT3 通路調控，JAK2/STAT3 通路的激活會促進單核細胞分化為Th17，并且抑制Treg 分化［19］。本研究結果顯示，在 HBV 相關的肝纖維化小鼠模型中，Th17/Treg 平衡向Th17 偏移，淋巴細胞中JAK2 和STAT3 蛋白水平也升高，而紫杉醇可抑制Th17 誘導Treg，并抑制淋巴細胞中JAK2/STAT3 通路。研究顯示，紫杉醇可調控接受化療的宮頸癌患者的免疫功能，調控T 淋巴細胞分化［20］。FONG 等［21］的研究結果也顯示，在癌癥中，紫杉醇可調控Treg 分化調節(jié)免疫水平。提示紫杉醇不但可通過抑制肝組織中JAK2/STAT3 抑制纖維化，還可能通過抑制JAK2/STAT3 通路抑制T 淋巴細胞向Th17 分化并誘導Treg 分化，從而抑制免疫炎癥反應，進一步抑制肝纖維化，保護肝功能。

綜上所述，紫杉醇可減少肝組織中IL-6和TGF-β1表達，并誘導失衡的Th17/Treg 平衡向Treg 偏移，從而緩解HBV 相關的肝纖維化，且紫杉醇抗纖維化的機制可能與其具有抑制JAK2/STAT3 通路的作用有關。但關于紫杉醇抑制HBV 相關肝纖維化的療效仍需進一步的臨床研究驗證，且其作用機制需要深入探究。