陽(yáng)虛寒凝型兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型建立初探

桂 苗，施珊妮，黃澤靈，何俊君，李田花，洪振強(qiáng)，3*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)雜志社，福建 福州 350122；3.中醫(yī)骨傷及運(yùn)動(dòng)康復(fù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122；）

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種常見(jiàn)的慢性退行性病變，臨床上以膝關(guān)節(jié)疼痛、腫大、僵硬伴關(guān)節(jié)功能障礙等癥狀為主要表現(xiàn)，所引起的活動(dòng)障礙和長(zhǎng)期慢性疼痛嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量［1］。《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》［2］將KOA分為腎虛髓虧、陽(yáng)虛寒凝、瘀血阻滯3個(gè)證型，其中陽(yáng)虛寒凝型是臨床常見(jiàn)的證型［3-4］。故本實(shí)驗(yàn)采用關(guān)節(jié)腔注射木瓜蛋白酶、薄荷油灌胃聯(lián)合恒溫恒濕培養(yǎng)箱建立兔陽(yáng)虛寒凝型KOA模型，并進(jìn)行中醫(yī)證型探討，為KOA中醫(yī)證候病理研究建立動(dòng)物模型提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4月齡健康新西蘭大白兔24只，體質(zhì)量（2.0±0.5）kg，雌雄各半，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：［SCXK（滬）2017-0008］，委托福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心代購(gòu)并飼養(yǎng)，動(dòng)物使用許可證號(hào)：［SYXK（閩）2020-0003］。實(shí)驗(yàn)前均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 薄荷油（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：S24778）；木瓜蛋白酶（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：P8150）；蘇木精-伊紅染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：G1120-3）；白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（上海西唐生物科技有限公司，批號(hào)：MM-030501、MM-024001）。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 自動(dòng)脫水機(jī)、組織包埋機(jī)、光學(xué)顯微鏡均購(gòu)自德國(guó)Leica公司；酶標(biāo)儀（芬蘭Thermo公司）；肛溫計(jì)（深圳市米樂(lè)儀器有限公司）；脈搏血氧儀（上海市貝瑞電子科技有限公司）；恒溫恒濕培養(yǎng)箱（天津市宏諾儀器有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組 將24只4月齡新西蘭大白兔按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、木瓜蛋白酶組、陽(yáng)虛組、陽(yáng)虛寒凝組，每組各6只。

2.2 模型建立 造模周期共4周。正常組不予干預(yù)，常規(guī)飼養(yǎng)；其余3組分別在第1周的第1、4、7 d采用關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射4%木瓜蛋白酶溶液0.1 mL建立KOA模型［5-6］，造模前1 d，進(jìn)行膝關(guān)節(jié)周圍備皮，造模時(shí)，消毒膝關(guān)節(jié)后注射木瓜蛋白酶溶液0.1 mL至關(guān)節(jié)腔，注射后再次消毒，用棉球壓住針眼，多次屈伸膝關(guān)節(jié)使木瓜蛋白酶溶液充分浸潤(rùn)至整個(gè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)；陽(yáng)虛寒凝組從第1周開始持續(xù)4周每日置于濕度為50%～60%、溫度為4～6℃、體積為1.2 m×1.2 m×1.8 m的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中不限活動(dòng)1.5 h［7］，第3周予以0.65 mL/（kg·d）薄荷油連續(xù)灌胃2周建立陽(yáng)虛寒凝模型［8-9］；陽(yáng)虛組第3周開始予以0.65 mL/（kg·d）薄 荷 油 連續(xù) 灌 胃2周 建 立 陽(yáng) 虛模型。

2.3 取材 造模結(jié)束后隔日取材，取材前12 h動(dòng)物禁食不禁水，予3%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉。將麻醉后兔子仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，用手術(shù)刀沿膝關(guān)節(jié)正中線劃開皮膚，逐層分離肌肉，切斷髕韌帶，充分暴露膝關(guān)節(jié)囊后抽取關(guān)節(jié)液，將抽取的關(guān)節(jié)液迅速注入Ep管，并置于-80℃冰箱保存待測(cè)。取下膝關(guān)節(jié)滑膜組織和軟骨組織，滑膜組織用4%多聚甲醛固定后流水沖洗，常規(guī)包埋；軟骨組織用4%多聚甲醛固定后流水沖洗，常規(guī)脫鈣、包埋。

2.4 KOA模型檢測(cè)指標(biāo)及方法

2.4.1 膝關(guān)節(jié)滑膜、軟骨病理形態(tài)學(xué)觀察 將包埋后的滑膜、軟骨組織切片，蘇木精-伊紅（HE）染色后脫水、透明、固封，光鏡下觀察滑膜、軟骨組織的形態(tài)學(xué)改變。

2.4.2 膝關(guān)節(jié)軟骨損傷程度評(píng)價(jià) 采用改良Mankin's評(píng)分法對(duì)KOA模型膝關(guān)節(jié)軟骨損傷程度進(jìn)行評(píng)價(jià)［10］，主要評(píng)價(jià)軟骨組織的結(jié)構(gòu)、染色、潮線、細(xì)胞數(shù)量。分?jǐn)?shù)越高，表示關(guān)節(jié)軟骨損傷越嚴(yán)重。

2.4.3 膝關(guān)節(jié)周徑測(cè)量和Lequesne MG評(píng)分 取材當(dāng)天用皮尺測(cè)量4組兔膝關(guān)節(jié)周徑，觀察兔膝關(guān)節(jié)腫脹疼痛程度和屈伸功能，采用Lequesne MG評(píng)分［11］評(píng)估膝關(guān)節(jié)功能。

2.4.4 關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α含量檢測(cè) 取出凍存的關(guān)節(jié)液，采用ELISA法檢測(cè)關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α含量。

2.5 陽(yáng)虛寒凝模型指標(biāo)評(píng)定 測(cè)定兔體質(zhì)量、肛溫、心率及計(jì)算中醫(yī)證候評(píng)分。取材前稱取4組兔體質(zhì)量，采用肛溫計(jì)測(cè)量兔肛溫，采用脈搏血氧儀測(cè)量兔心率。參照《辨證論治實(shí)驗(yàn)方法學(xué)：實(shí)驗(yàn)小鼠診法與辨證》［12］，以表1、表2所列的癥狀及權(quán)重對(duì)陽(yáng)虛癥狀和寒凝癥狀進(jìn)行評(píng)分（權(quán)重=評(píng)分），評(píng)分由2名主治中醫(yī)師獨(dú)立評(píng)定，意見(jiàn)不一致時(shí)通過(guò)討論并與第3名主治中醫(yī)師商議決定。

表1 陽(yáng)虛癥狀及權(quán)重

表2 寒凝癥狀及權(quán)重

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料符合正態(tài)性分布的以（±s）表示，方差齊采用單因素方差分析中LSD-t法，方差不齊采用Games-Howell法。

3 結(jié) 果

3.1 4組膝關(guān)節(jié)軟骨病理形態(tài)學(xué)比較 正常組軟骨組織切線層連續(xù)且完整，移行層中軟骨細(xì)胞縱向條索狀分布且排列規(guī)律，輻射層、鈣化層結(jié)構(gòu)完整，層次清晰；木瓜蛋白酶組、陽(yáng)虛組、陽(yáng)虛寒凝組軟骨組織表面不規(guī)整，纖維方向出現(xiàn)偏移、變薄，軟骨細(xì)胞排列紊亂。見(jiàn)圖1。

圖1 4組膝關(guān)節(jié)軟骨病理形態(tài)學(xué)比較（HE染色，×50）

3.2 4組膝關(guān)節(jié)滑膜病理形態(tài)學(xué)比較 正常組滑膜表面平整，滑膜襯里細(xì)胞為一層，襯里下層細(xì)胞排列疏松，無(wú)纖維組織、血管增生，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；木瓜蛋白酶組、陽(yáng)虛組、陽(yáng)虛寒凝組滑膜表面不平整，滑膜襯里細(xì)胞層數(shù)增生明顯，襯里下層細(xì)胞排列紊亂，有纖維組織增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖2。

圖2 4組膝關(guān)節(jié)滑膜病理形態(tài)學(xué)比較（HE染色，×100）

3.3 4組膝關(guān)節(jié)軟骨損傷改良Mankin's評(píng)分比較 正常組改良Mankin's評(píng)分為（0.33±0.21）分，木瓜蛋白酶組、陽(yáng)虛組、陽(yáng)虛寒凝組改良Mankin's評(píng)分分別為（8.17±0.31）、（7.33±0.21）、（7.00±0.26）分。與正常組比較，木瓜蛋白酶組、陽(yáng)虛組、陽(yáng)虛寒凝組改良Mankin's評(píng)分均顯著升高（P均＜0.05）。

3.4 4組膝關(guān)節(jié)周徑、Lequesne MG評(píng)分、關(guān)節(jié)液中IL-1β和TNF-α含量比較 見(jiàn)表3。

表3 4組兔膝關(guān)節(jié)周徑、Lequesne MG評(píng)分、關(guān)節(jié)液中IL-1β和TNF-α含量比較（±s）

表3 4組兔膝關(guān)節(jié)周徑、Lequesne MG評(píng)分、關(guān)節(jié)液中IL-1β和TNF-α含量比較（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與木瓜蛋白酶組比較，2）P＜0.05。

組別正常組木瓜蛋白酶組陽(yáng)虛組陽(yáng)虛寒凝組n6 6 6 6周徑/cm 11.217±0.221 12.508±0.1351）12.517±0.2671）12.508±0.1291）Lequesne MG評(píng)分/分0.500±0.224 4.667±0.2111）4.833±0.1671）5.333±0.2111）2）IL-1β/（ng/L）61.488±5.041 116.113±2.2661）110.067±3.2221）115.472±2.4321）TNF-α/（ng/L）48.115±4.430 115.173±3.0311）115.210±3.8591）116.225±3.4311）

3.5 4組陽(yáng)虛寒凝模型指標(biāo)比較 4組兔體質(zhì)量、肛溫、心率、中醫(yī)證候評(píng)分比較見(jiàn)表4。

表4 4組兔體質(zhì)量、肛溫、心率、中醫(yī)證候評(píng)分比較（±s）

表4 4組兔體質(zhì)量、肛溫、心率、中醫(yī)證候評(píng)分比較（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與木瓜蛋白酶組比較，2）P＜0.05；與陽(yáng)虛組比較，3）P＜0.05。

組別正常組木瓜蛋白酶組陽(yáng)虛組陽(yáng)虛寒凝組n6 6 6 6體質(zhì)量/kg 2.57±0.05 2.48±0.03 2.35±0.031）2）2.24±0.051）2）肛溫/℃38.633±0.088 38.783±0.101 37.817±0.2441）2）37.267±0.1171）2）心率/（次/min）232.500±6.318 251.333±5.880 207.500±6.9991）2）184.167±10.0881）2）3）中醫(yī)證候評(píng)分/分12.500±4.958 30.000±3.992 78.500±2.9971）2）109.833±5.2501）2）3）

4 討 論

4.1 中醫(yī)證候模型指標(biāo)判定 參考《辨證論治實(shí)驗(yàn)方法學(xué)：實(shí)驗(yàn)小鼠診法與辨證》［12］建立動(dòng)物模型中醫(yī)證候評(píng)價(jià)表，從中挑選出符合陽(yáng)虛寒凝證的癥狀，將其分為陽(yáng)虛和寒凝2類癥狀，2類中的相同癥狀，選取陽(yáng)虛癥狀及權(quán)重表中權(quán)重進(jìn)行計(jì)分。以蜷縮、精神萎靡、遲鈍、倦怠、呼吸減弱、軀體移動(dòng)減弱、體溫降低等癥狀判定寒凝證；以唇、耳、毛淡，小便色淡，尾、爪涼，毛發(fā)稀少無(wú)光澤，心率減慢等癥狀判定陽(yáng)虛證。

4.2 KOA模型判定 本研究結(jié)果顯示：與正常組比較，木瓜蛋白酶組、陽(yáng)虛組、陽(yáng)虛寒凝組膝關(guān)節(jié)周徑、Lequesne MG評(píng)分均升高，膝關(guān)節(jié)均出現(xiàn)腫脹、疼痛、屈伸功能障礙，關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α含量明顯升高，表明膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)存在炎癥；3組膝關(guān)節(jié)病理切片顯示滑膜有炎癥性改變，軟骨損傷明顯，改良Mankin's評(píng)分升高，提示膝關(guān)節(jié)滑膜和軟骨均有損傷［13］。這表明關(guān)節(jié)腔注射木瓜蛋白酶能夠成功建立KOA模型。

4.3 陽(yáng)虛寒凝證判定 本研究結(jié)果顯示：與正常組、木瓜蛋白酶組比較，陽(yáng)虛組與陽(yáng)虛寒凝組的陽(yáng)虛寒凝癥狀評(píng)分顯著升高，體質(zhì)量、肛溫與心率顯著降低；與陽(yáng)虛組比較，陽(yáng)虛寒凝組體質(zhì)量、肛溫、心率降低更顯著。這表明陽(yáng)虛寒凝組符合陽(yáng)虛寒凝證候特征，陽(yáng)虛寒凝模型建立成功。

4.4 不足之處分析 本研究探討陽(yáng)虛寒凝的建立是通過(guò)中醫(yī)證候評(píng)分比較，探討中醫(yī)動(dòng)物模型的建立。但表格中的癥狀難以全部依靠肉眼觀察，且僅憑肉眼觀察難以有科學(xué)精準(zhǔn)的評(píng)價(jià)；權(quán)重和評(píng)分之間缺乏客觀的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，而客觀的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于動(dòng)物模型的計(jì)量化辨證具有重要的意義。在建立中醫(yī)證候評(píng)分表上，后續(xù)還需要查閱大量資料，結(jié)合人體臨床表現(xiàn)以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物特征，將中醫(yī)證候評(píng)分表進(jìn)行細(xì)化，為后續(xù)中醫(yī)證候的動(dòng)物模型建立提供量化的指標(biāo)參考。