滅活柱狀黃桿菌浸泡免疫誘導(dǎo)草魚中pIgR和四種細(xì)胞因子免疫應(yīng)答特性的研究

許國晶，王志忠，鞏俊霞，馬汝芳，張金路

(山東省淡水漁業(yè)研究院，山東省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點(diǎn)試驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250013)

引 言

硬骨魚類黏膜免疫系統(tǒng)作為第一道抵抗病原入侵的免疫屏障，在免疫防御過程中發(fā)揮非常重要的作用[1]。魚類黏液中除含有非特異性免疫成分外，還含有免疫球蛋白(Ig)[2]?，F(xiàn)已在魚類黏液中發(fā)現(xiàn)存在除IgM外，還有IgZ(IgZ1、IgZ2)、IgT等多種新型免疫球蛋白[3-5]。新型黏膜免疫球蛋白的發(fā)現(xiàn)，使硬骨魚類黏膜免疫球蛋白的分泌及其轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究成為熱點(diǎn)。

在哺乳動(dòng)物中，多聚免疫球蛋白(pIgA或pIgM)跨上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)是由一種跨膜糖蛋白即多聚免疫球蛋白受體(pIgR)介導(dǎo)的，進(jìn)而發(fā)揮pIgA或pIgM阻止病原體和毒素對(duì)黏膜組織的黏附和入侵的功能[6,7]。資料顯示，硬骨魚類pIgR在分子結(jié)構(gòu)以及免疫功能上與哺乳動(dòng)物pIgR有很多相似之處，不僅能夠結(jié)合血清及黏液中IgM及IgZ/IgT[8-11]，也可以結(jié)合多種細(xì)菌[12]，發(fā)揮免疫功能。研究發(fā)現(xiàn)，海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)感染斑馬魚(Daniorerio)[13]、橈足動(dòng)物感染大西洋鮭(Salmosalar)[14]、滅活鰻弧菌(Vibrioanguillarum)浸泡免疫大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[15]后pIgR基因表達(dá)量出現(xiàn)顯著上調(diào)，與高等動(dòng)物受到病原刺激后pIgR基因呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)相似[16]。在哺乳動(dòng)物中對(duì)pIgR研究顯示，腫瘤壞死因子(TNF α)、干擾素(IFN γ)、白介素(IL-1β及IL-4)等細(xì)胞因子會(huì)上調(diào)/下調(diào)pIgR表達(dá)[17-20]。因此推測(cè)TNF α、IFN γ、IL-1β及IL-4等也能調(diào)控硬骨魚類pIgR的基因表達(dá)，但是目前這方面的研究資料還很少。

本研究用滅活柱狀黃桿菌(Flavobacteriumcolumnare)浸泡免疫草魚(Ctenopharyngodonidellus)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)分析草魚組織中pIgR及細(xì)胞因子TNFα、IFNγ、IL-1β和IL-4基因表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化，進(jìn)而為深入研究硬骨魚類細(xì)胞因子對(duì)pIgR基因表達(dá)的調(diào)控作用及其機(jī)制提供支撐。

1 材料與方法

1.1 滅活柱狀黃桿菌制備

柱狀黃桿菌由廣州仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院提供。細(xì)菌在25 ℃條件下于Shieh培養(yǎng)基(1 L培養(yǎng)液中含蛋白胨5 g，酵母粉0.5 g，0.01 g CH3COONa·3H2O，0.01 g BaCl2·2H2O，0.1 g K2HPO4，0.05 g KH2PO4，0.3 g MgSO4·7H2O，0.006 7 g CaCl2·2H2O，0.001 g FeSO4·7H2O，0.05 g NaHCO3，pH7.2)中振蕩培養(yǎng)48 h后，經(jīng)10 000 r/min離心10 min，收集菌體用滅菌磷酸緩沖液(PBS，pH7.4)洗滌3次；用福爾馬林調(diào)至終濃度1.0%，室溫下放置24 h滅活。隨后再次離心細(xì)菌懸浮液，收集菌體用PBS清洗3次以去除福爾馬林；取100 μL菌懸液涂平板以驗(yàn)證細(xì)菌是否完全滅活；將完全滅活后的柱狀黃桿菌菌苗置于4 ℃冰箱備用。

1.2 浸泡免疫

用于本試驗(yàn)的草魚取自山東省淡水漁業(yè)研究院基地，所有草魚在自動(dòng)水循環(huán)養(yǎng)殖箱中暫養(yǎng)一周，水溫保持在水溫27 ℃±1 ℃。適應(yīng)環(huán)境后，選取體表健康、體長為13～18 cm的草魚，60尾草魚隨機(jī)分成兩組用于試驗(yàn)，每組分三個(gè)養(yǎng)殖箱。第一組用養(yǎng)殖用水稀釋菌液濃度為1×108CFU/mL的滅活柱狀黃桿菌菌液中連續(xù)充氣浸泡30 min；第二組為對(duì)照組，在0.85%PBS中浸泡30 min。

1.3 樣品采集

兩組魚分別于免疫前0 h及免疫后4、8、12、24、48、72、96 h取樣。每次每組隨機(jī)取草魚3尾，分別提取這3尾草魚的皮膚、鰓、腸、肝臟、脾及頭腎6種組織，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA；保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物，引物設(shè)計(jì)模板序列來源于NCBI數(shù)據(jù)庫中草魚pIgR、TNFα、IFNγ、IL-1β及IL-4及核糖體RNA(18S rRNA)基因序列(表1)。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量分析所用引物

以18S rRNA基因?yàn)閮?nèi)參。使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上擴(kuò)增。在20 μL的反應(yīng)體系中含：10 μL的SYBR Premix Ex Taq，1.0 μL cDNA模板，各0.8 μL的正向引物與反向引物(引物的濃度為0.4 μmol/L)，加ddH2O至20 μL。反應(yīng)的條件如下：擴(kuò)增曲線：95 ℃ 30 s，循環(huán)1次；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，循環(huán)40次，72 ℃單點(diǎn)檢測(cè)信號(hào)；溶解曲線：95 ℃ 0 s，65 ℃ 15 s，95 ℃ 0 s，連續(xù)檢測(cè)信號(hào)。根據(jù)所得Ct值，采用2-△△Ct法計(jì)算浸泡免疫后不同時(shí)間點(diǎn)pIgR、TNFα、IFNγ、IL-1β及IL-4在不同組織中的表達(dá)量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)方差分析采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，顯著性水平為P<0.05。圖表處理采用Origin 8。

2 結(jié)果與分析

2.1 浸泡免疫后pIgR基因表達(dá)量的變化

草魚經(jīng)浸泡免疫后，各組織中pIgR的基因水平96 h內(nèi)均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，48 h內(nèi)均有一峰值出現(xiàn)(圖1)。在皮膚和鰓中pIgR基因的相對(duì)表達(dá)量在免疫后4 h開始顯著上升，8 h達(dá)到最高，分別為初始對(duì)照的11.56和7.57倍，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；肝中pIgR表達(dá)量在8 h后顯著高于對(duì)照組，12 h達(dá)到峰值，為對(duì)照組的2.73倍(P<0.05)；腸中pIgR表達(dá)量在8 h后顯著高于對(duì)照組，24 h達(dá)到峰值，為對(duì)照組的4.76倍(P<0.05)；在脾中pIgR表達(dá)量在24 h后顯著高于對(duì)照組，頭腎中pIgR表達(dá)量在12 h后顯著高于對(duì)照組，均于48 h時(shí)達(dá)到峰值，分別為對(duì)照組的11.39倍(P<0.05)和1.91倍(P<0.05)。浸泡PBS對(duì)照組中pIgR表達(dá)量試驗(yàn)周期內(nèi)變化不顯著(P>0.05)。

圖1 柱狀黃桿菌菌浸泡免疫前后草魚組織中pIgR相對(duì)表達(dá)量的變化

2.2 浸泡免疫后TNF α基因表達(dá)量的變化

浸泡免疫后草魚皮膚、鰓、腸、肝、脾臟和腎組織中的TNFα基因變化趨勢(shì)相同，在96 h內(nèi)均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)(圖2)。其中皮膚和鰓中TNFα基因的相對(duì)表達(dá)量到達(dá)峰值時(shí)間最早，在12 h時(shí)達(dá)到峰值，峰值分別為對(duì)照組的2.83和2.75倍，均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；腸、肝和脾中TNFα表達(dá)量從免疫后8 h開始顯著上升，腸和肝中TNFα表達(dá)量在24 h時(shí)達(dá)到峰值，分別為對(duì)照組的2.43倍(P<0.05)和2.21倍(P<0.05)，脾中48 h達(dá)到峰值，為對(duì)照組的3.11倍(P<0.05)；腎中TNFα表達(dá)量從免疫后12 h顯著高于對(duì)照組，48 h時(shí)達(dá)到峰值，為對(duì)照組的2.68倍(P<0.05)。浸泡PBS對(duì)照組中TNFα表達(dá)量試驗(yàn)周期內(nèi)變化不顯著(P>0.05)。

圖2 柱狀黃桿菌菌浸泡免疫前后草魚組織中TNF α相對(duì)表達(dá)量的變化

2.3 浸泡免疫后IFN γ基因表達(dá)量的變化

在浸泡免疫柱狀黃桿菌后，IFNγ基因的相對(duì)表達(dá)量變化與TNFα基因變化趨勢(shì)相同，在96 h內(nèi)呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，且在浸泡免疫24 h內(nèi)均有一峰值出現(xiàn)(圖3)。在皮膚和鰓中IFNγ基因在免疫后4 h開始顯著上升，鰓中IFNγ表達(dá)量在免疫后8 h達(dá)到峰值，為對(duì)照組的25.24倍(P<0.05)；皮膚中IFNγ表達(dá)量在免疫后12 h達(dá)到峰值，為對(duì)照組的48.62倍(P<0.05)；腸、肝、脾和腎中IFNγ表達(dá)量均在免疫后24 h達(dá)到峰值，分別為對(duì)照組的7.18、14.15、10.76和8.19倍，均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。浸泡PBS對(duì)照組中IFNγ表達(dá)量試驗(yàn)周期內(nèi)變化不顯著(P>0.05)。結(jié)果可以看出浸泡免疫引起皮膚和鰓中的IFNγ免疫應(yīng)答較強(qiáng)，達(dá)到對(duì)照組的25～48倍。但是，IFNγ基因表達(dá)量在腸中只有對(duì)照組的7倍左右。

圖3 柱狀黃桿菌菌浸泡免疫前后草魚組織中IFN γ相對(duì)表達(dá)量的變化

2.4 浸泡免疫后IL-1β基因表達(dá)量的變化

浸泡免疫后96 h內(nèi)，草魚各組織IL-1β基因相對(duì)表達(dá)量均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，且在浸泡免疫24 h內(nèi)均有一峰值出現(xiàn)(圖4)；在黏膜免疫組織鰓中IL-1β表達(dá)量在免疫后4 h開始顯著上升，8 h達(dá)到峰值，為對(duì)照組的36.25倍(P<0.05)；皮膚中IL-1β基因表達(dá)量在免疫后4 h開始顯著上升，12 h達(dá)到峰值，為對(duì)照組的56.62倍(P<0.05)；腸、肝、脾和腎中IL-1β基因表達(dá)量均在免疫后8 h開始顯著上升，24 h時(shí)達(dá)到峰值，分別為對(duì)照組的9.26、24.13、46.07和17.4倍，均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。浸泡PBS對(duì)照組中IL-1β表達(dá)量試驗(yàn)周期內(nèi)變化不顯著(P>0.05)。結(jié)果可以看出浸泡免疫引起皮膚和鰓中的IL-1β免疫應(yīng)答較早，脾中IL-1β基因表達(dá)量低于皮膚中，但高于鰓中IL-1β基因表達(dá)量。

圖4 柱狀黃桿菌菌浸泡免疫前后草魚組織中IL-1β相對(duì)表達(dá)量的變化

2.5 浸泡免疫后IL-4基因表達(dá)量的變化

浸泡免疫后草魚各組織中的IL-4基因變化趨勢(shì)與其他基因相同，在96 h內(nèi)均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)(圖5)。其中在鰓中IL-4表達(dá)量在免疫后4 h開始顯著上升，8 h達(dá)到峰值，為對(duì)照組的9.93倍(P<0.05)；在皮膚中，IL-4表達(dá)量在免疫后4 h開始顯著上升，12 h達(dá)到峰值，為對(duì)照組的13.69倍(P<0.05)；腸、肝和脾中IL-4基因表達(dá)量均在免疫后8 h開始顯著上升，24 h時(shí)達(dá)到峰值，分別為對(duì)照組的4.47、9.53、和12.46倍，均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；在腎中，IL-4基因表達(dá)量在免疫后8 h開始顯著上升，48 h達(dá)到峰值，為對(duì)照組的7.18倍(P<0.05)。浸泡PBS對(duì)照組中IL-4表達(dá)量試驗(yàn)周期內(nèi)變化不顯著(P>0.05)。

圖5 柱狀黃桿菌菌浸泡免疫前后草魚組織中IL-4相對(duì)表達(dá)量的變化

3 討論

本研究結(jié)果表明，柱狀黃桿菌浸泡免疫后，草魚各組織中的pIgR、TNFα、IFNγ、IL-1β和IL-4基因表達(dá)量在96 h內(nèi)呈現(xiàn)明顯的先上調(diào)后下降，說明浸泡免疫都能有效引起草魚pIgR及4種細(xì)胞因子的免疫應(yīng)答反應(yīng)。研究表明IFNγ、IL-1β、IL-4及pIgR基因各組織中的上調(diào)幅度高于TNFα基因，浸泡免疫對(duì)草魚黏膜免疫組織皮膚和鰓中pIgR和細(xì)胞因子的基因表達(dá)影響較明顯，到達(dá)峰值的時(shí)間早而且峰值較高。其中皮膚、鰓以及脾中pIgR表達(dá)量峰值遠(yuǎn)高于其他幾種組織，這與大菱鮃中研究結(jié)果相似[15]，推測(cè)可能是因?yàn)槠つw和鰓直接接觸外界的水環(huán)境，而脾是最重要的魚類系統(tǒng)免疫器官，因此這三者免疫應(yīng)答反應(yīng)更顯著。本研究中激活后的pIgR及細(xì)胞因子在96 h恢復(fù)到對(duì)照組水平，Tian et al.[21]結(jié)果表明加強(qiáng)免疫柱狀黃桿菌會(huì)增強(qiáng)鱖魚Ig含量并延長應(yīng)答時(shí)間，因此加強(qiáng)免疫是否可以更長時(shí)間激活pIgR及細(xì)胞因子的應(yīng)答還有待于進(jìn)一步深入的研究。

本研究中浸泡免疫柱狀黃桿菌后，草魚各組織TNFα基因均呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，但TNFα基因上調(diào)變化幅度比IFNγ、IL-1β及IL-4都要小。研究表明，重組TNF α?xí)碳T-29細(xì)胞中的pIgR基因的上調(diào)表達(dá)[20]。Sheng等[22]研究發(fā)現(xiàn)牙鲆FG細(xì)胞系中，重組TNF α?xí)碳G細(xì)胞中的pIgR基因的上調(diào)表達(dá)，并刺激細(xì)胞培養(yǎng)液上清中SC(secretory component)水平上升。TNF可以通過介導(dǎo)經(jīng)典核因子κB(NF-κB)通路的激活，并提高RelB蛋白的穩(wěn)定值進(jìn)而提高pIgR的基因轉(zhuǎn)錄[23-24]。因此，浸泡免疫滅活柱狀黃桿菌后，TNFα基因表達(dá)量增加可能是pIgR基因顯著上調(diào)表達(dá)的原因之一，但具體原因還有待于深入研究。

本研究中草魚各組織IFNγ基因表達(dá)量均顯著增加，與之前研究中IFNγ變化趨勢(shì)一致[25-26]。研究表明重組IFN γ可以刺激HT-29上皮細(xì)胞系中pIgR基因的上調(diào)表達(dá)[20]，與IL-1β、IL-4在pIgR基因表達(dá)調(diào)節(jié)中呈現(xiàn)協(xié)同作用[17-18]。IFN γ主要通過誘導(dǎo)IFN調(diào)節(jié)因子1(IRF1)和IFN調(diào)節(jié)因子2(IRF2)的表達(dá)，進(jìn)而激活pIgR的基因轉(zhuǎn)錄[27-28]，但具體調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

本研究發(fā)現(xiàn)草魚各組織內(nèi)IL-1β均顯著上調(diào)表達(dá)，與牙鲆(Paralichthysolivaceus)[29]、石斑魚(Epinepheluscoioides)[30]中的研究結(jié)果一致。研究表明IL-1β可以顯著刺激HT-29上皮細(xì)胞系中pIgR基因的上調(diào)表達(dá)[14]，也可以顯著上調(diào)鼠小腸上皮細(xì)胞中分泌成分(SC)的表達(dá)[31]。研究表明IL-1β與IFN γ在HT-29上皮細(xì)胞系上協(xié)同上調(diào)SC(pIgR)的表達(dá)[17]。本文研究結(jié)果為進(jìn)一步研究IL-1β調(diào)控pIgR基因表達(dá)提供了數(shù)據(jù)支撐。

本研究中浸泡免疫柱狀黃桿菌后，草魚各組織IL-4基因均呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)。研究表明，重組IL-4會(huì)刺激HT-29細(xì)胞中的pIgR基因的上調(diào)表達(dá)[32]，不僅可以與IFN γ在HT-29細(xì)胞系上協(xié)同調(diào)控pIgR的表達(dá)[17]，并且可以與TNF形成顯著的協(xié)同作用[33]。研究發(fā)現(xiàn)IL-4刺激HT-29細(xì)胞誘導(dǎo)pIgR基因的轉(zhuǎn)錄需要新合成蛋白質(zhì)，因此pIgR轉(zhuǎn)錄較慢，但是卻能迅速引起不依賴于轉(zhuǎn)錄激活因子6激活的蛋白質(zhì)的合成[33]。因此推測(cè)IL-4誘導(dǎo)pIgR基因表達(dá)過程中，pIgR基因的增強(qiáng)子中存在著不依賴于轉(zhuǎn)錄激活因子6的結(jié)合元件，但具體調(diào)控機(jī)制還有待于深入研究。

本文研究結(jié)果表明，柱狀黃桿菌浸泡免疫后，pIgR基因表達(dá)顯著上調(diào)，TNFα、IFNγ、IL-1β以及IL-4細(xì)胞因子的基因表達(dá)也顯著上調(diào)，因此在硬骨魚類中TNF α、IFN γ、IL-1β以及IL-4都可能參與調(diào)控pIgR基因表達(dá)。滅活柱狀黃桿菌刺激誘導(dǎo)這4種細(xì)胞因子基因表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而通過相關(guān)途徑[23]：IFN-γ對(duì)pIgR的調(diào)節(jié)作用與干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF)1和NF-κB通路相關(guān)；IL-4通過其受體激活信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子6，后者與pIgR 2號(hào)外顯子上的相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合，調(diào)節(jié)pIgR的表達(dá)；而IL-1被證明可以活化一個(gè)MyD88依賴性信號(hào)通路，經(jīng)由NF-κB途徑對(duì)pIgR的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)節(jié)；TNF α對(duì)pIgR的調(diào)節(jié)作用與NF-κB通路有關(guān)[34]；進(jìn)而上調(diào)草魚體內(nèi)pIgR基因表達(dá)，但是這4種細(xì)胞因子調(diào)控硬骨魚類pIgR基因表達(dá)的機(jī)制還有待深入研究。