外源白藜蘆醇對(duì)滲透脅迫下玉米幼苗抗氧化系統(tǒng)及生長(zhǎng)的影響

孫海燕，孔德庸，周孌，孫義卓，杜丹鳳，郭偉，2

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶163319；2.黑龍江省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)栽培技術(shù)與作物種質(zhì)改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）

松嫩平原位于東北地區(qū)的中西部，是我國(guó)重要的商品糧生產(chǎn)基地，更是生態(tài)脆弱區(qū)和氣象變化敏感區(qū)[1]。近些年由于氣溫升高，降水量減少，松嫩平原已成為干旱頻發(fā)的地區(qū)之一[2]。因此，研究與應(yīng)用提高作物抗旱能力的栽培技術(shù)，已成為該地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要措施。滲透脅迫是干旱條件下植物受到的最初危害[3]，滲透脅迫的集中反映就是膜脂過(guò)氧化，而活性氧是引起膜脂過(guò)氧化的主要因子。在正常生長(zhǎng)條件下，植物依靠抗氧化系統(tǒng)控制細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平，使其在植物體內(nèi)處于平衡狀態(tài)，該系統(tǒng)的效率由系列小分子物質(zhì)含量和抗氧化酶活性決定[4]。一方面，植物通過(guò)膜成分的改變和活性氧清除系統(tǒng)的激活來(lái)適應(yīng)不利環(huán)境條件[5]；另一方面，當(dāng)植物局部細(xì)胞受到非生物逆境脅迫時(shí)，還能引起全株性系統(tǒng)響應(yīng)，使植物能夠及時(shí)、高效地應(yīng)對(duì)逆境脅迫[6]?；钚匝醯倪^(guò)量產(chǎn)生引起的植物系列反應(yīng)被稱為氧化應(yīng)激，科學(xué)家們?cè)谥参镅趸瘧?yīng)激機(jī)制研究方面取得了重大進(jìn)展。玉米作為典型的C4植物，被認(rèn)為相對(duì)較少地受到活性氧的影響，由ABA、NAC 介導(dǎo)的信號(hào)通路、滲透保護(hù)物質(zhì)合成和蛋白折疊反應(yīng)被認(rèn)為是玉米器官中常見(jiàn)的滲透脅迫應(yīng)激反應(yīng)[7-8]。研究表明，水楊酸[9]、亞精胺[10]、腐植酸[11]等外源物質(zhì)施用均能增強(qiáng)玉米在滲透脅迫下的應(yīng)激反應(yīng)能力。白藜蘆醇是一種生物性很強(qiáng)的天然多酚類物質(zhì)，由葡萄、花生、虎杖、桑椹等植物產(chǎn)生，被認(rèn)為可以預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化、心腦血管等疾病[12]。天然的白藜蘆醇以游離態(tài)和糖苷結(jié)合態(tài)兩種形式在植物中分布及生物合成，且均具有抗氧化效能[13]，而外源白藜蘆醇對(duì)植物的抗氧化特性的影響研究未見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)對(duì)比不同脅迫時(shí)間下葉面噴施白藜蘆醇處理的玉米幼苗活性氧清除酶系統(tǒng)活性、碳氮代謝和幼苗生長(zhǎng)變化，以研究滲透脅迫下玉米對(duì)外源白藜蘆醇的生理響應(yīng)機(jī)制及適宜的葉噴濃度，為玉米的干旱脅迫研究及抗旱栽培技術(shù)的開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

試驗(yàn)用玉米（Zea mays L.）品種為鄭單958。白藜蘆醇（Resveratrol，分子式C14H12O3，分子量228.24）由上海麥克林生化科技有限公司制造。

試驗(yàn)于2019 年10-11 月在黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)的“黑龍江省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)栽培技術(shù)與作物種質(zhì)改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”完成。選取籽粒飽滿、均勻一致的玉米種子，用2%次氯酸鈉溶液浸泡消毒30 min，然后用蒸餾水反復(fù)沖洗干凈，用濾紙將表面水分吸干，置于溫度為20 ℃、相對(duì)濕度為70%的人工氣候培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)7 d，期間根據(jù)濾紙濕度情況及時(shí)補(bǔ)充蒸餾水。7 d 后選取整齊一致的幼苗移植于帶有圓孔的泡沫板上，將移植幼苗的泡沫板（12 株·板-1）置于盛有1/2 Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液的塑料方盒（20 cm×30 cm）中，在人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光照度100 μmol·m-2·s-1，溫度20 ℃，光暗周期為12 h/12 h，每3 d 更換1 次營(yíng)養(yǎng)液，待幼苗第2 片真葉完全展開(kāi)后（玉米三葉期）進(jìn)行白藜蘆醇處理。

分別采用濃度為0（CK）、0.1、0.2、0.4、0.8 mmol·L-1的白藜蘆醇溶液進(jìn)行葉面噴施，每盆噴施50 mL（即全部葉片潤(rùn)濕），按照上述條件繼續(xù)培養(yǎng)。48 h 后更換營(yíng)養(yǎng)液，同時(shí)在營(yíng)養(yǎng)液中按照20%（W/V）加入PEG-6000 進(jìn)行滲透脅迫處理，然后在人工氣候培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)4 次，分別于脅迫處理48 h 和72 h 后取樣測(cè)定。

1.2 測(cè)定方法

選取生長(zhǎng)整齊一致的10 株幼苗，分為根系與地上兩部分，分別用電子天平（精度0.01 g）測(cè)定鮮重（折合成單株重量）；參照劉萍等[14]的方法采用氯化硝基四氮唑藍(lán)光還原法測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）活性；采用紫外吸收法測(cè)定過(guò)氧化氫酶（CAT）活性；采用愈創(chuàng)木酚比色法測(cè)定過(guò)氧化物酶（POD）活性；采用羥胺氧化法測(cè)定超氧自由基（SAR）含量；采用硫代巴比妥酸比色法測(cè)定丙二醛（MDA）含量；采用考馬斯亮藍(lán)比色法測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)（SP）含量；采用蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖（SS）含量；采用氯化三苯基四氮唑法測(cè)定根系活力。

幼苗鮮重（g·株-1）= 地上部鮮重+根系鮮重

根冠比=根系鮮重/地上部鮮重

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

利用WPS 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、分析及繪圖，SPSS Statistics 25 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。每次取樣的根系和葉片測(cè)定指標(biāo)單獨(dú)進(jìn)行比較，Duncan 新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 白藜蘆醇對(duì)滲透脅迫下玉米抗氧化系統(tǒng)活性的影響

由表1 可知，滲透脅迫48 h 和72 h，白藜蘆醇處理的根系SAR 含量與對(duì)照間無(wú)顯著差異；而濃度>0.2 mmol·L-1處理的葉片SAR 含量顯著高于清水對(duì)照；在48 h 脅迫處理下，葉片SAR 含量高于根系，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)根系中SAR 積累大于葉片。

表1 白藜蘆醇對(duì)滲透脅迫下玉米幼苗抗氧化系統(tǒng)活性的影響Table 1 Effects of resveratrol on antioxidant system activities of maize seedlings under osmotic stress

滲透脅迫48 h，0.1 mmol·L-1白藜蘆醇處理的葉片SOD 活性較對(duì)照增加了17.7%，較其它濃度處理顯著增加了60.0%以上；滲透脅迫72 h，0.1 mmol·L-1白藜蘆醇處理的葉片SOD 活性較對(duì)照顯著增加了88.2%；與其它處理無(wú)顯著差異。而白藜蘆醇處理的根系SOD 活性在滲透脅迫48 h 和72 h 均與對(duì)照無(wú)顯著差異。

滲透脅迫48 h 和72 h，白藜蘆醇處理的葉片CAT 活性高于對(duì)照，其中0.2 mmol·L-1處理的酶活性最高，較對(duì)照分別顯著增加了38.5%和18.7%；而滲透脅迫48 h，白藜蘆醇處理的根系CAT 活性與對(duì)照間無(wú)顯著差異，滲透脅迫72 h，僅0.2 mmol·L-1處理的根系酶活性較對(duì)照顯著增加了54.1%，其它處理間差異不顯著。脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)導(dǎo)致葉片CAT 活性增強(qiáng)和根系CAT 活性的降低，并致使根系的酶活性低于相同處理的葉片酶活性。

滲透脅迫48 h 和72 h，隨著白藜蘆醇處理濃度的增加葉片POD 活性呈單峰曲線，峰值濃度為0.2 mmol·L-1處理，分別較對(duì)照顯著增加了33.8%和27.7%；滲透脅迫48 h，0.2 mmol·L-1白藜蘆醇處理的根系POD 活性較對(duì)照分別顯著增加了29.4%，其它處理與對(duì)照間無(wú)顯著差異，滲透脅迫72 h，各處理間根系POD 活性無(wú)顯著差異。

滲透脅迫48 h 和72 h，白藜蘆醇處理的葉片MDA 含量較對(duì)照略有降低，其中0.2 mmol·L-1處理較對(duì)照分別顯著降低了11.2%和14.4%。滲透脅迫48 h，0.1 mmol·L-1和0.2 mmol·L-1處理的根系MDA含量較對(duì)照分別顯著降低了16.9%和19.1%。滲透脅迫72 h 下，0.2~0.8 mmol·L-1處理的根系MDA 含量較對(duì)照顯著降低了33.3%~37.5%。

滲透脅迫48 h 和72 h，對(duì)照的葉片SAR 含量、CAT 和POD 活性分別增加了15.3%、33.6%和40.4%，SOD 活性則降低了78.5%；對(duì)照的根系SAR含量和POD 活性分別增加了82.3%和20.1%，SOD、CAT 活性和MDA 含量分別降低了57.1%、32.0%和5.8%。與脅迫48 h 比較，脅迫72 h 的白藜蘆醇處理葉片SAR 含量增加了20.0%~48.4%，CAT 活性增加了7.8%~19.4%，POD 活性增加了18.1%~60.3%，SOD活性降低45.3%~65.6%，MDA 含量降低趨勢(shì)較??；不同濃度白藜蘆醇處理的根系SAR 和MDA 含量增加分別增加了70.0%~104.4%和22.3%~35.1%，SOD 和CAT 活性分別降低了54.6%~57.3%和4.7%~32.1%。

滲透脅迫48 h 和72 h，葉片和根系的SAR 積累增加，同時(shí)，導(dǎo)致SOD 和根系CAT 活性的降低，但誘導(dǎo)了POD 活性和葉片CAT 活性的增強(qiáng)，增強(qiáng)了對(duì)活性氧的清除能力，使得葉片和根系的MDA 含量略有降低。白藜蘆醇處理不同程度誘導(dǎo)了SAR 的積累，減少了葉片SOD 活性降低的程度，進(jìn)一步提高了葉片和根系的CAT 和POD 活性，尤其是0.2 mmol·L-1處理效果顯著，進(jìn)而降低了葉片和根系的過(guò)氧化損傷，減少了MDA 含量。

2.2 白藜蘆醇對(duì)滲透脅迫下玉米幼苗碳氮代謝的影響

可溶性蛋白質(zhì)和可溶性糖是植物體碳代謝和氮代謝兩大主要代謝的重要產(chǎn)物，是細(xì)胞的重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和植株生長(zhǎng)的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。另外，植物體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)大多數(shù)是各種酶類，參與植物生長(zhǎng)的大多數(shù)生化過(guò)程。由圖1 可知，滲透脅迫48 h，隨著白藜蘆醇處理濃度的增加葉片和根系SS 含量呈單峰曲線，峰值分別出現(xiàn)在0.4 mmol·L-1和0.2 mmol·L-1處理，較對(duì)照分別顯著增加了29.7%和67.7%。滲透脅迫72 h，0.1~0.4 mmol·L-1白藜蘆醇處理的葉片和根系SS 含量與對(duì)照間無(wú)顯著差異，0.8 mmol·L-1處理較對(duì)照分別顯著降低了24.1%和11.4%。脅迫時(shí)間延長(zhǎng)導(dǎo)致了幼苗的SS 含量降低。

圖1 白藜蘆醇對(duì)滲透脅迫下玉米幼苗葉片（L）與根系（R）可溶性糖含量的影響Fig.1 Effects of resveratrol on soluble sugar contents in leaves（L）and root（R）of maize seedlings under osmotic stress

由圖2 可知，滲透脅迫48 h，隨著白藜蘆醇處理濃度的增加葉片和根系的SP 含量呈單峰曲線，峰值出現(xiàn)在0.2 mmol·L-1處理，較對(duì)照分別顯著增加了13.0%和18.4%，其它處理與對(duì)照間無(wú)顯著差異。滲透脅迫72 h，隨著白藜蘆醇處理濃度的增加，葉片和根系的SP 含量呈單峰曲線，峰值分別出現(xiàn)在0.2 mmol·L-1和0.4 mmol·L-1處理。隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，幼苗的葉片SP 含量增加，而根系的SP 降低。

圖2 白藜蘆醇對(duì)滲透脅迫下玉米幼苗葉片（L）與根系（R）可溶性蛋白質(zhì)含量的影響Fig.2 Effects of resveratrol on soluble protein contents in leaves（L）and root（R）of maize seedlings under osmotic stress

綜合分析，滲透脅迫時(shí)間延長(zhǎng)導(dǎo)致了根系SS 和SP 含量的降低，以及葉片SS 和SP 含量的增加；而白藜蘆醇處理不同程度的增加了短時(shí)間脅迫下植株的SS 和SP 含量，促進(jìn)了長(zhǎng)時(shí)間滲透脅迫下植株中SP的合成。

2.3 白藜蘆醇對(duì)滲透脅迫下玉米根系活力及幼苗鮮重的影響

由圖3 可知，滲透脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)導(dǎo)致對(duì)照的根系活力降低了78.2%，而白藜蘆醇不同程度的提高了滲透脅迫下玉米幼苗的根系活力，有利于緩解長(zhǎng)時(shí)間滲透脅迫對(duì)根系活力的損傷。隨著白藜蘆醇處理濃度的增加根系活力先增加后降低，其中0.2 mmol·L-1處理的根系活力最大，48 h 和72 h 滲透脅迫下分別較對(duì)照顯著增加了35.7%和75.1%。

圖3 白藜蘆醇對(duì)滲透脅迫下玉米幼苗根系活力的影響Fig.3 Effects of resveratrol on root system activity of maize seedlings under osmotic stress

由表2 可知，滲透脅迫72 h 對(duì)照處理的地上部鮮重和根系鮮重較脅迫48 h 均有所增加，而白藜蘆醇處理（0.1~0.4 mmol·L-1）的地上部鮮重均不同程度的降低，根系鮮重和植株鮮重增加，根冠比提高。隨著白藜蘆醇處理濃度的增加，幼苗地上部鮮重呈單峰曲線，48 h 滲透脅迫下0.1~0.4 mmol·L-1處理的地上部鮮重較對(duì)照顯著增加了15.2%~22.8%，根系鮮重顯著增加了21.6%~43.2%，植株鮮重顯著增加了20.7%~30.5%；72 h 滲透脅迫下僅0.2 mmol·L-1處理的地上部鮮重顯著增加了8.5%，而根系鮮重顯著增加了36.4%，植株鮮重顯著增加了16.5%。由此可見(jiàn)，白藜蘆醇可能以犧牲地上部物質(zhì)積累，保護(hù)和促進(jìn)根系發(fā)育的方式降低滲透脅迫。

表2 白藜蘆醇對(duì)滲透脅迫下玉米幼苗鮮重的影響Table 2 Effects of resveratrol on fresh weight of maize seedlings under osmotic stress

3 討論

植物滲透脅迫的重要表現(xiàn)就是活性氧的積累，進(jìn)而引起膜脂過(guò)氧化[15]。因此，加強(qiáng)活性氧的清除，是玉米幼苗抵御滲透脅迫的重要機(jī)制。滲透脅迫下植物會(huì)產(chǎn)生超過(guò)正常水平的SAR[16]，誘導(dǎo)植物抗氧化系統(tǒng)響應(yīng)，首先就是SOD 活性的增強(qiáng)，將更多的SAR還原成H2O2，H2O2積累導(dǎo)致CAT、POD 等酶活性的增強(qiáng)和植物的系統(tǒng)響應(yīng)[17]。納米氧化鋅誘導(dǎo)玉米抗旱性的研究表明[18]，干旱脅迫引起葉片亞細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變、丙二醛和滲透物質(zhì)的積累，100 mg·L-1納米氧化鋅能促進(jìn)褪黑激素的合成，激活抗氧化酶系統(tǒng)，緩解了干旱對(duì)線粒體和葉綠體的損傷。研究中白藜蘆醇葉面處理增加了玉米幼苗的SAR 產(chǎn)生量，誘導(dǎo)了葉片和根系的SOD、CAT 及POD 活性，增加了氧自由基的清除能力，降低了MDA 含量。白藜蘆醇的臨床應(yīng)用研究表明，白藜蘆醇激活SIRT1 基因的表達(dá)，增強(qiáng)過(guò)氧化物酶體活性[19]。作為天然抗氧化劑，白藜蘆醇主要是通過(guò)清除或抑制自由基生成，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、調(diào)節(jié)抗氧化相關(guān)酶活性等機(jī)制發(fā)揮抗氧化作用[20]。研究發(fā)現(xiàn)在植物中2%左右的基因表達(dá)是受H2O2調(diào)控的[21]，介導(dǎo)了一系列的保護(hù)酶[22]和抗性機(jī)制[23]。100 mmol·L-1外源腐植酸處理玉米種子的研究結(jié)果也表明，滲透條件下適宜濃度的H2O2可以誘導(dǎo)CAT、POD 等保護(hù)酶活性的增加[11]。但H2O2濃度超出一定范圍將導(dǎo)致抗氧化酶的失活[24]。研究發(fā)現(xiàn)滲透脅迫時(shí)間從48 h 至72 h，植株抗氧化酶活性降低，而白藜蘆醇處理則有效的緩解了抗氧化酶活性的下降。白藜蘆醇增強(qiáng)了滲透脅迫下玉米的CAT、POD 等抗氧化酶活性，小白鼠的胰島素耐受性試驗(yàn)也表明，白藜蘆醇處理是通過(guò)降低活性氧的水平和恢復(fù)抗氧化酶活性，而提高線粒體復(fù)合物活性及系統(tǒng)抗性[25]。

研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇提高了滲透脅迫下玉米幼苗的代謝水平，尤其是加強(qiáng)了氮代謝，在短時(shí)間的滲透脅迫下，植株的光合碳代謝和氮代謝均得到不同程度的強(qiáng)化。滲透脅迫是破壞栽培植物代謝過(guò)程和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境壓力之一[26]，玉米在低溫或干旱條件下，蔗糖積累減少導(dǎo)致了細(xì)胞滲透電位的降低[9，27]，而耐逆性強(qiáng)的玉米蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和水孔蛋白含量顯著增加，韌皮部轉(zhuǎn)載蔗糖能力提高[28]，而提高植物小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量正是增強(qiáng)植物耐逆性的重要途徑[29]。長(zhǎng)時(shí)間的滲透脅迫下，白藜蘆醇處理更有利于葉片可溶性蛋白質(zhì)的合成及向根系的運(yùn)輸。大部分可溶性蛋白質(zhì)為各種酶類，因此，可溶性蛋白質(zhì)含量的提高可增強(qiáng)根系的抗氧化能力[30]。白藜蘆醇可能通過(guò)加強(qiáng)根系的抗氧化性，提高滲透脅迫下根系活力，增加根冠比，進(jìn)而增強(qiáng)滲透脅迫下植株的物質(zhì)積累能力。而逆境條件下提高生長(zhǎng)速率也正是植物適應(yīng)逆境的重要方式之一[31]。

4 結(jié)論

營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)的玉米幼苗在PEG 滲透脅迫下處理72 h，SAR 含量較48 h 處理激增了15.3%，SOD、CAT和POD 活性降低，可溶性糖和蛋白質(zhì)積累減少。葉面噴施白藜蘆醇可不同程度的增強(qiáng)幼苗SOD、CAT 及POD 活性，降低了MDA 含量。滲透脅迫48 h，白藜蘆醇處理促進(jìn)了可溶性糖的合成及向根系的運(yùn)輸；而滲透脅迫72 h，白藜蘆醇處理增強(qiáng)了根系活力，加強(qiáng)了葉片的氮代謝及可溶性蛋白質(zhì)向根系的運(yùn)輸。48 h和72 h 滲透脅迫下，白藜蘆醇處理的植株鮮重較清水對(duì)照分別顯著提高了30.4%和16.5%，綜合分析發(fā)現(xiàn)葉面噴施0.2 mmol·L-1白藜蘆醇是最適宜的處理濃度。