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    基于OPG/RANKL信號通路探討補腎活血方改善骨質(zhì)疏松大鼠動脈鈣化的作用機(jī)制

    2022-08-29 09:54:32林曉容徐軍霞
    康復(fù)學(xué)報 2022年4期
    關(guān)鍵詞:主動脈活血骨質(zhì)

    林曉容,楊 娜,鄭 琲,趙 虎,徐軍霞,4*

    1 福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院,福建福州 350122;2 福建省軍區(qū)福州第六干休所,福建福州 350013;3 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院,福建福州 350025;4 福建中醫(yī)藥大學(xué)福總教學(xué)醫(yī)院,福建福州 350025

    骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis,OP)是一種以骨量減少和骨組織微結(jié)構(gòu)退化為特征的進(jìn)行性、系統(tǒng)性疾病,其引發(fā)的骨質(zhì)脆弱和骨折易感性增加會使患者出現(xiàn)病理性疼痛、骨折甚至死亡[1]。血管鈣化(vascular calcification,VC)是血管系統(tǒng)發(fā)生病理性礦物質(zhì)沉積的過程。研究顯示,OP和VC密切相關(guān),兩者均是伴隨衰老而發(fā)生的退行性病變,大大增加了病理性骨折和心腦血管事件發(fā)生的風(fēng)險[2-4],是老年人主要的死亡和致殘原因之一[5],給患者、家庭和社會帶來巨大的經(jīng)濟(jì)和健康負(fù)擔(dān)。中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院張寧團(tuán)隊研究發(fā)現(xiàn),補腎活血方不僅能減輕骨丟失,還可影響血管鈣化的發(fā)展[6]。但其具體作用機(jī)制尚不明確。研究顯示,骨保護(hù)素(osteoprotegerin,OPG)/核因子κB 活化因子受體配體(receptoractivator of NF-κB ligand,RANKL)信號通路參與包括OP 在內(nèi)的多種骨骼疾病的發(fā)生、發(fā)展[7],且在抑制VC 中起重要作用[8]。OPG/RANKL 信號通路可能是OP 和VC 共同發(fā)病機(jī)制之一[9-10]。因此本研究通過行雙側(cè)睪丸切除術(shù)制備雄性大鼠骨質(zhì)疏松模型[11],給予補腎活血方進(jìn)行干預(yù),觀察大鼠骨密度(bone mass density,BMD)水平、胸主動脈鈣化情況、血清骨代謝標(biāo)志物和胸主動脈OPG/RANKL 信號表達(dá)情況;基于OPG/RANKL 信號通路探討補腎活血方改善骨質(zhì)疏松大鼠動脈鈣化的作用機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物

    選擇健康SPF 級雄性SD 大鼠32 只,7 月齡,體質(zhì)量(575±75)g,由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2016-0011。所有大鼠在SPF 級標(biāo)準(zhǔn)動物實驗室中喂養(yǎng),自由飲水與攝食,光照12 h,室溫20~25 ℃,相對濕度45%。本實驗方案經(jīng)中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院實驗動物倫理委員會審批通過。

    1.2 實驗藥物

    補腎活血方主要由當(dāng)歸15 g、熟地黃10 g、淫羊藿10 g、丹參10 g、補骨脂10 g、生黃芪15 g和酒制大黃5 g 組成。將生藥浸于750 mL 蒸餾水30 min,武火煮沸后文火煎煮30 min,反復(fù)煎煮2 次,合并2次藥液,濃縮至3 g/mL,冷藏備用。以上藥物購自福建海藥股份有限公司,由中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院中藥房煎制。

    1.3 主要試劑與儀器

    茜素紅S 液(美國Sigma 公司);大鼠Ⅰ型前膠原氨基端原肽(procollagen typeⅠN-terminal propeptide,PⅠNP)、骨鈣素(bone Gla-protein,BGP)、Ⅰ型膠原C-末端肽交聯(lián)(CTX-Ⅰ)ELISA 檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);OPG、RANKL 抗體(英國Abcam 公司);羊抗兔二抗(美國Millipore 公司);DAB顯色液(加拿大Fermentas公司);戊巴比妥鈉(美國Sigma 公司);雙能X 線吸收儀(美國Hologic公司);4、-20、-70 ℃冰箱(青島海爾股份有限公司);掌式離心機(jī)(江蘇林貝爾儀器制造有限公司);蒸汽壓力滅菌鍋(上海三申醫(yī)療器械有限公司);恒溫箱(常州國華電器有限公司);光學(xué)顯微鏡(日本Olympus 公司);切片機(jī)(德國徠卡公司);包埋機(jī)(英國Shandon公司)。

    1.4 實驗方法

    1.4.1 動物分組與模型制備 32 只SPF 級雄性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、假手術(shù)組、骨質(zhì)疏松組、補腎活血組,每組8 只。對照組無任何處理,假手術(shù)組僅暴露睪丸但不切除;骨質(zhì)疏松組和補腎活血組切除雙側(cè)睪丸。

    1.4.2 干預(yù)方法 于睪丸切除術(shù)后第16 周開始干預(yù),補腎活血組予補腎活血方灌胃,給藥劑量按體表面積比換算,按照臨床等效4倍劑量計算[12],劑量55 g/(kg·d)。對照組、假手術(shù)組和骨質(zhì)疏松組均予等量生理鹽水灌胃,1次/d,連續(xù)給藥8周。

    1.5 觀察指標(biāo)

    1.5.1 骨密度檢測 干預(yù)結(jié)束后處死大鼠,取大鼠右后側(cè)股骨,剔除附著于骨表面的軟組織,保持股骨完整,0.9% NaCl 溶液沖洗并用紗布包好置于-70 ℃冰箱待檢;采用雙能X 線吸收儀對大鼠股骨進(jìn)行掃描,用小動物測量軟件對股骨干骺端進(jìn)行BMD分析。

    1.5.2 胸主動脈鈣化情況觀察 4 組大鼠胸主動脈段各剪取約0.5 cm,置于10%福爾馬林溶液中固定,乙醇梯度逐級脫水后二甲苯透明,進(jìn)行石蠟包埋,切片(厚度4 μm)后恒溫箱60 ℃烤片30 min,二甲苯脫蠟,乙醇梯度復(fù)水,2%茜素紅S 液染色1~5 min,1%鹽酸酒精分化,乙醇梯度脫水,二甲苯透明,最后用中性樹脂進(jìn)行封片,置于顯微鏡下觀察拍照,并進(jìn)行大鼠胸主動脈血管壁鈣沉積積分光密度(integrated optical density,IOD)值分析。

    1.5.3 大鼠血清PⅠNP、BGP、CTX-Ⅰ濃度檢測 以2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)深度麻醉大鼠,腹主動脈取血10 mL,靜置于肝素鈉抗凝管中,4 ℃3 500 r/min離心5 min,取上清液。采用ELISA法檢測血清PⅠNP、BGP 和CTX-Ⅰ的濃度,具體操作參照試劑盒說明書進(jìn)行。

    1.5.4 大鼠胸主動脈OPG、RANKL蛋白表達(dá)水平檢測 取胸主動脈石蠟組織切片,進(jìn)行脫蠟和水洗后使用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)沖洗,高壓修復(fù)抗原,再用3%過氧化氫室溫下封閉10 min,然后用PBS 沖洗,加非特異性血清30 min 后棄去,分別滴加一抗OPG(1∶100)、RANKL(1∶200),另外設(shè)置以PBS 代替一抗的切片為陰性對照,于4 ℃冰箱內(nèi)過夜,PBS漂洗3次,5 min/次,滴加二抗,37 ℃靜置30 min,DAB 顯色1~3 min,自來水沖洗5 min,蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片、鏡下觀察拍照。采用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行免疫組化染色半定量分析,每只大鼠胸主動脈組織取3張切片,每張切片隨機(jī)取10個高倍視野,計算每個視野陽性表達(dá)IOD 值,用陽性表達(dá)IOD 值表示胸主動脈組織OPG、RANKL蛋白的表達(dá)水平。

    1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

    采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布以(±s)表示,多組比較采用單因素方差分析,兩兩比較方差齊時采用LSD-t法,方差不齊時采用Tamhane法。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 4 組BMD、胸主動脈血管壁鈣沉積IOD 值比較

    與對照組比較,骨質(zhì)疏松組BMD 水平明顯降低,胸主動脈血管壁鈣沉積IOD 值明顯升高(P<0.05)。與骨質(zhì)疏松組比較,補腎活血組BMD 水平明顯升高,胸主動脈血管壁鈣沉積IOD值明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

    表1 4組BMD、鈣沉積IOD比較(±s)Table 1 Comparison of BMD and IOD of calcium deposition in four groups(±s)

    表1 4組BMD、鈣沉積IOD比較(±s)Table 1 Comparison of BMD and IOD of calcium deposition in four groups(±s)

    注:與對照組比較,1)P<0.05;與骨質(zhì)疏松組比較,2)P<0.05。Note:Compared with the control group, 1) P<0.05; compared with the osteoporosis group,2)P<0.05.

    組別對照組假手術(shù)組骨質(zhì)疏松組補腎活血組n8888 BMD/(g/cm2)0.312 3±0.011 5 0.310 4±0.015 7 0.263 6±0.009 61)0.280 2±0.005 02)鈣沉積IOD值0.00±0.00 0.00±0.00 1 328.55±125.081)507.16±61.752)

    胸主動脈茜素紅染色結(jié)果顯示,對照組和假手術(shù)組胸主動脈血管壁未見橘紅色顆粒沉著,骨質(zhì)疏松組胸主動脈血管壁可見大量散在小片狀深橘紅色顆粒樣沉積,補腎活血組胸主動脈血管壁只見少量散在淺橘紅色顆粒樣沉積。見圖1。

    圖1 4組胸主動脈鈣化比較(×40)Figure 1 Comparison of calcification of thoracic aorta in four groups(×40)

    2.2 4組大鼠血清PⅠNP、BGP和CTX-Ⅰ水平比較

    與對照組比較,骨質(zhì)疏松組血清PⅠNP、BGP 水平明顯降低,骨吸收標(biāo)志物CTX-Ⅰ水平明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與骨質(zhì)疏松組比較,補腎活血組PⅠNP、BGP 水平明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而CTX-Ⅰ水平無明顯區(qū)別,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖2。

    圖2 4組血清PⅠNP、BGP和CTX-Ⅰ濃度比較Figure 2 Comparison of PⅠNP,BGP and CTX-Ⅰof serum in four groups

    表2 4組血清PⅠNP、BGP和CTX-Ⅰ濃度比較(±s) ng/mLTable 2 Comparison of PⅠNP,BGP and CTX-Ⅰof serum in four groups(±s) ng/mL

    表2 4組血清PⅠNP、BGP和CTX-Ⅰ濃度比較(±s) ng/mLTable 2 Comparison of PⅠNP,BGP and CTX-Ⅰof serum in four groups(±s) ng/mL

    注:與對照組比較,1)P<0.05;與骨質(zhì)疏松組比較,2)P<0.05。Note:Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the osteoporosis group,2)P<0.05.

    組別對照組假手術(shù)組骨質(zhì)疏松組補腎活血組n8888 PⅠNP 59.48±13.70 58.50±14.88 42.37±7.631)56.72±11.502)BGP 10.75±1.39 10.48±1.72 8.39±1.451)10.33±1.762)CTX-Ⅰ5.08±1.23 5.60±1.09 8.39±1.451)5.87±1.61

    2.3 4 組胸主動脈OPG、RANKL 蛋白表達(dá)水平比較

    OPG 免疫組化染色結(jié)果顯示,對照組、假手術(shù)組大鼠血管壁平滑肌層細(xì)胞質(zhì)可見大量深染棕黃色顆粒沉著;骨質(zhì)疏松組大鼠血管壁平滑肌層細(xì)胞質(zhì)只見少量淺染棕黃色顆粒;補腎活血組大鼠血管壁平滑肌層細(xì)胞質(zhì)可見中等量棕黃色顆粒沉著。RANKL 免疫組化染色結(jié)果顯示,對照組、假手術(shù)組大鼠血管壁平滑肌層細(xì)胞質(zhì)只見少量淺染棕黃色顆粒沉著;骨質(zhì)疏松組大鼠血管壁平滑肌層細(xì)胞質(zhì)可見大量深染棕黃色顆粒;補腎活血組大鼠血管壁平滑肌層細(xì)胞質(zhì)可見中等量棕黃色顆粒沉著。見圖3。

    圖3 4組胸主動脈OPG/RANKL蛋白表達(dá)情況(×20)Figure 3 Expression of OPG/RANKL protein of thoracic aorta in four groups(×20)

    與對照組比較,骨質(zhì)疏松組大鼠胸主動脈OPG表達(dá)水平明顯降低,RANKL 表達(dá)水平明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與骨質(zhì)疏松組比較,補腎活血組大鼠胸主動脈OPG 表達(dá)水平明顯增加,RANKL 表達(dá)水平明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

    表3 4組胸主動脈OPG、RANKL IOD值比較(±s)Table 3 Comparison of IOD of OPG and RANKL of thoracic aorta in four groups(±s)

    表3 4組胸主動脈OPG、RANKL IOD值比較(±s)Table 3 Comparison of IOD of OPG and RANKL of thoracic aorta in four groups(±s)

    注:與對照組比較,1)P<0.05;與骨質(zhì)疏松組比較,2)P<0.05。Notes:Compared with the control group, 1) P<0.01; compared with the osteoporosis group,2)P<0.05.

    組別對照組假手術(shù)組骨質(zhì)疏松組補腎活血組n8888 OPG IOD值10 531.63±1 308.15 11 086.47±1 259.55 3 508.52±425.691)7 635.48±1 168.552)RANKL IOD值2 518.87±310.06 2 704.37±325.91 4 532.85±526.751)3 526.11±467.852)

    3 討 論

    中醫(yī)學(xué)將OP 歸于“骨痹”“骨痿”等范疇,其病因病機(jī)與腎息息相關(guān)。腎藏精,主骨生髓,骨骼的生長發(fā)育需要腎精氣的濡養(yǎng),腎精不足,髓失所養(yǎng),易發(fā)骨痿。而VC 與“瘀血”“痰濁”等病癥相似,血管屬中醫(yī)學(xué)“脈”的范疇。心主血脈,心失所養(yǎng),血行不暢,日久因虛而生瘀血痰濁。《景岳全書》曰:“心本乎腎,所以上不寧者,未有不由乎下,心氣虛者,未有不因乎精。”O(jiān)P、VC 與“心腎”功能密切相關(guān)。二者共同發(fā)病的中醫(yī)病機(jī)為腎虛血瘀,以補腎活血法治療符合OP和VC腎虛血瘀的發(fā)病病機(jī)。

    3.1 補腎活血方可以有效改善去勢大鼠骨質(zhì)疏松并抑制動脈鈣化

    BMD 是國際公認(rèn)的診斷骨質(zhì)疏松的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究結(jié)果顯示,與對照組比較,骨質(zhì)疏松組BMD水平明顯降低,胸主動脈可見大量散在的鈣化沉積。這提示,切除大鼠睪丸可導(dǎo)致BMD 下降,引發(fā)骨質(zhì)疏松和胸主動脈鈣化的發(fā)生。這可能與去睪丸大鼠骨代謝失衡引起異常的鈣磷礦物質(zhì)在血管系統(tǒng)中沉積,促進(jìn)血管鈣化形成有關(guān)[13-14]。骨形成標(biāo)志物PⅠNP、BGP 和骨吸收標(biāo)志物CTX-Ⅰ水平是臨床上常用于評估老年性骨質(zhì)疏松治療效果的重要指標(biāo),具有較高敏感性和特異性[15]。本研究結(jié)果顯示,與骨質(zhì)疏松組比較,補腎活血組大鼠BMD 水平、血清PⅠNP 和BGP 水平明顯升高,這提示補腎活血方可通過提高骨質(zhì)疏松大鼠的骨形成水平,調(diào)節(jié)骨代謝失衡,從而有效改善大鼠骨質(zhì)疏松。此外,補腎活血組大鼠胸主動脈鈣化沉積較骨質(zhì)疏松組明顯減少,這提示補腎活血方可在一定程度上抑制骨質(zhì)疏松大鼠胸主動脈血管壁鈣化。這初步證實了補腎活血方用于治療OP 和VC 具有良好的效果。這可能與以下原因有關(guān):補腎活血方中淫羊藿和熟地黃合用,陰陽雙補;補骨脂溫腎壯陽;丹參活血化瘀;黃芪益氣活血;當(dāng)歸活血通經(jīng);大黃祛瘀泄?jié)?。全方壯筋骨通血脈,補腎活血以去除腎虛血瘀之證,從而抑制OP 和VC 的發(fā)生、發(fā)展。這與肖亞平等[16-17]研究發(fā)現(xiàn)補腎中藥可生精壯骨、活血通脈的結(jié)果一致。

    3.2 補腎活血方改善OP 大鼠骨質(zhì)疏松、動脈鈣化可能與OPG/RANKL信號通路有關(guān)

    RANKL 與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面的核因子кB活化因子受體(receptor activator of nuclear factorkappa B,RANK)結(jié)合,可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化成熟,促進(jìn)骨吸收,而通過刺激OPG 競爭性與RANKL 結(jié)合,抑制破骨細(xì)胞生長活性和骨吸收,平衡骨代謝水平,改善骨微結(jié)構(gòu)[18]。本研究結(jié)果顯示,與骨質(zhì)疏松組比較,補腎活血方組BMD 水平、OPG 表達(dá)水平明顯上升,RANKL 表達(dá)水平明顯下降。這提示,補腎活血方可提高OPG 表達(dá),降低RANKL 表達(dá),改善去勢大鼠骨質(zhì)疏松和動脈鈣化情況。其具體機(jī)制可能與以下因素有關(guān):①補腎活血方中淫羊藿苷能夠上調(diào)OPG 表達(dá),補骨脂素提高OPG 表達(dá)和降低RANKL 表達(dá),從而抑制破骨細(xì)胞的分化成熟,促進(jìn)骨形成[19]。②血管鈣化的發(fā)生與OPG 低表達(dá)、RANKL 高表達(dá)密切相關(guān)[20],RANKL 與RANK 結(jié)合可上調(diào)骨堿性磷酸酶活性,促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞成骨樣變,形成血管鈣化。補腎活血方可使OPG 表達(dá)上升,RANKL 表達(dá)下降,而OPG 與RANKL 結(jié)合可抑制骨質(zhì)疏松大鼠胸主動脈鈣化的發(fā)生與進(jìn)展[8]。這提示,補腎活血方改善OP 大鼠動脈鈣化可能與OPG/RANKL信號通路調(diào)控有關(guān)。

    4 小 結(jié)

    綜上所述,補腎活血方能提高骨質(zhì)疏松大鼠BMD 水平,促進(jìn)骨形成,改善其誘導(dǎo)的動脈鈣化情況。作用機(jī)制可能與其能上調(diào)OPG 表達(dá),抑制RANKL 表達(dá),調(diào)控胸主動脈中OPG/RANKL 信號通路的表達(dá)有關(guān)。本研究為補腎活血方的臨床應(yīng)用提供了一定理論依據(jù),但補腎活血方具有多靶點、整體調(diào)節(jié)效應(yīng),其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

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