多肽T9sP對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞抗腫瘤活性的研究

王榕，李博文，邵耐遠(yuǎn)，彭亞，支楓

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤，占中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤的50%～60%[1]。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma，GBM)是膠質(zhì)瘤中惡性程度最高的類型，約占膠質(zhì)瘤的56%，中位生存期約為10個(gè)月[2-3]。近年來(lái)，雖然手術(shù)結(jié)合放療和化療的聯(lián)合療法在治療膠質(zhì)瘤上已取得一定進(jìn)展，但由于膠質(zhì)瘤的高度增殖和遷移能力，膠質(zhì)瘤患者的生存率依然很低[4-7]。因此，積極尋找和發(fā)現(xiàn)新的有效的膠質(zhì)瘤治療藥物具有重大意義。

多肽指由幾個(gè)到幾十個(gè)天然或非天然氨基酸縮合而成的化合物，既可以人工合成，也可以從天然產(chǎn)物中提取[8]。多肽藥物具有合成工藝簡(jiǎn)單、免疫原性低和藥物安全性高、耐受性好等特點(diǎn)，因此，多肽藥物尤其是抗腫瘤多肽藥物的研究日益受到重視[9]。目前多肽類藥物應(yīng)用于膠質(zhì)瘤治療的基礎(chǔ)研究已有報(bào)道，一種新型的抗膠質(zhì)瘤血管生成的穿膜肽Tat-C-RP7可以有效地穿透血腦屏障(blood brain barrier，BBB)，并在血管內(nèi)皮細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，靶向神經(jīng)纖毛蛋白1(neurociliary protein 1，NRP1)展現(xiàn)其抗腫瘤活性[10]；TAT-Cx43266-283，一種基于間隙連接蛋白43(connexin 43，Cx43)的穿膜肽，選擇性靶向膠質(zhì)瘤細(xì)胞，通過(guò)抑制c-Src活性從而抑制小鼠膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)[11-12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，E3泛素連接酶TRIM9的短亞型TRIM9s可通過(guò)與MKK6相互穩(wěn)定來(lái)增強(qiáng)p38信號(hào)通路協(xié)同抑制膠質(zhì)瘤的進(jìn)展[13]，而多肽T9sP是一段來(lái)自TRIM9s蛋白的片段。細(xì)胞穿透肽(cell penetrating peptides，CPPs)是一類可作為藥物運(yùn)送載體的多肽，反式轉(zhuǎn)錄激活因子(trans-activator of transcription，TAT)GGRKKRRQRRR是膠質(zhì)瘤中常用的一種CPPs，已被證實(shí)可以穿透BBB，由于其操作簡(jiǎn)單且安全性高，本研究選擇TAT作為多肽T9sP的載體，形成TAT-T9sP，從而促進(jìn)T9sP進(jìn)入腫瘤細(xì)胞[11，14]。為了驗(yàn)證T9sP的抗膠質(zhì)瘤活性，本研究以人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞為材料，研究T9sP對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力的影響，初步探討T9sP抗膠質(zhì)瘤的機(jī)制，為進(jìn)一步研究和開發(fā)利用T9sP打下一定的工作基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 TAT-T9sP多肽和TAT-Scr對(duì)照肽(Scr為T9sP氨基酸序列隨機(jī)打亂后形成的對(duì)照組多肽，其序列為GQLYEAQRKGITEPSSRLE)及其FITC熒光標(biāo)記肽(FITC-T9sP和FITC-TAT-T9sP)由南京倍爾博有限公司設(shè)計(jì)并合成，多肽純度>98%。DMEM培養(yǎng)基、pH=7.4的磷酸鹽緩沖鹽溶液(phosphate-buffered saline，PBS)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、青霉素-鏈霉素-谷氨酰胺(100×)、0.25%含有EDTA和酚紅的胰蛋白酶和ECL化學(xué)發(fā)光顯色液購(gòu)自Thermo Fisher公司。CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒和結(jié)晶紫染色液均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司。Western及IP細(xì)胞裂解液購(gòu)自聯(lián)科生物。p38抑制劑(SB203580)購(gòu)自Selleck公司。Western Blot抗體p-p38(#9211),p38(#8690),p-ERK(#9101)，ERK(#9102)，p-JNK(#9251)，JNK(#9252)和β-actin(#4970)購(gòu)自Cell Signaling Technology公司。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)購(gòu)自Jackson ImmunoResearch公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87(上海中科院細(xì)胞庫(kù))置于5% CO2和37 ℃恒溫培養(yǎng)箱(Thermo Fisher)中，在含10%FBS和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后吹打成單細(xì)胞懸液，按照一定的細(xì)胞密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞完全貼壁后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn) 為了證實(shí)多肽穿透細(xì)胞的能力，采用異硫氰酸熒光素(fluorescin isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記多肽，形成FITC-T9sP和FITC-TAT-T9sP，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87細(xì)胞接種于6孔板中，分別加入20 μM的FITC-T9sP和FITC-TAT-T9sP處理細(xì)胞，24 h后置于熒光倒置顯微鏡下拍照。

1.2.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) U87細(xì)胞按照每孔加入100 μL 8 000個(gè)細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，細(xì)胞隨機(jī)分成溶劑組(PBS)、TAT-Scr組(10 μM，20 μM，40 μM，80 μM，160 μM)和TAT-T9sP組(10 μM，20 μM，40 μM，80 μM，160 μM)每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，邊緣孔用PBS填充，24 h后每孔加入10 μL的CCK-8溶液，在37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h，用BioTek Synergy 2多功能酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光度。按照以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率(%)：存活率(%)=OD實(shí)驗(yàn)組/OD溶劑組×100%。

1.2.4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U87細(xì)胞，鋪6孔板(約5×105個(gè)細(xì)胞/孔)，37 ℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿后，用滅菌的20 μL槍頭進(jìn)行劃痕標(biāo)記，PBS清洗細(xì)胞以去除劃下的細(xì)胞，然后換新鮮的無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，多肽處理0 h及24 h后將細(xì)胞置于倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照，使用Image J軟件計(jì)算細(xì)胞間遷移距離的變化。

1.2.5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至2.5×105/mL，取細(xì)胞懸液200 μL加入已均勻鋪入基質(zhì)膠的Trans-well小室(康寧，3422，8.0 μm孔徑聚碳酸酯膜小室)，在Trans-well下室中加入750 μL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，24 h后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，晾干后用棉簽小心地擦除上室內(nèi)殘留的細(xì)胞，再用結(jié)晶紫(碧云天，C0121)染色，充分洗滌后在倒置顯微鏡Olympus IX71下拍照，并用Image-Pro-Insight軟件對(duì)各組細(xì)胞隨機(jī)選取6個(gè)區(qū)域進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。

1.2.6 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) U87細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、TAT-Scr陰性組和TAT-T9sP實(shí)驗(yàn)組，多肽處理24 h后收集細(xì)胞，用PBS洗滌，1 000 g離心5 min，棄上清液，重新懸浮于195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液中，然后在室溫下用5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI避光孵育20 min。染色結(jié)束后，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀(Guava EasyCyte 6HT-2L)檢測(cè)凋亡細(xì)胞。

1.2.7 Western Blot實(shí)驗(yàn) U87細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、TAT-Scr組、TAT-T9sP組和TAT-T9sP+SB203580組，接種于6孔板中，在指定的時(shí)間點(diǎn)用預(yù)冷的Western及IP細(xì)胞裂解液(聯(lián)科生物)裂解多肽處理后的細(xì)胞，收集總蛋白后采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。100 ℃下蛋白變性5 min，SDS-PAGE電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。隨后PVDF膜用封閉緩沖液(5%脫脂奶粉-PBST)室溫孵育1 h，然后在4 ℃用一抗孵育過(guò)夜。PBST洗滌3次，在室溫下與二抗孵育1 h，用ECL顯色，Tanon-4600化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)觀察并分析蛋白條帶。

2 結(jié) 果

2.1 合成TAT-T9sP 為了增強(qiáng)跨膜通透性，T9sP和Scr與TAT融合形成TAT-T9sP和TAT-Scr(圖1A)。Scr為T9sP亂序排列后形成的多肽對(duì)照，質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，TAT-T9sP的分子質(zhì)量為3 598.1 Da(圖1B)。

A：TAT-T9sP序列； B：質(zhì)譜分析圖1 合成TAT-T9sP

2.2 TAT-T9sP在細(xì)胞內(nèi)的蓄積 為了檢測(cè)細(xì)胞攝取多肽的情況，用FITC標(biāo)記T9sP和TAT-T9sP，生成FITC-T9sP和FITC-TAT-T9sP。用FITC-T9sP或者FITC-TAT-T9sP處理膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞24 h，用熒光倒置顯微鏡觀察這些多肽的細(xì)胞攝取情況?？梢栽贔ITC-TAT-T9sP處理的細(xì)胞中觀察到較強(qiáng)的綠色熒光，而在用FITC-T9sP處理的細(xì)胞中只能檢測(cè)到較弱的綠色熒光(圖2)。

圖2 TAT-T9sP在細(xì)胞內(nèi)的蓄積(FITC標(biāo)記綠色熒光，×200)

2.3 TAT-T9sP對(duì)U87細(xì)胞增殖的影響 在U87細(xì)胞中加入不同濃度的TAT-T9sP，觀察TAT-T9sP對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制作用。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，TAT-Scr僅對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生微弱的抑制效果，而TAT-T9sP可以顯著抑制U87細(xì)胞的增殖，且隨劑量的增加抑制作用越強(qiáng)(圖3)。TAT-T9sP在濃度為20 μM的時(shí)候?qū)87細(xì)胞增殖的抑制具有顯著性差異(P<0.01)，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇20 μM濃度的TAT-T9sP處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞。

圖3 TAT-T9sP抑制U87細(xì)胞增殖(**P<0.01，***P<0.001)

2.4 TAT-T9sP對(duì)U87細(xì)胞遷移的影響 細(xì)胞遷移是腫瘤發(fā)展的一個(gè)重要階段，因此，采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TAT-T9sP對(duì)細(xì)胞遷移的影響。與對(duì)照組相比，TAT-Scr處理組對(duì)細(xì)胞遷移幾乎沒有抑制效果，而TAT-T9sP可以顯著抑制U87細(xì)胞的遷移(P<0.001)。見圖4。

A：劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力圖(×200)； B：劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖(***P<0.001)圖4 TAT-T9sP抑制U87細(xì)胞遷移

2.5 TAT-T9sP對(duì)U87細(xì)胞侵襲的影響 Trans-well實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TAT-T9sP對(duì)U87細(xì)胞侵襲能力的影響。與對(duì)照組相比，TAT-Scr處理組轉(zhuǎn)移到下室的細(xì)胞數(shù)量沒有顯著變化，即對(duì)細(xì)胞侵襲能力幾乎沒有抑制效果，而TAT-T9sP可以顯著抑制U87細(xì)胞轉(zhuǎn)移到下室中的細(xì)胞數(shù)量，即顯著抑制其侵襲能力(P<0.01)。見圖5。

A：Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力圖(結(jié)晶紫染色，×200)； B：Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖(**P <0.01)圖5 TAT-T9sP抑制U87細(xì)胞侵襲

2.6 TAT-T9sP對(duì)U87細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果示，與對(duì)照組相比，TAT-Scr略微促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，而TAT-T9sP可以顯著促進(jìn)U87細(xì)胞的凋亡(P<0.01)，早期凋亡的細(xì)胞的平均比率從3.37%增加到14.30%，晚期凋亡的細(xì)胞的平均比率從3.58%增加到13.42%。見圖6。

圖6 TAT-T9sP促進(jìn)U87細(xì)胞凋亡(***P<0.001)

2.7 TAT-T9sP激活p38 MAPK信號(hào)通路 Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，TAT-T9sP處理組顯著增加p38的磷酸化水平(P<0.001)，使用p38抑制劑SB203580后，p-p38表達(dá)顯著降低(P<0.01)；而TAT-Scr組細(xì)胞相較對(duì)照組細(xì)胞，p-p38和p38無(wú)顯著差異(圖7A、B)；TAT-T9sP和TAT-Scr處理組細(xì)胞較對(duì)照組的ERK和JNK及其磷酸化表達(dá)水平未見顯著差異(圖7C-E)。此外，SB203580可以顯著抑制TAT-T9sP誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡(圖7F-G)。綜上，TAT-T9sP激活p38信號(hào)通路，而非ERK和JNK MAPKs信號(hào)通路。

A：p38 MAPK信號(hào)通路的蛋白表達(dá)水平； B：p-p38和p38統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果(**P<0.01，***P<0.001)； C：ERK和JNK MAPKs信號(hào)通路的蛋白表達(dá)水平； D：p-ERK和ERK統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果； E：p-JNK和JNK統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果； F：流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡圖； G；凋亡率統(tǒng)計(jì)圖(和TAT-T9sP組比較，*P<0.05，**P<0.01)圖7 TAT-T9sP激活p38信號(hào)通路

3 討 論

膠質(zhì)瘤作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，目前主要的治療策略為最大限度的手術(shù)切除、放化療結(jié)合，近些年雖然技術(shù)和手段都有很大提高，但其預(yù)后依然很差[2]。近十年來(lái)，多肽類藥物日益受到人們的重視，與化療和基因治療相比，多肽類藥物具有高特異性、高耐受性、高選擇性、低毒性和低遺傳毒性等優(yōu)點(diǎn)[15]，可直接或間接作用于腫瘤細(xì)胞，目前大約有140種多肽類藥物正在臨床試驗(yàn)中進(jìn)行評(píng)估[16]，其潛在的抗腫瘤機(jī)制主要通過(guò)調(diào)節(jié)免疫功能、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤新生血管生成等[17]。此外，蛋白質(zhì)工程和分子建模的進(jìn)展使得短氨基酸序列肽的操作和應(yīng)用變得容易，可以使其更適合臨床應(yīng)用[18]。

目前多肽類化合物作為新型的抗腫瘤藥物，應(yīng)用于膠質(zhì)瘤治療方面已得到研究人員的廣泛關(guān)注。一種細(xì)胞凋亡素衍生肽通過(guò)下調(diào)HSP70促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，從而抑制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)[19]。GBMP1α，一種通過(guò)Fmoc化學(xué)法固相合成的BMP-2模擬肽，被證實(shí)在體外可以誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的分化，有望成為GBM的抗腫瘤藥物[20]。通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)構(gòu)建的epsin泛素相互作用基序(UIM)的模擬肽被證實(shí)可以結(jié)合泛素化的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)，再通過(guò)化學(xué)合成法構(gòu)建的UIM模擬肽UPI可以通過(guò)調(diào)控VEGFR2信號(hào)通路抑制腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤生成，并在U87荷瘤小鼠中得到證實(shí)[21]。樹突狀細(xì)胞衍生因子(dendritic cell derived factor 1，DCF1)與TAT形成新肽TAT-DCF1可以顯著降低U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[22]。然而，目前仍然缺乏具有較好的膠質(zhì)瘤治療效果、副作用小，且可在臨床上廣泛展開應(yīng)用的多肽藥物。本研究發(fā)現(xiàn)了一條具有膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲并促進(jìn)細(xì)胞凋亡的多肽，該多肽為全新的氨基酸序列，目前針對(duì)它的研究仍有待繼續(xù)。雖然本研究尚處于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)階段，但是現(xiàn)有結(jié)果表明TAT-T9sP有望成為一種新的抗膠質(zhì)瘤藥物。

腫瘤細(xì)胞中活性多肽發(fā)揮功效的主要障礙之一是細(xì)胞通透性低[23]。因此，研究者們開發(fā)了各種藥物遞送系統(tǒng)，例如脂質(zhì)膜納米載體、聚合物載體和無(wú)機(jī)載體等用于增強(qiáng)活性多肽的細(xì)胞通透性。比如，Pucci等[24]開發(fā)了一種angiopep-2修飾的脂質(zhì)納米載體包裹了nutlin-3a和氧化鐵，它能夠穿透BBB并選擇性地促進(jìn)GBM細(xì)胞死亡。Yuan等[25]開發(fā)了一種細(xì)胞穿透肽R8修飾的脂質(zhì)體，它可以有效地穿過(guò)血腦屏障，并將阿霉素遞送到腫瘤區(qū)域，抑制體內(nèi)和體外腫瘤的生長(zhǎng)。研究將TAT與T9sP融合形成TAT-T9sP，TAT-T9sP能有效地穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。鑒于高濃度的穿膜肽TAT仍然具有些許的細(xì)胞毒性，未來(lái)將考慮更換新的具有更強(qiáng)穿透效率和更低細(xì)胞毒性的多肽載體。

p38 MAPK信號(hào)通路作為最常見的信號(hào)通路之一，響應(yīng)各種細(xì)胞刺激而被激活，參與調(diào)控了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡。報(bào)道稱，替莫唑胺作為一種臨床上膠質(zhì)瘤患者的一線用藥，可部分通過(guò)激活p38的磷酸化水平抑制U87和U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的增殖、遷移和侵襲[26]。而p38抑制劑可以顯著減少重樓皂苷Ⅵ誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87的凋亡[27]。本研究之前報(bào)道過(guò)，TRIM9s，而非TRIM9l，通過(guò)增強(qiáng)p38信號(hào)通路抑制惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)展[13]。本研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自TRIM9s的多肽片段T9sP，可以通過(guò)激活p38 MAPK信號(hào)通路而非ERK/JNK信號(hào)通路，顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移，和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。雖然多肽T9sP可以激活p38 MAPK信號(hào)通路，但是由于p38 MAPK信號(hào)通路同時(shí)也廣泛參與體內(nèi)的其他多種生理功能，因此多肽T9sP是否會(huì)對(duì)其他的生理功能產(chǎn)生影響需要通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

總之，本研究為T9sP進(jìn)一步發(fā)展成為治療膠質(zhì)瘤的新肽藥物提供了初步證據(jù)，但仍需進(jìn)一步探討其功效及機(jī)制。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。