獼猴桃褐斑病病情調(diào)查及病原菌鑒定

鄒玉萍，王仁才，崔麗紅，王 琰

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128； 2.湘西民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 吉首 416001； 3.湖南生物機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410127）

湖南省是我國獼猴桃主要栽培地及原產(chǎn)地之一，全國40%以上的野生獼猴桃資源都在湖南［1］。湖南栽培的主要獼猴桃品種有“米良1號(hào)”和“翠玉”。近年來，隨著市場(chǎng)需求的不斷擴(kuò)大，“紅陽”獼猴桃在湘西、長(zhǎng)沙、永州等地成為主要栽培和推廣的品種［2］。據(jù)調(diào)查，截至2021年，湖南全省獼猴桃栽培總面積超過了2.47萬hm2，總產(chǎn)量達(dá)35萬t，總產(chǎn)值達(dá)20億元，其中湘西地區(qū)獼猴桃栽培面積為1.53萬hm2，長(zhǎng)沙地區(qū)栽培面積為180hm2［3］，湘南的江華縣栽培面積為187hm2。湖南省主要通過專業(yè)合作社與種植大戶相結(jié)合的方式發(fā)展獼猴桃產(chǎn)業(yè)，全省共有243個(gè)專業(yè)合作社。獼猴桃產(chǎn)業(yè)已成為湖南鄉(xiāng)村振興的主要產(chǎn)業(yè)之一［1］，在進(jìn)一步提高鄉(xiāng)村人民生活水平中發(fā)揮著巨大的作用。由于獼猴桃的市場(chǎng)需求擴(kuò)大，種植面積不斷增加，獼猴桃病害的發(fā)生也越來越頻繁，病害種類也有所增加。病害的發(fā)生不僅造成了獼猴桃果實(shí)品質(zhì)下降，還極大地降低了其產(chǎn)量，使得果農(nóng)經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重，獼猴桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展受到限制。獼猴桃褐斑病是為害獼猴桃葉片的主要病害，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)造成葉片大量枯死、提早脫落，枝干干枯，果實(shí)脫落，嚴(yán)重影響獼猴桃植株光合作用和樹體的生長(zhǎng)發(fā)育及果實(shí)品質(zhì)［4］。近年來，獼猴桃褐斑病在陜西、貴州、四川、江西、廣西等地頻繁發(fā)生，現(xiàn)已有學(xué)者進(jìn)行了相關(guān)研究，各學(xué)者對(duì)不同地區(qū)獼猴桃褐斑病病原菌的鑒定結(jié)果不同。趙金梅［5］對(duì)陜西獼猴桃主產(chǎn)區(qū)周至縣的中華獼猴桃褐斑病病原菌鑒定為鏈格孢菌（Alternaria alternative）；Li等［6］將貴州六盤水地區(qū)“紅陽”獼猴桃褐斑病病原菌鑒定為極細(xì)鏈格孢菌（Alternaria tenuissima）；吳德義等［7］將獼猴桃褐斑病病原菌鑒定為小球腔菌 （Mycosphaerella sp.）；王明召等［8］對(duì)廣西獼猴桃褐斑病病原菌葉點(diǎn)霉（Phyllosticta sp.）進(jìn)行了研究；崔永亮［9］將四川的獼猴桃褐斑病病原菌鑒定為多主棒孢菌（C.cassiicola）。目前關(guān)于湖南省獼猴桃病害的研究主要集中于潰瘍病［10-11］。筆者對(duì)湖南省獼猴桃代表性產(chǎn)區(qū)的獼猴桃褐斑病進(jìn)行了病情調(diào)查及病原菌鑒定，以便為其防治奠定基礎(chǔ)。

1 調(diào)查區(qū)概況

2021年5—8月，在湘南、湘中北、湘西等湖南省獼猴桃代表性產(chǎn)區(qū)，選擇江華、長(zhǎng)沙、鳳凰等地的4年生獼猴桃果園為調(diào)查對(duì)象。江華縣位于湖南省 南 部，地 處110°25′—112°10′E，24°38′—25°15′N，屬于亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候區(qū)，其年平均氣溫18～18.5℃。長(zhǎng)沙市位于湖南省中部偏北，地處111°53′—114°15′E，27°51′—28°41′N，屬亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，其年平均氣溫17.2℃。鳳凰縣位于湖南省西部，地處109°18′—109°48′E，27°44′—28°19′N，屬中亞熱帶季風(fēng)濕潤性氣候區(qū)，年平均氣溫15.9℃。各果園均位于坡地，基本情況如表1所示。

表1 各果園基本情況Tab.1 The basic situation of each orchard

2 研究方法

2.1 褐斑病病情調(diào)查

調(diào)查內(nèi)容包括“紅陽”獼猴桃在不同地區(qū)的褐斑病病情、同一地區(qū)不同栽培管理水平果園的“紅陽”獼猴桃褐斑病病情和同一地區(qū)不同品種的獼猴桃褐斑病病情。

采用五點(diǎn)調(diào)查取樣方法，每點(diǎn)隨機(jī)調(diào)查獼猴桃10株，每株調(diào)查50片葉，觀察病害的癥狀。根據(jù)病斑大小，將獼猴桃褐斑病病害程度分為0～5級(jí)，其分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照 《農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則（二）》［2］，具體分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見表2。同時(shí)，計(jì)算病株率、病葉率、病情指數(shù)，其具體計(jì)算方法如下。

表2 獼猴桃褐斑病病害程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Tab.2 The Classification standard of brown leaf spot on kiw ifruit

2.2 病原菌分離與鑒定

（1）病葉樣品采集。調(diào)查時(shí)于各個(gè)果園隨機(jī)采集5～10片病葉標(biāo)本，裝在自封袋中，貼好標(biāo)簽，放入含有冰袋的泡沫箱中帶回實(shí)驗(yàn)室于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）病原菌分離。采用組織分離法對(duì)病原菌進(jìn)行分離。用自來水將病葉沖洗干凈后自然晾干，將葉片的病健交接部分剪下，并剪成邊長(zhǎng)約5 mm的正方形小葉塊。將小葉塊在75%的酒精中浸泡5s后轉(zhuǎn)入5%次氯酸鈉溶液中浸泡1min，再用無菌水沖洗3次，放置在滅菌濾紙上晾干，隨后將小葉塊背面朝下接入含氯霉素的PDA培養(yǎng)基上。每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)放3塊小葉塊，并擺放成三角形，共接種5皿，放在28℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)［13-14］。

（3）病原菌純化。接種1周后，統(tǒng)計(jì)不同菌落出現(xiàn)的頻率，用接種針挑取不同菌落邊緣的菌絲，將其分別接種在新的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察菌落生長(zhǎng)情況，多次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)直至培養(yǎng)皿中長(zhǎng)出單一菌落得到純化的菌株后將其保存。

（4）病原菌回接驗(yàn)證。選取新鮮健康無病蟲害的獼猴桃葉片進(jìn)行離體接種試驗(yàn)。用75%的酒精對(duì)葉片進(jìn)行表面消毒，無菌紙擦干后，刺傷處理，將純化后的菌種用5 mm菌落打孔器打成菌餅接種于獼猴桃葉片上。葉片置于底部鋪蓋濕棉花和濕濾紙的培養(yǎng)皿中，用保鮮膜密封保濕，放在溫度為28℃，濕度為80% ～85%的培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)發(fā)病。針刺＋菌餅為試驗(yàn)組，針刺＋空白培養(yǎng)基為對(duì)照組，每組10次重復(fù)，觀察發(fā)病情況。葉片發(fā)病后，再次分離病原菌純化培養(yǎng)，并選擇健康的獼猴桃葉片進(jìn)行再次離體接種試驗(yàn)。

（5）病原菌形態(tài)學(xué)鑒定。菌株培養(yǎng)7～10 d后，觀察其顏色、形態(tài)；用滅菌竹簽取少量菌絲放在載玻片上，在顯微鏡下觀察其分生孢子梗、分生孢子等的結(jié)構(gòu)。參考 《中國真菌志》［15］和《植物病原真菌學(xué)》［16］等書籍初步鑒定病原菌的屬和種。

（6）病原菌分子生物學(xué)鑒定。取純化后長(zhǎng)滿平板的病原菌，將菌絲刮入裝有石英砂的研缽中，研磨成粉末狀后裝入1.5mL的離心管中，根據(jù)試劑盒上的步驟提取病菌DNA。使用真菌通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR的反應(yīng)體系包括：2×Mastermix 12.5μL，濃度為10μmol·L-1的上、下游引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。PCR體系的反應(yīng)條件：在94℃下預(yù)變性5 min；95℃條件下變性40 s后退火至47℃保持40 s，之后在72℃條件下延伸150 s，30次循環(huán)；最后在72℃下延伸10 min，在4℃條件下回收PCR產(chǎn)物。將擴(kuò)增的產(chǎn)物點(diǎn)樣于1%瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行電泳檢測(cè)、染色。凝膠成像后，送至湖南擎科生物公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對(duì)相似性，并下載相似度高的序列，然后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析供試菌株與同屬其他菌株的親緣關(guān)系。

2.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 24.0和Excel 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖表的制作；用MEGA 7.0軟件中鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

3 結(jié)果與分析

3.1 獼猴桃褐斑病癥狀

發(fā)病初期葉片上有淡綠色的小斑點(diǎn)，到夏季遇上雨天小斑點(diǎn)擴(kuò)大成病斑，病斑內(nèi)部淺灰色，外緣為一圈深褐色，形成一個(gè)個(gè)外圍不規(guī)則、內(nèi)部為灰褐色輪紋狀的病斑。隨后病斑連接成片，導(dǎo)致葉片大面積變褐、萎焉。

圖1 褐斑病田間病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Fig.1 The standards of diseases grades of brown leaf spot used for field investigation

3.2 獼猴桃褐斑病病情

表3顯示：獼猴桃褐斑病在湘南、湘中、湘西北等湖南省獼猴桃代表性產(chǎn)區(qū)中普遍存在，調(diào)查區(qū)平均病株率、病葉率、病情指數(shù)分別為76.75%、54.13%、26.31。在不同園區(qū)之間，獼猴桃褐斑病的病株率、病葉率、病情指數(shù)均存在著較大的差異。江華C園區(qū)和鳳凰A、B園區(qū)獼猴桃褐斑病的病情都非常嚴(yán)重，病株率均達(dá)到了100.00%，平均病葉率分別為76.00%、95.00%和74.00%，病情指數(shù)分別為33.47、51.83和32.08，其中鳳凰A園區(qū)的病情最為嚴(yán)重；江華B園區(qū)的病情最輕，病株率、病葉率、病情指數(shù)分別為2.00%、4.00%、2.67；江華A和長(zhǎng)沙B園區(qū)的病情較為嚴(yán)重，病情指數(shù)分別為27.62和30.37；長(zhǎng)沙A和鳳凰C園區(qū)的病情相對(duì)較輕。

表3 各園區(qū)獼猴桃褐斑病病情Tab.3 The disease condition of kiw ifruit brown spot

3.3 不同地區(qū)“紅陽”獼猴桃褐斑病病情

由表4可知：在相同管理水平下，各園區(qū)“紅陽”獼猴桃褐斑病的病株率達(dá)90.00%或90.00%以上。褐斑病的平均病葉率有所差異，其中鳳凰園區(qū)的病葉率最高，達(dá)74.00%；江華園區(qū)的病葉率最低，為54.00%。3個(gè)園區(qū)褐斑病的病情指數(shù)無顯著性差異，病情均很嚴(yán)重。

表4 不同園區(qū)的“紅陽”獼猴桃褐斑病病情Tab.4 Brown spot disease of kiw ifruit“Hongyang”in different areas

3.4 同一地區(qū)不同栽培管理水平“紅陽”獼猴桃褐斑病病情

表5顯示：“紅陽”獼猴桃褐斑病的病情指數(shù)在不同栽培管理水平間均有顯著性差異。江華B園區(qū)精細(xì)化管理的獼猴桃，其褐斑病平均病葉率和病情指數(shù)分別為4.00%、2.67，病葉率和病情指數(shù)均最低；江華A園區(qū)一般化管理和江華C園區(qū)粗放式管理的獼猴桃，其病葉率分別為59.00%、76.00%，病情指數(shù)分別為27.62、33.47。

表5 不同栽培管理水平“紅陽”獼猴桃褐斑病病情Tab.5 The conditions of brown spot disease of kiw ifruit“Hongyang” in different cultivation and management levels

3.5 同一地區(qū)不同品種獼猴桃褐斑病病情

表6顯示：在長(zhǎng)沙園區(qū)“翠玉”和“紅陽”獼猴桃褐斑病的病株率分別為80.00%和90.00%，“紅陽”獼猴桃褐斑病的病葉率和病情指數(shù)分別為65.60%和30.37，均明顯高于“翠玉”獼猴桃的。在鳳凰園區(qū)“紅陽”獼猴桃褐斑病的病株率、病葉率和病情指數(shù)均顯著高于“米良1號(hào)”的，“紅陽”獼猴桃褐斑病的病株率、病葉率和病情指數(shù)分別為100.00%、95.00%和51.83，而“米良1號(hào)”的僅為44.00%、20.00%和14.91。

表6 不同品種獼猴桃褐斑病病情Tab.6 The conditions of disease in different cultivated kiw ifruit varieties

3.6 病原菌分離及其致病性鑒定

將各果園采回的病葉通過常規(guī)的組織分離法共分離出180份菌株。純化培養(yǎng)后根據(jù)菌落形態(tài)將其分為6種菌株。對(duì)其進(jìn)行致病性接種試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，僅2種菌株接種后葉片接種部位表現(xiàn)出與田間褐斑病初期相似的癥狀，即前期接種點(diǎn)中心形成暗綠色小斑點(diǎn)，隨后慢慢擴(kuò)展為褐色或黑褐色不規(guī)則斑塊。癥狀如圖2-D、圖3-D所示。將這2種有發(fā)病癥狀的葉片組織再次分離培養(yǎng)，得到菌株與接種菌株表現(xiàn)相同的菌株，且符合科赫式法則。根據(jù)科赫式法則，確定所分離出的2種菌株為湖南獼猴桃褐斑病的致病病原菌，將其分別命名為菌株HNHB-1、HNHB-2。

3.7 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

菌株HNHB-1在PDA培養(yǎng)基上、28℃下恒溫培養(yǎng)3 d，形成淺灰色菌落，菌落直徑可達(dá)20 mm左右；培養(yǎng)7 d，菌落邊緣呈灰白色，直徑達(dá)50 mm左右；培養(yǎng)10 d，菌絲可長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿，菌落直徑達(dá)75 mm左右，菌絲均勻，無氣味，表面有絨毛。從圖2-A、圖2-B、圖2-E、圖2-F可以看出，菌落邊緣白色絨毛分布均勻，菌落背面中間灰綠色，邊緣灰白色。取少量菌落邊緣的菌絲在電子顯微鏡下觀察，結(jié)果（圖2-G）顯示：菌絲具分枝，呈淺褐色半透明狀；分生孢子梗直立，部分彎曲且無分枝，有隔膜；分生孢子單生或幾個(gè)串生為倒棍棒型，具4～20個(gè)假隔膜，透明、淺褐色或深棕色。參考 《植物病原真菌學(xué)》［16］和Li［17］、Zhu［18］等的研究，初步鑒定病原菌為棒孢屬（Corynespora）真菌。

圖2 菌株HNHB-1分離鑒定圖片F(xiàn)ig.2 The pictures of isolation and identification of strain HNHB-1

菌株HNHB-2在PDA培養(yǎng)基上、28℃下恒溫培養(yǎng)13 d后長(zhǎng)滿了培養(yǎng)皿。從圖3-A、圖3-B、圖3-E、圖3-F可以看出，菌落呈圓形或橢圓形、墨綠色，邊緣淺綠色，表面有灰白色顆粒狀的分生孢子。菌落長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿后，在培養(yǎng)皿中加2 mL滅菌的超純水，用接種環(huán)輕輕地將菌落表面的孢子洗入10 mL離心管中，在4 000 r·min-1離心機(jī)下離心5 min，肉眼可見孢子團(tuán)沉淀如芝麻至綠豆大小，去除多余液體加電鏡固定液，常溫下固定2 h后用4℃冰袋運(yùn)輸至上海茁彩生物科技有限公司進(jìn)行電鏡透射觀察，結(jié)果（圖3-G）顯示：分生孢子為單細(xì)胞、無色，壁光滑，圓球形，尾部附有透明附屬絲，大小為（9～14）μm×（5～7）μm。初步確定該菌株為葉點(diǎn)霉屬（Phyllosticta sp.）真菌。

圖3 菌株HNHB-2分離鑒定圖片F(xiàn)ig.3 The pictures of isolation and identification of strain HNHB-2

3.8 病原菌分子生物學(xué)鑒定

（1）總DNA提取?？侱NA電泳結(jié)果如圖4所示，圖中M 為DL5 000 DNA Maker， -為陰性對(duì)照；1、2、3、4分別為HNHB-1、HNHB-1.1、HNHB-2與HNHB-2.1菌株；5為分離出的雜菌。

圖4 總DNA電泳結(jié)果Fig.4 The results of agargelation electrophoresis

（2）系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

根據(jù)測(cè)序比對(duì)結(jié)果下載相似性高的菌株和隔代同源性菌株，并選用一個(gè)外源菌株，用MEGA 7.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，同時(shí)，采用N-J（鄰接）法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。進(jìn)化樹如圖5和圖6所示。

圖5 菌株HNHB-1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of strain HNHB-1

圖6 菌株HNHB-2的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of strain HNHB-2

圖5顯示，菌株HNHB-1和接種再分離得到的菌株HNHB-1.1與C.cassiicola聚為一支，基因組高度相似。由此確定，試驗(yàn)分離所得到的獼猴桃褐斑病病原菌為多主棒孢菌（C.cassiicola）。

圖6顯示，菌株HNHB-2和接種再分離得到的菌株HNHB-2.1與P.capitalensis聚為一支，基因組高度相似。由此確定，試驗(yàn)分離所得到的獼猴桃褐斑病病原菌為葉點(diǎn)霉菌（P.capitalensis）。

4 結(jié)論與討論

獼猴桃褐斑病在湘南、湘中、湘西北等湖南省獼猴桃代表性產(chǎn)區(qū)普遍存在，其平均病葉率達(dá)54.13%，平均病情指數(shù)達(dá)26.31；最嚴(yán)重的果園病葉率達(dá)95.00%，病情指數(shù)達(dá)51.83。在各園區(qū)，“紅陽”獼猴桃褐斑病的病株率和病情指數(shù)均很高，且“紅陽”獼猴桃的病葉率和病情指數(shù)均明顯高于“翠玉”和“米良1號(hào)”的。根據(jù)科赫式法則，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和分子鑒定，確定引起湖南省獼猴桃褐斑病的病原菌是多主棒孢菌和葉點(diǎn)霉菌。

由于發(fā)生獼猴桃褐斑病的果園冬季未及時(shí)清園，病原菌在土壤和植物病殘?bào)w里越冬，翌年春天氣候回暖后病菌開始侵染，獼猴桃葉片在6月上旬開始發(fā)病。湖南省7月高溫多雨，病害隨即大面積暴發(fā)，如防控不當(dāng)，8月葉片開始提前枯萎凋落。葉片是獼猴桃光合作用的主要場(chǎng)所，葉片的萎焉、提前凋落會(huì)造成獼猴桃果實(shí)發(fā)育不良，營養(yǎng)缺失，口感欠佳，甚至早期落果；同時(shí)還會(huì)造成獼猴桃結(jié)果母枝的養(yǎng)分儲(chǔ)備不足，對(duì)第二年新梢發(fā)育造成嚴(yán)重影響，導(dǎo)致果園產(chǎn)量逐年降低［9］。

冬季在獼猴桃樹自然落葉之后，應(yīng)及時(shí)修剪病葉病枝，徹底清園；夏季園內(nèi)高溫高濕，應(yīng)通過修剪使園內(nèi)通風(fēng)透光，減少病害的發(fā)生。獼猴桃對(duì)水分很敏感，表現(xiàn)出喜濕潤、怕旱、不耐澇的特點(diǎn)，因此，要加強(qiáng)肥水管理。 “紅陽”獼猴桃抗病性弱，是較為嬌貴的獼猴桃品種； “米良1號(hào)”和“翠玉”獼猴桃的抗病性較強(qiáng)，其褐斑病的病情較“紅陽”獼猴桃的輕。有研究［8］表明，廣西獼猴桃褐斑病的病原菌為葉點(diǎn)霉菌；崔永亮［9］發(fā)現(xiàn)，引起四川省獼猴桃褐斑病的病原菌為多主棒孢菌，與本試驗(yàn)結(jié)果相似。本試驗(yàn)在對(duì)病原菌進(jìn)行致病性接種時(shí)，因條件有限，僅采用了室內(nèi)離體接種法，后期可采用盆栽苗活體接種法進(jìn)行試驗(yàn)；受時(shí)間限制，調(diào)查次數(shù)太少；由于調(diào)查的獼猴桃栽培地均處于山區(qū)，海拔高度差相近，未能考慮海拔因素對(duì)獼猴桃褐斑病病情的影響。在今后的研究中需擴(kuò)大調(diào)查果園的數(shù)量，另外調(diào)查時(shí)間可連續(xù)進(jìn)行3～4年，以便收集更多信息來研究湖南省獼猴桃褐斑病的病情。本研究雖然確定了湖南省獼猴桃產(chǎn)區(qū)褐斑病的病原菌，但引起各地區(qū)病原菌不同的原因還有待進(jìn)一步研究。