耐寒美國紅楓‘秋火焰’離體培養(yǎng)技術(shù)研究

楊一鵬，劉芳，楊鳳軍，張文博，于紅，李佶憓，楊春輝，楊菲紅

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 園藝園林學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

0 引言

美國紅楓(AcerrubrumL.)屬槭樹科槭樹屬多年生落葉喬木[1]。其樹體高大，適應(yīng)性廣[2]，生長速度快，抗寒、耐旱、防潮，在2000年后被引入中國，目前已發(fā)展成為最普遍的綠化樹種之一。當(dāng)前，對美國紅楓的研究主要集中在群落中重要度[3]及其在自然界中的生長和死亡率[4]，關(guān)于紅楓扦插從頭根再生(DNRR)機(jī)制[5]、開花、結(jié)果、坐果特性[6]以及用不同方法進(jìn)行栽培品種的鑒定[7]等方面也有深入研究。

美國紅楓在組織培養(yǎng)時外植體的類型選擇多種多樣。楊林星[8]以自由人槭‘秋焰’(Acer×freemanii‘Autumn Blaze’)當(dāng)年生枝莖段和休眠芽為外植體;閆洋洋[9]以美國紅楓‘十月輝煌’(Acerrubrum‘October Glory’)的嫩枝莖段和葉片為外植體;李源等[10]以美國紅楓‘白蘭地’(Acerrubrum‘Brandywine’)帶腋芽莖段為外植體。取材時間以3—6月為宜。在培養(yǎng)基選擇方面，目前美國紅楓組織培養(yǎng)中常用的基本培養(yǎng)基以WPM、MS、1/2 MS為主。在繼代增殖方面，激素多采用2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid,二氯苯氧乙酸)、TDZ(thidiazuron，噻苯隆)和GA3(gibberellic acid，赤霉素)；在生根培養(yǎng)方面，一般采用IBA(3-indolebutyric acid，吲哚丁酸)、IAA(indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)和NAA(α-naphthalene acetic acid，α-萘乙酸)均可獲得較好的生根效果，例如，美國紅楓‘十月輝煌’采用0.3 mg/L IBA進(jìn)行生根，‘中國紅’紅楓采用0.25 mg/L IBA進(jìn)行生根。在培養(yǎng)環(huán)境方面，碳源、光照和pH等環(huán)境因素也是影響美國紅楓組織培養(yǎng)的重要變量。大多數(shù)美國紅楓組培中以蔗糖作為碳源，選擇質(zhì)量濃度為3%～3.5%。光照強(qiáng)度與光照時間是限制離體快繁的關(guān)鍵因素之一，如美國紅楓‘白蘭地’在光照強(qiáng)度為1 600～2 000 lx的條件下培養(yǎng)生長更好。大多數(shù)美國紅楓組培中選擇pH為5.6～5.8[11]。

近年來，彩葉樹種市場需求擴(kuò)大，而耐寒的彩葉樹種品種較少，為了培育適合東北地區(qū)的彩色葉樹種，該研究以耐寒美國紅楓‘秋火焰’(Acerrubrum‘Autumn Blaze’)為研究對象，以腋芽莖段為外植體，調(diào)配出最佳消毒方式，并研究了美國紅楓培養(yǎng)基配方的最優(yōu)組合，旨在建立比較完整的耐寒美國紅楓組織培養(yǎng)與快繁技術(shù)體系，以期為美國紅楓組培種苗工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)支持，并為園林綠化提供大量優(yōu)質(zhì)彩色葉苗木，以提升園林景觀設(shè)計質(zhì)量，也為美國紅楓組織培養(yǎng)的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及外植體預(yù)處理

材料選用黑龍江大慶市油田樂園2016年引種馴化的美國紅楓‘秋火焰’，采集其新生枝條的帶芽莖段。先用軟毛刷蘸洗潔精刷洗5 min，再用流水沖洗30 min；將沖洗完畢的莖段放入無菌瓶中并移至超凈工作臺備用。

1.2 初代培養(yǎng)

材料預(yù)處理后，在超凈工作臺上用消毒劑對外植體消毒。試驗采用3種消毒劑進(jìn)行消毒并在培養(yǎng)基中添加抑菌劑：5% NaClO(5、8、10 min)、0.1% HgCl2(0、3、6 min)和75%酒精(30 s)，共設(shè)計9種組合。以改良MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L+20 mg/L益培靈為培養(yǎng)基，處理后的莖段外植體豎直插入培養(yǎng)基中進(jìn)行初代培養(yǎng)。每個處理接種 30 瓶，每瓶1個外植體，重復(fù)3次。接種后，觀察30 d內(nèi)外植體的污染情況和存活情況。

1.3 繼代增殖培養(yǎng)

取生長健壯、長勢均等的初代培養(yǎng)組培苗進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，剪取帶頂芽的莖段，每個莖段約3個節(jié)間，高3 cm，將處理后的莖段外植體豎直插于繼代增殖培養(yǎng)基中。以改良MS為基本培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度的CPPU(forchior fennron，氯吡苯脲)(0.2、0.4、0.6 mg/L)、6-BA(6-benzylaminopurine，6-咔氨基嘌呤)(0.05、0.1、0.2 mg/L)、IBA(0.1、0.5、1.0 mg/L)3種植物生長調(diào)節(jié)劑，設(shè)計9種處理組合，采用L9(34)正交表安排試驗。每個處理接種10瓶，每瓶3個外植體，重復(fù)3次，40 d后統(tǒng)計增殖系數(shù)及生長情況。

1.4 壯苗培養(yǎng)

將多次繼代的美國紅楓組培苗接種在上述改良MS培養(yǎng)基中，分別添加不同質(zhì)量濃度的ZT(zeatin，玉米素)(0.5、1.0、1.5 mg/L)和IBA(0.1、0.3、0.5 mg/L)。共設(shè)計9種組合。培養(yǎng)40 d觀察植株生長情況。

1.5 生根培養(yǎng)

以1/2MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同質(zhì)量濃度的GA3(0、1 mg/L)和NAA(0.1、0.2、0.5 mg/L)。共設(shè)計6種組合。培養(yǎng)40 d觀察植株生根情況。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗結(jié)果的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)用Microsoft Office Excel 2019統(tǒng)計匯總后，利用SPSS 26.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行多重對比和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒處理對外植體的影響

培養(yǎng)基中添加20 mg/L益培靈，不同消毒處理對外植體存活率的影響見表1。由表1可見，HgCl2和 NaClO處理時間不同時，不同處理間外植體的死亡率、污染率和存活率有顯著差異。隨著NaClO消毒時間的延長，污染率逐漸降低，存活率先上升后下降，且消毒8 min時存活率最高；隨著HgCl2消毒時間延長，污染率降低，存活率上升。因此，由表1可直觀得出最佳的處理組合為：5% NaClO(8 min)+0.1% HgCl2(6 min)，消毒效果最明顯，平均污染率為33.15%，平均存活率為60.98%，死亡率為5.87%。因此。處理6最適合美國紅楓帶芽莖段生長。

表1 不同消毒時間對外植體污染率及存活率的影響

由表2可見，除了5% NaClO和0.1% HgCl2消毒對平均成活率有顯著影響，5%NaClO和0.1%HgCl2消毒處理的交互作用也有顯著影響(P<0.05，下同)。處理6與單獨采用5% NaClO和單獨采用升汞消毒處理相比，平均存活率分別升高了23.69%和18.59%，平均污染率分別降低了29.64%和25.43%。但當(dāng)5% NaClO消毒時間繼續(xù)增加時，平均存活率有下降的趨勢。雙因素方差分析結(jié)果表明，5% NaClO、0.1% HgCl2以及5% NaClO和0.1% HgCl2消毒處理的交互作用對平均存活率有顯著影響，因此，最佳消毒處理組合：5% NaClO(8 min)+0.1% HgCl2處理(6 min)時平均存活率最高，適合紅楓組培苗生長。

表2 不同消毒處理雙因素方差分析結(jié)果

2.2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對紅楓組培苗繼代增殖的影響

以改良MS為基本培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度的CPPU、6-BA、IBA植物生長調(diào)節(jié)劑，正交試驗結(jié)果見表3。

表3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對組培苗繼代增殖的影響Tab.3 Effects of different plant growth regulators on subculture proliferation of tissue culture seedlings

由表4可見，因素A(CPPU)中，K2>K3>K1；因素B(IBA)中，K2>K3>K1；因素C(6-BA)中，K1>K2>K3。表3中CPPU、IBA、6-BA 3種激素的R分別為3.28、0.33、0.61，由此可以看出，在本次實驗中，CPPU的影響最大，6-BA的影響次之，而影響因素最小的是IBA。

表4 不同植物生長調(diào)節(jié)劑各水平均值及極差分析表Tab.4 The average and range analysis table of each level of different plant growth regulators

對不同植物生長調(diào)節(jié)劑紅楓組培苗繼代增殖系數(shù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表5。

表5 增殖系數(shù)方差分析

實驗選取的3個因素中，CPPU的質(zhì)量濃度對增殖系數(shù)的影響最大，其次是6-BA，最小的是IBA，且三者都達(dá)到了顯著水平。說明3種植物生長調(diào)節(jié)劑對紅楓增殖系數(shù)均有顯著影響，結(jié)合極差分析結(jié)果，紅楓組培苗增殖最優(yōu)植物生長調(diào)節(jié)劑組合為：CPPU(0.4 mg/L)+IBA(0.1 mg/L)+6-BA(1.0 mg/L)，增殖系數(shù)達(dá)6.45。結(jié)合圖1的繼代增殖表型可知，3種植物生長調(diào)節(jié)劑配合使用植株生長旺盛、葉片翠綠、長勢良好。

2.3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑處理對紅楓組培苗壯苗的影響

在預(yù)實驗進(jìn)行時發(fā)現(xiàn)，沒有經(jīng)過壯苗培養(yǎng)的組培苗，極難移栽成活，因此，組培苗移栽前一定要經(jīng)過壯苗培養(yǎng)。本試驗通過2種植物生長調(diào)節(jié)劑對紅楓組培苗進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，測量并統(tǒng)計形態(tài)指標(biāo)。測量指標(biāo)見表6，由表6可見，低質(zhì)量濃度的ZT和IBA有助于植株葉片的生長，低質(zhì)量濃度的ZT和高質(zhì)量濃度的IBA有助于植株莖段生長，處理8平均株高為6.15 cm，莖粗為21.41 mm，為最優(yōu)處理結(jié)果，植株生長健壯。

表6 不同植物生長調(diào)節(jié)劑處理對紅楓組培苗莖粗和株高的影響Tab.6 Effects of different plant growth regulator treatments on stem diameter and plant height of red maple tissue culture seedlings

處理8的平均株高和莖粗較低質(zhì)量濃度的IBA和ZT處理分別增加了19.64%和34.40%。但當(dāng)IBA質(zhì)量濃度為0.5 mg/L時，隨著ZT質(zhì)量濃度的升高，莖粗有下降的趨勢。雙因素方差分析結(jié)果表明(表7)，除了ZT和IBA的質(zhì)量濃度對紅楓組培苗莖粗的增加有顯著影響，不同質(zhì)量濃度的ZT和IBA的交互作用對莖粗的增加也有顯著影響，可得出最佳壯苗的處理組合為：IBA(0.5 mg/L)+ZT(1.0 mg/L)。

表7 莖粗和株高雙因素方差分析結(jié)果

2.4 不同植物生長調(diào)節(jié)劑處理對紅楓組培苗生根的影響

由表8可知，在1/2 MS培養(yǎng)基中分別添加GA3和NAA新型植物的生長調(diào)控劑來進(jìn)行植物生根培養(yǎng)。低質(zhì)量濃度GA3和NAA處理生根效果差，相反高質(zhì)量濃度的GA3和NAA誘導(dǎo)生根效果好。添加0.5 mg/L NAA處理的組培苗，效果最好，最長平均根長可達(dá)7.05 cm，平均根數(shù)達(dá)4.43，平均根質(zhì)量為0.23 g，生根率為100%。較低質(zhì)量濃度處理的平均根長、平均根數(shù)、平均根質(zhì)量、生根率分別增加了63.19%、89.31%、43.75%、32.90%。適宜美國紅楓組培的生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2 MS +1.0 mg/L GA3+0.5 mg/L NAA。結(jié)合圖1的表型可觀察到，經(jīng)過生根培養(yǎng)基處理的組培苗其根系極為發(fā)達(dá)和粗壯，葉片更為繁茂，長勢良好。

表8 不同植物生長調(diào)節(jié)劑處理對組培苗生根的影響

圖1 美國紅楓組織培養(yǎng)生長過程Fig.1 The growth process of American red maple tissue culture

3 討 論

3.1 外植體的消毒處理

植物離體快繁體系建立的首要條件是獲得有活性的無菌材料。本試驗材料是從室外采集的美國紅楓帶芽莖段，莖段的腋芽與莖段間易積累病菌，消毒困難，易出現(xiàn)過度消毒或消毒不完全等情況。單獨采用酒精消毒劑很難達(dá)到殺菌效果，張佳奇等[12]研究酒精和HgCl2組合對紫花槭帶芽莖段的殺菌效果，結(jié)果表明， 75%的酒精消毒40 s、0.1% HgCl2消毒8 min 效果較好，酒精消毒少于40 s外植體污染率較高 。王思冉[13]對東陵八仙花進(jìn)行離體再生研究表明，其莖段最佳消毒方法為：75%酒精消毒30 s+0.1% HgCl2消毒8 min。本試驗前期進(jìn)行預(yù)實驗時采取次氯酸鈉與酒精組合使用，平均存活率為60%，由于外生菌比較頑固，所以后期進(jìn)行試驗時引入了升汞殺滅頑固外生菌以提高存活率。美國紅楓的腋芽外包裹了多層鱗片，使其在消毒處理時部分位置沒有與消毒劑充分接觸，因此導(dǎo)致腋芽的染菌率很高。本試驗在實際操作中通過搖晃、震蕩的方式使消毒劑與外植體充分接觸，以達(dá)到充分、全面的消毒效果。本試驗為了防止內(nèi)源菌的滋生，除了使用消毒劑，初代培養(yǎng)基中還增添了抑菌劑——益培靈，抑菌效果顯著，極大地提高了組培苗成活率。目前，美國紅楓通過葉片等其他外植體未能獲得離體幼苗，因此，選用帶芽莖段進(jìn)行離體培養(yǎng)。探索美國紅楓嫩枝帶芽莖段適宜的消毒方式，為大規(guī)?？焖俜庇齼?yōu)質(zhì)美國紅楓苗木奠定了基礎(chǔ)。

3.2 繼代增殖培養(yǎng)

植物生長調(diào)節(jié)劑是在調(diào)控植物生長發(fā)育過程中具有十分重要且復(fù)雜的生理效應(yīng)。其中，細(xì)胞分裂素直接影響叢生芽的增殖系數(shù)。但濃度過高反而會抑制腋芽的形成，并且隨著多次的繼代，在植物體內(nèi)外源激素會慢慢累積，進(jìn)而抑制增殖，例如，于傳[14]關(guān)于美國紅楓腋芽增殖培養(yǎng)中，只添加TDZ，增殖系數(shù)隨著TDZ的質(zhì)量濃度先增加后下降時，添加0.002 mg/L質(zhì)量濃度TDZ和0.4 mg/L質(zhì)量濃度NAA后增殖系數(shù)最大。李黎等[15]在研究萱草不定芽增殖時發(fā)現(xiàn)，高質(zhì)量濃度的NAA和6-BA會降低萱草組織培養(yǎng)時的增殖系數(shù)。魏曉雪等[16]研究表明高質(zhì)量濃度的2，4-D會使興安百里香試管苗的增殖系數(shù)顯著下降，抑制其增殖。 在本試驗中，隨著細(xì)胞分裂素CPPU質(zhì)量濃度的增大，增殖系數(shù)有明顯下降，最高質(zhì)量濃度的處理較最優(yōu)處理下降了26.35%，與前人研究趨勢一致。

頂端分生組織產(chǎn)生的生長素會使下端分生組織或分生區(qū)在頂端分生組織保持休眠狀態(tài)[16]。而且，決定分枝行為的主要機(jī)制是細(xì)胞分裂素——生長素平衡。鑒于此，改變這些植物生長調(diào)節(jié)劑在腋芽分生組織附近的平衡可以促進(jìn)或抑制新芽的形成[17]。在本試驗中，通過提高外源細(xì)胞分裂素的質(zhì)量濃度提高增殖系數(shù)，這有可能導(dǎo)致因為外源激素質(zhì)量濃度的提高使植物體吸收的激素增多進(jìn)而打破了植物體內(nèi)激素平衡，使細(xì)胞分裂素含量顯著高于生長素含量，進(jìn)而提高了增殖系數(shù)。

CPPU是一種苯基脲衍生物，是有效的細(xì)胞分裂素降解抑制劑。但在前人的組織培養(yǎng)中更多的是應(yīng)用6-BA，而CPPU使用較少。因此，本試驗添加了CPPU來優(yōu)化不定芽的增殖培養(yǎng)，試驗結(jié)果表明，植物生長調(diào)節(jié)劑選擇與調(diào)整中選擇0.4 mg/L CPPU+0.1 mg/L IBA +1.0 mg/L 6-BA最佳，增殖系數(shù)為6.45。本試驗中對MS培養(yǎng)基進(jìn)行了改良，通過改變大量元素的種類和含量進(jìn)而調(diào)整了硝酸鹽和氯離子的比例，比MS、WPM等培養(yǎng)基更利于紅楓的生長。

3.3 生根和培苗培養(yǎng)

在生根培養(yǎng)中，添加IBA、IAA與NAA均可獲得較好的生根效果，對于細(xì)胞分裂素的用量，一般使用很少的劑量或者全部去掉。例如，適合美國紅楓‘十月輝煌’”(AcerrubrumL.‘October Glory’”)試管苗生根的激素配比為3.0 mg/L NAA+0.6 mg/L TDZ+1.0 mg/L 6-BA[18]。有研究表明，在培養(yǎng)基中添加0.2 mg/L的IBA可使黑枸杞組培苗根系更為粗壯，生根數(shù)量更多[19-21]。

本試驗中激素的選擇為赤霉素和生長素的結(jié)合，使生根率極大提高，有研究表明赤霉素能提高植物體內(nèi)生長素的含量，因此，比單獨添加生長素獲得了更高的生根率。

此外，在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，植株在繼代增殖的前幾代生根效果并不理想，而在繼代增殖4代后，從5代開始，生根率顯著提升，達(dá)到100%，說明可能是在繼代增殖培養(yǎng)的過程中，植物體會對激素進(jìn)行積累，積累到一定程度后才會有顯著的生根效果。

美國紅楓在移栽前株高和根系需要長到一定的高度和長度，組培苗的根系在無菌條件下生成，吸收功能較實生苗差，氣孔導(dǎo)度大，易失水，光合作用弱。所以，在煉苗的過程中將組培蓋改用孔隙稍大的封口膜進(jìn)行封口，并放在有溫差變化的環(huán)境中，給苗木適應(yīng)的水分和溫度變化過程，經(jīng)過此過程苗木由綠色變成泛微黃色，之后顏色又變?yōu)榫G色，說明植物已經(jīng)適應(yīng)水分變化的過程。因此，對移栽的基質(zhì)、水分、溫濕度和光照等嚴(yán)加控制管理，以提高移栽成活率，達(dá)到工廠化育苗的要求。在煉苗移栽時，根據(jù)初代培養(yǎng)加入抑菌劑能降低污染率，本試驗在移栽過程中加入了益生菌，進(jìn)而獲得了更高的成活率。

4 結(jié)論

本試驗以美國紅楓‘秋火焰’腋芽莖段為外植體離體培養(yǎng)，在無菌體系建立過程中發(fā)現(xiàn)，最佳的消毒組合為5% NaClO(8 min)+0.1%HgCl2(6 min)，污染率最低，平均污染率為33.15%，平均存活率為60.98%，死亡率為5.87%。在繼代增殖時篩選的最佳增殖培養(yǎng)基為改良MS+0.4 mg/L CPPU+0.1 mg/L IBA+1.0 mg/L 6-BA，增殖系數(shù)為6.45，說明通過外界細(xì)胞分裂素質(zhì)量濃度的增加，能夠顯著提高紅楓組培苗的增殖系數(shù)。在壯苗生根培養(yǎng)過程中，通過生長素濃度梯度的設(shè)定，篩選出最佳壯苗培養(yǎng)基為改良MS + 1.0 mg/L ZT + 0.5 mg/L IBA，平均株高為6.15 cm，平均莖粗達(dá)到21.41 mm；最佳生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2 MS+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L IBA，生根率達(dá)100%。