UHT 奶生產(chǎn)過(guò)程中晚期糖基化末端產(chǎn)物的抑制調(diào)控

薛海波，張潔菡，吳凡，王澤雨津，楊凰伶，謝琳，金思洋，彭英云，楊治風(fēng)，陳義勇

（1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟 215500；2.江蘇梁豐食品集團(tuán)有限公司，江蘇張家港 215623；3.張家港市畜牧獸醫(yī)站，江蘇張家港 215600）

0 引 言

晚期糖基化末端產(chǎn)物( advanced glycation endproducts，AGEs)是在食品加工和貯藏過(guò)程中，通過(guò)美拉德反應(yīng)生成的一類不可逆的共價(jià)化合物[1]。研究發(fā)現(xiàn)一些疾病如糖尿病及其并發(fā)癥[2]、動(dòng)脈硬化[3]、腎功能障礙[4]、心血管疾病[5]等是由AGEs 引起的。在食品熱加工過(guò)程中，如巴氏殺菌、高溫殺菌、烘烤和油炸等過(guò)程容易形成AGEs[6]。因此如何控制食品加工過(guò)程中AGEs 形成顯得尤為重要。

UHT 奶經(jīng)過(guò)超高溫瞬時(shí)滅菌后，具有常溫貯存時(shí)間長(zhǎng)、銷售方便的優(yōu)點(diǎn)[7]。但是UHT 奶加工和貯藏過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生對(duì)人體有害的產(chǎn)物AGEs，如何降低UHT 奶加工過(guò)程中產(chǎn)生的AGEs 是急需解決的問(wèn)題。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物除具有較好抗氧化作用外，同時(shí)具有顯著抗糖基化活性，如芹菜素、蘆丁、沙棘籽渣黃酮、玉米須黃酮等黃酮類物質(zhì)對(duì)AGEs 具有較高抑制作用[8]，但是黃酮類物質(zhì)應(yīng)用于乳制品生產(chǎn)過(guò)程中的AGEs 的抑制作用未見(jiàn)報(bào)道。針對(duì)UHT 奶在生產(chǎn)和貯藏過(guò)程中AGEs 的形成因素及控制鮮見(jiàn)報(bào)道的現(xiàn)狀，本研究以UHT 奶為對(duì)象，以UHT 奶中熒光性AGEs 含量為指標(biāo)，考查加工條件（糖種類、糖添加量）、貯藏條件（溫度和時(shí)間）以及添加食源性黃酮（槲皮素、蘆丁、染料木素和兒茶素）對(duì)UHT 奶生產(chǎn)和貯藏過(guò)程中AGEs 形成的影響，以期控制UHT 奶生產(chǎn)和貯藏過(guò)程中的AGEs，旨在為UHT奶的安全生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料乳，江蘇梁豐食品集團(tuán)有限公司提供；槲皮素、蘆丁、染料木素、兒茶素，陜西秦邦藥業(yè)有限公司；磷酸氫二鈉，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蔗糖、果糖、葡萄糖、果葡糖漿，鄭州百思特食品添加劑有限公司；蔗糖脂肪酸酯、單甘油脂肪酸酯，廣州立勝貿(mào)易有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RT-6000 酶標(biāo)儀，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司；AH-BASIC 均質(zhì)機(jī)，安拓思納米技術(shù)（蘇州）有限公司；TG16-WS 高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；Agilent LC-MS，美國(guó)安捷倫公司；HS-150 恒溫恒濕培養(yǎng)箱，常州市金壇友聯(lián)儀器研究所；超高溫瞬時(shí)殺菌系統(tǒng)，上海沃迪智能裝備股份有限公司；pH 計(jì)，瑞士METTLER TOLEDO 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 UHT 奶的制備流程

1.3.2 熒光性AGEs 含量的測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行熒光性AGEs 含量的測(cè)定。將2 mL UHT 奶和4 mL 甲醇混勻后在-80 ℃的條件下保存1 h，然后離心（1 3000 r/min，30 min），取0.3 mL上清液，在λex/λem=340 nm/465 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定熒光值,λex為熒光激發(fā)波長(zhǎng)340nm 處的熒光值；λem為熒光發(fā)射波長(zhǎng)465 nm 處的熒光值。以磷酸鹽緩沖溶液作為對(duì)照，每組樣品重復(fù)3 次。

1.3.3 糖種類對(duì)UHT 奶生產(chǎn)過(guò)程中熒光性AGEs 的影響

原料奶經(jīng)過(guò)檢驗(yàn)后過(guò)濾、冷卻、貯存，加入0.3%的復(fù)配穩(wěn)定劑（蔗糖脂肪酸酯和單甘油脂肪酸酯），然后分別加入添加量為2%的果糖、蔗糖、葡萄糖和果葡糖漿，充分混勻后，經(jīng)過(guò)過(guò)濾均質(zhì)，然后在137 ℃條件下進(jìn)行UHT 殺菌，殺菌時(shí)間4 s，然后取UHT 奶樣品按照1.3.2 節(jié)的方法測(cè)定熒光性AGEs 含量，以磷酸鹽緩沖溶液代替UHT 奶作為對(duì)照組，每組樣品重復(fù)3 次。

1.3.4 糖添加量對(duì)UHT 奶生產(chǎn)過(guò)程中熒光性AGEs的影響

原料奶經(jīng)過(guò)檢驗(yàn)后過(guò)濾、冷卻、貯存，加入0.3%的復(fù)配穩(wěn)定劑（蔗糖脂肪酸酯和單甘油脂肪酸酯），然后分別加入添加量為2%、4%、6%、8%的蔗糖，充分混勻后，經(jīng)過(guò)過(guò)濾均質(zhì)，然后在137 ℃條件下進(jìn)行UHT 殺菌，殺菌時(shí)間4 s，然后取UHT 奶樣品按照1.3.2 節(jié)的方法測(cè)定熒光性AGEs 含量，以磷酸鹽緩沖溶液代替UHT 奶作為對(duì)照組，每組樣品重復(fù)3 次。

1.3.5 貯藏溫度和時(shí)間對(duì)UHT 奶中熒光性AGEs 的影響

原料奶經(jīng)過(guò)檢驗(yàn)后過(guò)濾、冷卻、貯存，然后加入0.3%的復(fù)配穩(wěn)定劑（蔗糖脂肪酸酯和單甘油脂肪酸酯）和2%的蔗糖，充分混勻后，經(jīng)過(guò)過(guò)濾均質(zhì)，然后在137 ℃條件下進(jìn)行UHT 殺菌，殺菌時(shí)間4 s，滅菌完成后取出冷卻至室溫。將UHT 奶分別貯藏在4、25 ℃和37 ℃的培養(yǎng)箱中，于0、5、15、30、60 d 后取樣，樣品按1.3.2 節(jié)的方法測(cè)定AGEs 含量，以磷酸鹽緩沖溶液代替UHT 奶作為對(duì)照組，每組樣品重復(fù)3 次。

1.3.6 黃酮對(duì)UHT 奶生產(chǎn)過(guò)程中熒光性AGEs 的影響

原料奶經(jīng)過(guò)檢驗(yàn)后過(guò)濾、冷卻、貯存，然后加入0.3%的復(fù)配穩(wěn)定劑（蔗糖脂肪酸酯和單甘油脂肪酸酯）和2%的蔗糖，充分混勻后，然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4、6 和8%的槲皮素、蘆丁、染料木素和兒茶素，經(jīng)過(guò)過(guò)濾均質(zhì)，然后在137 ℃條件下進(jìn)行UHT 殺菌，殺菌時(shí)間4 s，然后取UHT 奶樣品按照1.3.2 節(jié)的方法測(cè)定熒光性AGEs 含量，以磷酸鹽緩沖溶液代替UHT 奶作為對(duì)照組，每組樣品重復(fù)3 次。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

每組數(shù)據(jù)進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)取平均值，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，作圖采用Origin8.0 軟件，利用spss20 軟件處理數(shù)據(jù)軟件進(jìn)行方差分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（P＜0.05 表示存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異）。

2 結(jié)果與討論

2.1 糖種類對(duì)UHT 奶生產(chǎn)過(guò)程中熒光性AGEs 的影響

糖種類對(duì)UHT 奶生產(chǎn)過(guò)程中熒光性AGEs 的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1 可以看出，不同糖對(duì)UHT 奶生產(chǎn)過(guò)程中熒光性AGEs 的影響較大。與蔗糖、葡萄糖和果葡糖漿相比，果糖對(duì)UHT 奶生產(chǎn)過(guò)程中熒光性AGEs 的生成起到明顯的促進(jìn)作用（P＜0.05），蔗糖對(duì)UHT 奶生產(chǎn)過(guò)程中熒光性AGEs 的生成的促進(jìn)作用最?。≒＜0.05），有利于降低AGEs 的生成。這4 種糖對(duì)AGEs 的生成促進(jìn)作用由大到小依次為果糖、葡萄糖、果葡糖漿和蔗糖，促進(jìn)AGEs 的生成的原因是因?yàn)閱翁?、低聚糖等受熱自身發(fā)生焦糖化反應(yīng)，產(chǎn)生丙酮醛（methylglyoxal，MGO），糖自身發(fā)生羥醛縮合和自氧化生成乙二醛（glyoxal，GO）[10]。MGO 和GO 又進(jìn)一步與蛋白質(zhì)結(jié)合，通過(guò)系列反應(yīng)生成戊糖素、類黑素以及羧甲基賴氨酸等AGEs[11]。因此，本實(shí)驗(yàn)中的糖原料中單糖比如葡萄糖、果糖和果葡糖漿與蔗糖相比，更易發(fā)生糖基化反應(yīng)形成熒光性AGEs，因此為了減少熒光性AGEs 的生成，蔗糖適宜作為UHT 奶加工過(guò)程中的糖原料。

圖1 糖種類對(duì)UHT 奶生產(chǎn)過(guò)程中熒光性AGEs 的影響

2.2 糖添加量對(duì)UHT 奶生產(chǎn)過(guò)程中熒光性AGEs 的影響

在確定蔗糖作為適宜生產(chǎn)UHT 奶的原料的基礎(chǔ)上，需要確定蔗糖合適的添加量。蔗糖添加量對(duì)UHT奶生產(chǎn)過(guò)程中熒光性AGEs 的影響見(jiàn)圖2，從圖2 可以看出，隨著蔗糖添加量的增加，UHT 奶中熒光性AGEs 生成量逐步增高。當(dāng)蔗糖添加量在0%～4%范圍時(shí)，隨著蔗糖添加量的增加，熒光性AGEs 生成量明顯增加（P＜0.05），原因可能是隨著糖添加量的增加，促進(jìn)了蛋白糖基化反應(yīng)。當(dāng)蔗糖添加量在4%～8%范圍時(shí)，隨著蔗糖添加量的增加，熒光性AGEs 生成量有一定程度的增加，但是增加不明顯（P＞0.05）。可能是因?yàn)殡S著蔗糖添加量（大于4%）進(jìn)一步增加，形成熒光性AGEs 的量呈現(xiàn)基本飽和狀態(tài)，進(jìn)而達(dá)到最高值[12]。因此適宜的蔗糖添加量為2%。

圖2 蔗糖添加量對(duì)UHT 奶生產(chǎn)過(guò)程中熒光性AGEs 的影響

2.3 貯藏溫度和時(shí)間對(duì)UHT 奶中熒光性AGEs 的影響

貯藏溫度和時(shí)間對(duì)UHT 奶中熒光性AGEs 的影響見(jiàn)表1，從表1 可以看出，UHT 奶在貯藏60 d 內(nèi)，熒光性AGEs 生成量隨著貯藏溫度的提高及貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。貯藏期在30 d 內(nèi)，UHT 奶中熒光性AGEs 生成量隨著貯藏溫度的提高及貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)差異顯著（P＜0.05）。在相同貯藏時(shí)間、溫度不同條件下，UHT 奶中熒光性AGEs 生成量差異顯著（P＜0.05）。在4、25 ℃和37 ℃條件下，15 d 內(nèi)熒光性AGEs 生成量增幅較大，貯藏時(shí)間超過(guò)15 d，熒光性AGEs 生成量變化不大。25 ℃和37 ℃條件下，貯藏期為30 d 時(shí)，UHT 奶中熒光性AGEs 形成量分別是4 ℃條件下的1.07 倍和1.13 倍。原因可能是貯藏溫度越高，促進(jìn)了UHT 奶中糖類物質(zhì)發(fā)生羥醛縮合，促進(jìn)脂肪發(fā)生氧化，使得生成更多的1,2-二羰基化合物，導(dǎo)致產(chǎn)生越多的AGEs[13]。隨著溫度增加AGEs 產(chǎn)量差值增加量逐漸減小，是因?yàn)闇囟壬呱葾GEs 所需的底物越來(lái)越少，溫度增加導(dǎo)致AGEs 生成量增加不明顯。由此，UHT 奶低溫存放更有利于抑制蛋白糖基化，降低AGEs 的生成。

表1 貯藏溫度對(duì)UHT 奶中熒光性AGEs 的影響

2.4 黃酮對(duì)UHT 奶生產(chǎn)過(guò)程中熒光性AGEs 的影響

黃酮對(duì)UHT 奶生產(chǎn)過(guò)程中熒光性AGEs 的影響見(jiàn)表2，從表2 可以看出，隨著黃酮添加量的增加，UHT 奶中熒光性AGEs 生成量顯著減少（P＜0.05）。4種黃酮對(duì)降低熒光性AGEs 的生成的效果排序?yàn)椋禾J?。鹃纹に兀救玖夏舅兀緝翰杷?。以蘆丁為例，當(dāng)添加量由4%增加到8%時(shí)，熒光性AGEs 的生成量降低了40.7%。黃酮能夠抑制UHT 奶生產(chǎn)過(guò)程中熒光性AGEs 的生成，可能是因?yàn)辄S酮能夠結(jié)合中間產(chǎn)物1,2-二羰基化合物，從而阻斷由1,2-二羰基化合物介導(dǎo)生成AGEs 的路徑，另外可能是因?yàn)辄S酮具有抗氧化作用，從而通過(guò)抗氧化作用阻斷由自由基引發(fā)的合成AGEs 的路徑[14-16]。

表2 黃酮對(duì)UHT 奶生產(chǎn)過(guò)程中熒光性AGEs 的影響

（續(xù)表2）

3 結(jié) 論

本文以UHT 奶生產(chǎn)過(guò)程中晚期糖基化末端產(chǎn)物調(diào)控為核心，闡明了在UHT 奶生產(chǎn)過(guò)程中，糖（包括糖種類、糖添加量）、貯藏條件（溫度和時(shí)間）以及添加食源性黃酮（槲皮素、蘆丁、染料木素和兒茶素）對(duì)UHT 奶中AGEs 生成的影響，結(jié)果表明糖對(duì)AGEs 的生成促進(jìn)作用由大到小依次為果糖、葡萄糖、果葡糖漿和蔗糖，為了減少熒光性AGEs 的生成，蔗糖適宜作為UHT 奶加工過(guò)程中的糖原料。隨著蔗糖添加量的增加，UHT 奶中熒光性AGEs 生成量逐步增高。因此，在UHT 奶加工過(guò)程中，減少糖的添加量可以大大減少熒光性AGEs 的形成。適宜的蔗糖添加量為2%。UHT 奶低溫貯藏（4 ℃）、減少貯藏時(shí)間（貯藏時(shí)間不易超過(guò)15 d，）更有利于抑制蛋白糖基化，降低AGEs的生成。在UHT 奶加工過(guò)程中，食源性黃酮具有明顯的抑制AGEs 的生成，并且隨著黃酮添加量的增加，UHT 奶中熒光性AGEs 生成量顯著減少（P＜0.05）。4 種黃酮對(duì)降低熒光性AGEs 的生成的效果排序?yàn)椋禾J?。鹃纹に兀救玖夏舅兀緝翰杷?。蘆丁具有較好的抗糖化作用，適宜作為一種UHT 奶貯藏過(guò)程中天然有效的AGEs 抑制劑。

該研究聚焦UHT 奶生產(chǎn)過(guò)程中晚期糖基化末端產(chǎn)物調(diào)控，闡明了影響UHT 奶生產(chǎn)過(guò)程中影響熒光性AGEs 生成的影響因素，從而為有效調(diào)控UHT 奶生產(chǎn)和貯藏過(guò)程中有害物質(zhì)的產(chǎn)生，為UHT 奶的安全生產(chǎn)提供了參考。