基于PI3K/Akt信號(hào)通路探討黃芩苷調(diào)節(jié)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)小鼠子宮母胎界面免疫狀態(tài)的影響

錢(qián)秋然，王杰平，張艷榮，張圓圓

（河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 開(kāi)封 475000）

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是妊娠期最常見(jiàn)的病癥之一，主要指與同一性伴侶連續(xù)2 次及2 次以上在妊娠前20 周發(fā)生自然流產(chǎn)的現(xiàn)象［1］。RSA 的發(fā)生率約占育齡婦女的2%～5%［2］，主要與生殖道感染、內(nèi)分泌紊亂、生殖免疫異常等因素緊密相關(guān)［3］，嚴(yán)重影響婦女的身心健康和家庭生活?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中記載，黃芩具有清熱安胎的作用［4］。黃芩不僅在諸多沿用至今的安胎方劑中頻繁使用，臨床實(shí)踐也證實(shí)了其有效成分黃芩苷的安胎效果?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷具有抗炎、抗氧化、抗癌和促進(jìn)T 細(xì)胞增殖等免疫調(diào)節(jié)的特性［5］。因此，本研究通過(guò)建立RSA 小鼠模型，探討黃芩苷對(duì)RSA 小鼠子宮母胎界面免疫的影響，為黃芩苷臨床治療RSA提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雌性CBA/J 小鼠80 只，體質(zhì)量20～22 g，6 周 齡，未產(chǎn)；雄性DBA/2 小鼠32 只、BALB/C 小鼠8 只，6 周齡，體質(zhì)量20～22 g。購(gòu)自武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK（鄂）2017－0013，室溫常規(guī)飼養(yǎng)，自由采食飲水。

1.2 藥物、主要試劑和儀器

黃芩苷（純度：99%，陜西帕尼爾生物科技有限公司）；白介素－10（interleukin－10，IL－10）、白介素－4（interleukin－4，IL－4）、γ干擾素（interferon－γ，IFN－γ）、腫瘤壞死因子－α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）ELISA 試劑盒（美國(guó)R&D 公司）；BCA 蛋白定量分析試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；鼠抗人磷脂酰肌醇3－激酶（Phosphoinositide 3－kinase，PI3K）抗體、絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine kinase，Akt）抗體、p－Akt 抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology 公司）；CD3、CD4、CD8 抗 體（美 國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）。

RM2235 徠卡切片機(jī)（德國(guó)徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易公司）；PowerPac 電泳儀（美國(guó)BIO－RAD 公司）；iBright CL750成像系統(tǒng)（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）。

1.3 動(dòng)物模型制備

小鼠適應(yīng)環(huán)境1 周后，采用陰道涂片法觀察母鼠發(fā)情情況。將發(fā)情的CBA/J雌鼠和DBA/2雄鼠（2∶1）合籠交配，制備RSA 模型；發(fā)情的CBA/J 雌鼠和BALB/C雄鼠（2∶1）合籠交配，制備正常妊娠模型［6］。合籠次日對(duì)雌鼠進(jìn)行陰道涂片，將雌鼠有陰栓脫落，陰道涂片顯微鏡觀察存在大量精子作為妊娠第1天［7］。

1.4 分組及干預(yù)

將RSA模型小鼠隨機(jī)分為模型組、黃芩苷低劑量組（給藥劑量為25 mg/kg）、黃芩苷中劑量組（給藥劑量為50 mg/kg）、黃芩苷高劑量組（給藥劑量為100 mg/kg）［8］，正常妊娠模型為對(duì)照組，每組16 只。黃芩苷各劑量組按5 mL/kg液體量配制相應(yīng)劑量黃芩苷生理鹽水藥液并灌胃，對(duì)照組和模型組灌胃等體積的生理鹽水，每日灌胃1次，連續(xù)14 d。

1.5 指標(biāo)觀察

1.5.1 流產(chǎn)率和胚胎丟失率

末次給藥5 h 后，準(zhǔn)確稱取各組小鼠體質(zhì)量，以30 mg/kg 戊巴比妥腹腔注射麻醉小鼠，剖開(kāi)腹部，觀察子宮并記錄胚胎著床數(shù)目和吸收數(shù)目，計(jì)算流產(chǎn)率和胚胎丟失率。

流產(chǎn)率（%）=流產(chǎn)小鼠數(shù)/實(shí)驗(yàn)小鼠總數(shù)×100%

胚胎丟失率（%）= 丟失胚胎數(shù)/（丟失胚胎數(shù)+存活胚胎數(shù)）×100%

1.5.2 組織學(xué)觀察

各組分別取8 只小鼠分離的蛻膜組織，放置于10%中性甲醛中固定48 h，酒精脫水，石蠟包埋，制作4 μm 的連續(xù)切片，進(jìn)行常規(guī)HE染色，中性樹(shù)膠封片后顯微鏡下觀察。

1.5.3 子宮組織CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞檢測(cè)

取各組剩余8 只小鼠子宮組織研磨，取一部分經(jīng)Ⅳ型膠原酶消化過(guò)濾，制成細(xì)胞密度為5×106個(gè)/mL的懸液，取100 μL 單細(xì)胞懸液加入CD3、CD4、CD8 一抗，室溫染色30 min，PBS 清洗10 min，重復(fù)2 次，經(jīng)離心后棄上清，加500 μL PBS混勻，流式細(xì)胞儀上樣檢測(cè)。

1.5.4 子宮組織IL－10、IL－4、IFN－γ 和TNF－α水平

取“1.5.3”項(xiàng)下的研磨子宮組織50 mg，加入1 mL含6倍量0.75 μg/mg的蛋白酶抑制劑的PBS進(jìn)行勻漿，勻漿液于離心機(jī)10 000 r/min 離心10 min，取上清，按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處OD 值，根據(jù)樣品OD 值計(jì)算樣品IL－10、IL－4、IFN－γ和TNF－α的濃度水平。

1.5.5 子宮組織PI3K、p－Akt蛋白表達(dá)水平

取子宮組織100 mg置于1.5 mL規(guī)格的無(wú)酶EP 管中，加入0.6 mL RIPA 試劑后充分剪碎，使用組織勻漿機(jī)勻漿，搖勻、靜置5 min，重復(fù)3 次，于高速低溫離心機(jī)13 000 r/mim 離心10 min（4 ℃），取上清液進(jìn)行BCA蛋白定量，取20 μg 樣本與20 μg 上樣緩沖液混勻后進(jìn)行SDS－PAGE 電泳，100 V 電轉(zhuǎn)30 min，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，加入5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入稀釋1∶1 000 的PI3K、Akt、p－Akt、β－actin 一抗，4 ℃搖床孵育過(guò)夜，TBST 洗膜10 min 2 次，加入稀釋1∶5 000 的二抗室溫孵育1 h，TBST 洗膜10 min 2 次，ECL 顯色，Image J 軟件分析，以目的蛋白條帶/β－actin 內(nèi)參灰度值比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用軟件SPSS 24.0 分析處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多樣本計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD－t檢驗(yàn)。以P< 0.05 代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠流產(chǎn)率和胚胎丟失率比較

與對(duì)照組比較，模型組小鼠流產(chǎn)率和胚胎丟失率均顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，黃芩苷各劑量組流產(chǎn)率和胚胎丟失率均顯著降低（P<0.05）。流產(chǎn)率和胚胎丟失率與黃芩苷呈劑量依賴性降低（P<0.001）。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠流產(chǎn)率和胚胎丟失率比較（n=16）

2.2 各組小鼠子宮蛻膜組織情況比較

對(duì)照組小鼠蛻膜組織細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞界限分明，血管豐富。模型組小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜樣變，細(xì)胞排列紊亂，部分蛻膜細(xì)胞壞死，間質(zhì)水腫，間質(zhì)血管數(shù)量減少，血管減少，炎性細(xì)胞明顯可見(jiàn)。黃芩苷各劑量組蛻膜組織細(xì)胞形態(tài)明顯改善，間質(zhì)細(xì)胞排列規(guī)則，間質(zhì)水腫減少、血管數(shù)量增多，趨向?qū)φ战M，且蛻膜組織細(xì)胞形態(tài)改善情況與黃芩苷劑量呈正相關(guān)。見(jiàn)圖1。

圖1 子宮蛻膜組織HE染色圖（×400）

2.3 各組小鼠子宮組織CD4+、CD8+ T 淋巴細(xì)胞水平比較

與對(duì)照組比較，模型組小鼠CD4+T 淋巴細(xì)胞比例及CD4+/CD8+降低，CD8+T 淋巴細(xì)胞比例升高（P< 0. 05）；與模型組比較，黃芩苷各劑量組CD4+T 淋巴細(xì)胞比例及CD4+/CD8+升 高，CD8+T 淋巴細(xì)胞比例降低（P< 0. 05）。CD4+T 淋巴細(xì)胞比例、CD4+/CD8+與黃芩苷呈劑量依賴性升高，CD8+T淋巴細(xì)胞比例與黃芩苷呈劑量依賴性降低（P<0. 001）。見(jiàn)表2。

表2 子宮組織CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞水平比較（±s，n=8）

表2 子宮組織CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞水平比較（±s，n=8）

注：與對(duì)照組比較，aP < 0.05；與模型組比較，bP < 0.05；與黃芩苷低劑量組比較，cP<0.05；與黃芩苷中劑量組比較，dP<0.05。

組別對(duì)照組模型組黃芩苷低劑量組黃芩苷中劑量組黃芩苷高劑量組F值P值CD4+T淋巴細(xì)胞（%）32.16±3.45 15.24±2.91a 19.35±2.76ab 24.47±3.14abc 29.18±2.17abcd 45.109<0.001 CD8+T淋巴細(xì)胞（%）12.46±2.48 27.17±3.11a 23.36±2.78ab 19.64±2.18abc 14.69±1.94abcd 45.667<0.001 CD4+/CD8+2.66±0.38 0.52±0.21a 0.83±0.19ab 1.26±0.27abc 1.97±0.24abcd 85.043<0.001

2.4 各組小鼠子宮組織IL－10、IL－4、IFN－γ 和TNF－α水平比較

與對(duì)照組比較，模型組小鼠子宮組織中TNF－α、IFN－γ 水平顯著升高，IL－4、IL－10 水平顯著降低（P<0.05）；與模型組比較，黃芩苷各劑量組TNF－α、IFN－γ 水平顯著降低，IL－4、IL－10 水平顯著升高（P<0.05）。TNF－α、IFN－γ 水平與黃芩苷呈劑量依賴性降低，IL－4、IL－10 水平與黃芩苷呈劑量依賴性升高（P<0.001）。見(jiàn)表3。

表3 子宮組織IL－10、IL－4、IFN－γ和TNF－α水平比較（±s，μg/L，n=8）

表3 子宮組織IL－10、IL－4、IFN－γ和TNF－α水平比較（±s，μg/L，n=8）

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與黃芩苷低劑量組比較，cP<0.05；與黃芩苷中劑量組比較，dP<0.05。

組別對(duì)照組模型組黃芩苷低劑量組黃芩苷中劑量組黃芩苷高劑量組F值P值TNF－α 18.32±4.45 87.64±5.76a 64.41±6.13ab 51.28±4.71abc 29.54±4.36abcd 231.347<0.001 IFN－γ 34.46±4.31 93.26±5.16a 82.74±5.31ab 64.27±5.89abc 42.94±5.23abcd 186.238<0.001 IL－4 104.25±8.13 43.55±6.37a 59.14±6.48ab 72.33±6.23abc 91.46±8.22abcd 92.949<0.001 IL－10 62.12±4.41 31.25±3.78a 39.11±3.91ab 45.36±4.32abc 57.46±4.97abcd 70.465<0.001

2.5 各組小鼠子宮組織PI3K、p－Akt 蛋白表達(dá)情況比較

與對(duì)照組比較，模型組小鼠PI3K、p－Akt 蛋白表達(dá)均顯著降低（P<0.05）；與模型組比較，黃芩苷各劑量組PI3K、p－Akt 蛋白表達(dá)均顯著升高（P< 0.05）。PI3K、p－Akt 蛋白表達(dá)與黃芩苷呈劑量依賴性升高（P<0.001）。見(jiàn)表4、圖2。

表4 各組小鼠PI3K、p－Akt蛋白比較（±s，n=8）

表4 各組小鼠PI3K、p－Akt蛋白比較（±s，n=8）

注：與對(duì)照組比較，aP < 0.05；與模型組比較，bP < 0.05；與黃芩苷低劑量組比較，cP<0.05；與黃芩苷中劑量組比較，dP<0.05。

組別對(duì)照組模型組黃芩苷低劑量組黃芩苷中劑量組黃芩苷高劑量組F值P值PI3K 0.92±0.08 0.41±0.06a 0.53±0.07ab 0.71±0.06abc 0.83±0.08abcd 70.843<0.001 p－Akt/Akt 0.84±0.07 0.35±0.05a 0.48±0.06ab 0.59±0.07abc 0.72±0.05abcd 80.935<0.001

圖2 子宮組織PI3K、p－Akt蛋白檢測(cè)

3 討論

RSA 是一個(gè)多因素疾?。?］，目前關(guān)于RSA 的分析研究主要集中在免疫和炎癥相關(guān)方面，并認(rèn)為RSA 和免疫機(jī)制之間存在重要聯(lián)系［10－11］。RSA 屬“滑胎”范疇，腎為胎元穩(wěn)固之本，治療滑胎應(yīng)以養(yǎng)陰清熱、補(bǔ)腎固胎為主。黃芩自古便被用來(lái)治療胎動(dòng)和流產(chǎn)，黃芩苷是其主要有效成分，研究證實(shí)不論是中藥黃芩還是單體黃芩苷的形式均具有顯著的保胎作用［12］。近年來(lái)有許多關(guān)于黃芩苷的研究，但對(duì)其治療RSA 的研究鮮有所見(jiàn)。因此，本研究通過(guò)建立RSA 小鼠模型，探究黃芩苷對(duì)RSA小鼠的作用機(jī)制。

本研究中，黃芩苷各劑量組小鼠流產(chǎn)率和胚胎丟失率較模型組降低，提示黃芩苷可促進(jìn)RSA 小鼠胚胎健康生長(zhǎng)，有較明顯的保胎效用。母胎界面免疫微環(huán)境為胚胎提供穩(wěn)定健康的生長(zhǎng)環(huán)境，在妊娠胚胎生長(zhǎng)發(fā)育維持以及臨產(chǎn)的發(fā)動(dòng)過(guò)程中起著重要作用。CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞是調(diào)節(jié)母胎免疫耐受狀態(tài)細(xì)胞群中的兩種重要亞群［13］。CD4+T 淋巴細(xì)胞發(fā)揮免疫效應(yīng)即增強(qiáng)母體對(duì)胚胎的免疫毒性，CD8+T 淋巴細(xì)胞發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用即母體免疫產(chǎn)生耐受行為，CD4+/CD8+T比例異常，免疫耐受失衡會(huì)導(dǎo)致RSA 的發(fā)生［14］。CD4+T 細(xì)胞受到抗原刺激分化為T(mén)h0 細(xì)胞，后因不同細(xì)胞因子刺激分化為不同生物學(xué)作用的Th1、Th2、Th17和Treg細(xì)胞［15］。Th1型細(xì)胞分泌TNF－α、IFN－γ等因子［16］，對(duì)正常妊娠有副作用；Th2 型細(xì)胞則分泌IL－4、IL－10等因子［17］，對(duì)正常妊娠有促進(jìn)作用。研究表明母胎界面中Th1/Th2 細(xì)胞因子平衡異常與RSA 的形成有關(guān)［18－19］。本研究中黃芩苷各劑量組小鼠CD4+T淋巴細(xì)胞、IL－4、IL－10 水平較模型組升高，CD8+T 淋巴細(xì)胞、CD4+/CD8+、TNF－α、IFN－γ 水平較模型組降低，提示黃芩苷有助于維持免疫耐受狀態(tài)，抑制Th1細(xì)胞分泌攻擊型因子，促進(jìn)Th2 細(xì)胞分泌保護(hù)性細(xì)胞因子，維持Th1/Th2平衡，促進(jìn)正常妊娠。

PI3K/Akt信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂、分化、生長(zhǎng)、代謝以及凋亡等一系列生物學(xué)進(jìn)程［20］。有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K 調(diào)控下游靶蛋白Akt 發(fā)生磷酸化，活化的PI3K/Akt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可調(diào)節(jié)人滋養(yǎng)層細(xì)胞的生長(zhǎng)，影響胎盤(pán)形成和胚胎早期的發(fā)育維持［21］，改善子宮內(nèi)膜容受性，易于胚胎著床，降低流產(chǎn)率［22］。本研究中黃芩苷各劑量組小鼠PI3K、p－Akt 蛋白表達(dá)均較模型組顯著升高，提示黃芩苷可能通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/Akt 信號(hào)通路蛋白穩(wěn)固了胚胎的正常發(fā)育，降低流產(chǎn)的發(fā)生率，促進(jìn)RSA小鼠正常妊娠。

綜上所述，黃芩苷能夠降低RSA 小鼠的流產(chǎn)率，促進(jìn)胚胎的正常發(fā)育，改善子宮母胎免疫耐受狀態(tài)，該作用可能與調(diào)控PI3K/Akt 信號(hào)通路蛋白有關(guān)，本研究為黃芩苷臨床治療RSA提供了一定的理論支持。