蘿卜硫素提取純化及其抗癌功能研究進(jìn)展

張 璇，田明碩，王 健，高明坤，高宇航，劉 媛, ，徐東輝，劉廣洋,

（1.河北北方學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院，河北省農(nóng)產(chǎn)品食品質(zhì)量安全分析檢測重點實驗室，河北張家口 075000；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蔬菜質(zhì)量安全控制重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蔬菜產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（北京），北京 100081；3.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北邯鄲 056038）

十字花科植物屬于雙子葉被子植物，有330 多個屬，約3700 多種，是世界范圍內(nèi)具有重要經(jīng)濟(jì)價值和營養(yǎng)價值的物種。在我國，蕓薹屬和蘿卜屬是主要的蔬菜和油料作物。蕓薹屬植物是十字花科植物中最重要的一個屬[1]，包括卷心菜、西蘭花、花椰菜、芥菜、甘藍(lán)等，其中含有多種生物活性物質(zhì)，如多酚類、黃酮類、萜類、類胡蘿卜素以及芥子油苷等，可產(chǎn)生抗癌、抗炎、抗菌等多種功效（圖1），因此受到廣泛關(guān)注。在十字花科蔬菜的眾多生物活性物質(zhì)當(dāng)中，硫代葡萄糖苷具有十分重要的作用，它是植物體內(nèi)合成的一類含氮次級化合物[2]，包括120 多種結(jié)構(gòu)[3]，根據(jù)側(cè)鏈基團(tuán)的不同可分為芳香族、脂肪族和吲哚族三類[4]。當(dāng)十字花科蔬菜因收割、加工、咀嚼或植物降解而使植物細(xì)胞破碎時[5]，硫葡糖苷葡糖水解酶（黑芥子硫酸苷酶，簡稱黑芥子酶）釋放出來，脂肪族中的4-甲基亞磺?；』虼咸烟擒战?jīng)水解可產(chǎn)生蘿卜硫素[6]。

圖1 蕓薹屬蔬菜的主要生物活性及其生物活性化合物[1]Fig.1 Main biological activities of Brassica vegetables and their bioactive compounds[1]

蘿卜硫素（1-異硫氰酸酯-4-甲基亞磺?；⊥?，Sulforaphane）[7]，又被稱為“萊菔硫烷”，屬于一種異硫氰酸鹽，常溫條件下為黃色或無色的液體，極易溶于有機(jī)溶劑，在水中也有一定的溶解性[8]，在高溫和堿性條件下易被分解[9-10]，其分子式為C6H11S2NO，相對分子質(zhì)量為177.3，分子模型見圖2。蘿卜硫素不僅具有代謝解毒[11]、抗氧化[12]、抗炎[13]、抗菌[14]、免疫調(diào)節(jié)[15]的作用，還是目前蔬菜中發(fā)現(xiàn)的抗癌效果最強(qiáng)的天然活性物質(zhì)。試驗證明，蘿卜硫素可以誘導(dǎo)PhaseⅡ（致癌因子解毒）酶類的產(chǎn)生[16-17]，如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、環(huán)氧化物酶、醌還原酶等，這些酶類可以摧毀致癌因子的活性中心或?qū)⑺鼈兣c內(nèi)源配基結(jié)合起來，加速將其排出體外，防止致癌物質(zhì)破壞健康細(xì)胞內(nèi)的遺傳因子[18]。目前，已有許多蘿卜硫素相關(guān)報道，但系統(tǒng)全面的概述較少，需要進(jìn)行綜述研究。該綜述即對蘿卜硫素提取、純化方法以及抗癌應(yīng)用等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了系統(tǒng)地介紹，并對研究前景進(jìn)行了展望。

圖2 蘿卜硫素分子模型Fig.2 Sulforaphane molecular model

1 蘿卜硫素的提取

蘿卜硫素制備方法主要有化學(xué)合成法[19]、酶法[20-21]以及半合成法[22]?；瘜W(xué)合成法即通過各種化學(xué)反應(yīng)生成蘿卜硫素，一種蘿卜硫素的化學(xué)合成法是以四氫噻吩、甲基碘、四氟硼酸鈉為原料，合成S-甲基四氫噻吩鎓四氟硼酸鹽，再與疊氮化鈉反應(yīng)生成1-疊氮-（4-甲基磺酰基）丁烷，經(jīng)施陶丁格反應(yīng)得到異硫氰酸酯，最后經(jīng)H2O2氧化得到蘿卜硫素（圖3）。蘿卜硫素具有旋光異構(gòu)體，并且基團(tuán)活性強(qiáng)，化學(xué)反應(yīng)條件難以控制，步驟繁瑣并且成本高昂，故化學(xué)合成法在實際生產(chǎn)中較少應(yīng)用[23]。酶法是以十字花科蔬菜及種子為原料，原料中蘿卜硫苷經(jīng)黑芥子酶水解，最終得到蘿卜硫素。半合成法是將化學(xué)合成法與酶法結(jié)合起來，以蘿卜硫苷結(jié)構(gòu)類似物為原料，通過生物或化學(xué)轉(zhuǎn)化法得到蘿卜硫苷，再水解得到蘿卜硫素。該方法優(yōu)點是原料廉價易得，缺點是在提取硫代葡萄糖苷前需經(jīng)過滅酶處理，生成的蘿卜硫苷還需加入外源硫代葡萄糖苷酶水解得到蘿卜硫素[24]?；瘜W(xué)合成法和半合成法均需使用大量有機(jī)溶劑，不利于蘿卜硫素的實際應(yīng)用，因此，目前多數(shù)研究仍采用酶法獲取蘿卜硫素。

1.1 植物種子中蘿卜硫素的提取

研究表明，十字花科蕓薹屬植物花椰菜、青花菜和甘藍(lán)等的硫代葡萄糖苷含量較高，尤其在其種子中的含量最為豐富。吳元鋒等[25]以西蘭花、甘藍(lán)、芥藍(lán)、羽衣甘藍(lán)、球莖甘藍(lán)、大白菜、花菜7 個種類的蕓薹屬蔬菜共28 個品種的種子為原料，比較了它們的蘿卜硫素提取率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)西蘭花種子中蘿卜硫素的提取率要比其它種子高很多，其中綠龍1 號提取率最高，達(dá)1575.5 mg/kg。西蘭花屬于蕓薹屬甘藍(lán)種的一個變種，研究發(fā)現(xiàn)，西蘭花雖然不是總硫代葡萄糖苷含量最高的蔬菜，但西蘭花中硫代葡萄糖苷均具有較高的活性，酶解產(chǎn)物最高的是蘿卜硫素。因此，人們常以西蘭花種子為原料提取蘿卜硫素，制備過程一般包括脫脂、酶解、提取三步。

1.1.1 脫脂 西蘭花種子含有大量的油脂，阻礙芥子酶與硫代葡萄糖苷的接觸[26]，因此在酶解前要對種子進(jìn)行脫脂處理。也有研究者認(rèn)為脫脂可能會使芥子酶失活而減少異硫氰酸鹽的形成，探究了原料脫脂對蘿卜硫素提取率的影響，結(jié)果表明仍然是先脫脂再提取的提取率更高[25]，因此在酶解之前要對種子進(jìn)行脫脂處理，常使用有機(jī)溶劑如正己烷、石油醚等脫脂。黃憶真[27]將超臨界CO2萃取法應(yīng)用于西蘭花種子脫脂過程，并將其與傳統(tǒng)的石油醚脫脂進(jìn)行了對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用石油醚脫脂時，提取液較為渾濁，而超臨界脫脂法的出油率更高，蘿卜硫素得率也更高。在對超臨界CO2萃取工藝進(jìn)行優(yōu)化后可除去西蘭花種子中94%的油脂，優(yōu)化結(jié)果為：萃取壓力30 MPa、CO2流量7 BV/h、粉碎粒徑40 目、萃取時間4 h、萃取溫度40 ℃，有利于后期蘿卜硫素的提取純化。

1.1.2 酶解 酶解是蘿卜硫素獲取過程中至關(guān)重要的一步，在不經(jīng)酶解的情況下，蘿卜硫素的含量幾乎為0，而酶解條件對于蘿卜硫素提取率則有著重要的影響。蘿卜硫苷水解產(chǎn)物有4 種，最常見的是蘿卜硫素與蘿卜硫腈（圖4）。研究表明，蘿卜硫素生成的最適pH 為5.0～8.0，酶解時間為8～12 h。考慮成本因素，酶解過程一般采用內(nèi)源性酶。謝述瓊等[28]通過單因素梯度實驗研究，采用自身芥子苷酶酶解方式得到西蘭花種子中蘿卜硫素，確定其最佳的酶解時間為8 h，酶解料液比為1:2，酶解pH 為7.0，蘿卜硫素含量最大為6.682 mg/g。吳華彰等[29]采用正交試驗對西蘭花種子中蘿卜硫素提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，以pH 為5.0 的0.1 mol/L 醋酸-醋酸鈉蘿卜汁緩沖液為酶解緩沖體系時蘿卜硫素提取率高，這是由于蘿卜中含有大量的硫代葡萄糖苷水解酶，在酶解緩沖液中添加蘿卜汁可促進(jìn)酶解反應(yīng)的進(jìn)行，同時該試驗還添加了Zn2+和VC以激活硫代葡萄糖苷水解酶的活性，且VC還有穩(wěn)定產(chǎn)物的作用，最終確定了Zn2+濃度0.1 mol/L、VC濃度0.5 mg/mL 為最佳條件，在此酶解條件下西蘭花種子中蘿卜硫素得率達(dá)到17.066 mg/g。

1.1.3 提取 硫代葡萄糖苷酶解后，一般用丙酮[31]、乙酸乙酯[32]、二氯甲烷[33-34]等提取蘿卜硫素，也有少數(shù)研究者以水[35]為提取溶劑。研究表明，二氯甲烷作萃取劑時，蘿卜硫素的提取率最高，而且容易揮發(fā)，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時容易除去。但是二氯甲烷毒性較大，當(dāng)提取的蘿卜硫素用作食品或藥品時，應(yīng)采用乙酸乙酯作為萃取劑。近年來，超聲輔助萃取法在植物活性成分的提取中得到了廣泛的應(yīng)用。與傳統(tǒng)的溶劑萃取法相比，超聲輔助萃取法具有溶劑用量較少，萃取時間較短等特點。超聲波輔助酶解代替室溫下靜置酶解，可以借助超聲波的渦旋和空化作用，使蘿卜硫苷與黑芥子酶的接觸面積和頻率增加，從而縮短酶解時間，提高提取效率，超聲時間60 min 即可達(dá)到室溫下靜置酶解10 h 的蘿卜硫素提取量[31]。謝述瓊等[28]借助超聲輔助提取西蘭花種子中的蘿卜硫素，結(jié)果表明，最佳條件為：超聲浸提溶劑為80%乙醇，超聲浸提時間為30 min，超聲浸提的次數(shù)為2 次。超聲浸提溶劑選擇乙醇是因該溶劑相對更易采購，且在生產(chǎn)中更無毒更安全。蘿卜硫素提取出后，將提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥后即得到蘿卜硫素粗品。

1.2 植物體中蘿卜硫素的提取

各種蔬菜中，西蘭花種子中蘿卜硫素的前體含量高，容易得到，研究者多以西蘭花種子為原料提取蘿卜硫素，但由于種子價格高，提取成本高，難以實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，故采用此原料不能產(chǎn)生較好的經(jīng)濟(jì)效益。以苗或蔬菜為原料提取蘿卜硫素時，只需酶解、提取兩步，方法與以種子為原料基本相同，且蔬菜易獲取，適合大規(guī)模生產(chǎn)。因此，有些研究者以植物體本身為原料提取蘿卜硫素，并不斷探索和優(yōu)化其提取工藝。

1.2.1 西蘭花中蘿卜硫素的提取 西蘭花作為自然界中蘿卜硫苷含量最豐富的蔬菜之一[36]，常被用于蘿卜硫素的提取。胡翠珍等[23]以西蘭花鮮食部分綠色幼嫩花莖和花蕾為原料，利用響應(yīng)面法對添加劑和超聲波輔助酶解西蘭花提取蘿卜硫素工藝進(jìn)行優(yōu)化，最終得到：添加外源芥子酶提取蘿卜硫素的優(yōu)化條件為抗壞血酸添加量為4.659 mmol/L，EDTA 為6 mmol/L，MgSO4為8.5 mmol/L，CaCl2為4.0 mmol/L，在30 ℃下酶解60 min，蘿卜硫素提取率為1813.26 μg/g。唐斌等[37]同時以西蘭花鮮食部分幼嫩花莖和花蕾為原料，添加外源芥子酶，對西蘭花進(jìn)行酶解并超聲波輔助乙醇提取蘿卜硫素，利用單因素及響應(yīng)面法對工藝參數(shù)進(jìn)行篩選及優(yōu)化，確定了西蘭花中蘿卜硫素的最佳提取參數(shù)為酶解時間0.95 h，料液比1:41.8，提取時間1.1 h，此條件下西蘭花中蘿卜硫素提取率達(dá)1814.59 μg/g。

西蘭花中纖維素含量較高，因此可以添加纖維素酶水解植物細(xì)胞壁上的纖維素，從而提高細(xì)胞質(zhì)中蘿卜硫苷以及黑芥子酶的釋放，促進(jìn)蘿卜硫素的生成。張靜等[38]以西蘭花為原料，采用纖維素酶輔助提取法并優(yōu)化酶解工藝，結(jié)果顯示，酶解時間7.1 h，酶解pH6.0，酶解溫度36.8 ℃，纖維素酶添加量2.5%時，蘿卜硫素提取量為（408.74±0.83）μg/g。

對于蘿卜硫素的提取，較少學(xué)者以西蘭花采收后副產(chǎn)物（丟棄的根莖葉）為原料，因為硫苷在未發(fā)芽的種子中含量最高，隨著芽苗的生長而逐漸下降，含量由高到低依次為：種子、芽苗、子葉、下胚軸、根[39]。在實際生活中，西蘭花采收后丟棄大量的根莖葉，既造成浪費又污染環(huán)境，因此對其進(jìn)行蘿卜硫素等生物活性成分的提取和利用具有重要的實際意義。趙登奇等[40]對西蘭花葉中的生物活性成分含量進(jìn)行了探究，測定西蘭花廢棄葉中蘿卜硫素含量為92.50 μg/g DW，為西蘭花副產(chǎn)物的回收利用提供了數(shù)據(jù)支持。張錦華等[31]以西蘭花副產(chǎn)物為原料，利用外源酶和超聲波輔助酶解提取蘿卜硫素，酶解浸提工藝經(jīng)優(yōu)化后得到的蘿卜硫素最佳提取條件為：酶解pH5.0、酶解溫度35 ℃、酶解時間67 min，蘿卜硫素提取量為151.39 μg/g。除酶解過程中使用超聲波進(jìn)行輔助，該試驗還將超聲波輔助應(yīng)用于提取過程中：經(jīng)超聲酶解后的樣品進(jìn)行真空冷凍干燥，再用丙酮溶解，超聲提取90 min，抽濾，即可得到蘿卜硫素粗提取液。在西蘭花副產(chǎn)物中提取蘿卜硫素不僅可以提高西蘭花的綜合利用率，還為蘿卜硫素的工業(yè)化生產(chǎn)提供了發(fā)展方向。

1.2.2 蘿卜中蘿卜硫素的提取 胭脂蘿卜是提取食用天然色素蘿卜紅素的理想原料之一，然而在紅色素生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生的大量蘿卜廢渣，這些廢渣幾乎全部被廢棄，這不僅造成資源的浪費，還容易污染環(huán)境。陽暉等[41]發(fā)現(xiàn)這些蘿卜廢渣中不僅含有大量蘿卜硫素前體物質(zhì)－蘿卜硫苷，而且還含有可以降解蘿卜硫苷生成蘿卜硫素的葡萄糖硫苷酶，因此，可以利用胭脂蘿卜廢渣來制備蘿卜硫素，不僅降低生產(chǎn)蘿卜硫素的成本，而且還有利于胭脂蘿卜廢渣的循環(huán)利用，同時為大規(guī)模開發(fā)蘿卜硫素系列產(chǎn)品提供實踐基礎(chǔ)。根據(jù)其在胭脂蘿卜廢渣中提取蘿卜硫素的酶解工藝優(yōu)化試驗得到：在酶解溫度為31 ℃，酶解時間為7.7 h，pH5.6，VC添加量為0.24 mg/kg 條件下，蘿卜硫素的得率最高為0.05613%。陽暉等[42]還以胭脂蘿卜廢渣為原料，以乙酸乙酯為提取劑，利用響應(yīng)面分析法對超聲輔助提取蘿卜硫素的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，當(dāng)提取溫度為26 ℃、液固比例為31:1、提取時間為2.9 h、超聲時間為29 min 時提取效果最佳，提取率為0.04973%。

紅心蘿卜（心里美蘿卜）也是提取蘿卜硫素常用的原料之一，該物易得且價格便宜，蘿卜硫苷的含量也相對較高。張國良等[43]以紅心蘿卜為原料，對水解條件進(jìn)行正交試驗，以乙酸乙酯萃取3 次，然后進(jìn)行分離純化，最終得到純度為90.67%的樣品，平均回收率為99.03%。紅心蘿卜是北方較為常見的蔬菜種植品種，該試驗不僅為蘿卜硫素的工業(yè)化生產(chǎn)、成本控制提供了方向，同時也為北方紅心蘿卜的開發(fā)利用、經(jīng)濟(jì)效益的提高提供了可行性指導(dǎo)意見。

采用軸承2先裝配的裝配過程，重載轉(zhuǎn)動副可裝配性評價同理可得。通過可裝配性條件分析，便能得到基于可裝配性評價不同裝配過程的優(yōu)劣。上述評價方法將重載轉(zhuǎn)動副裝配過程與可裝配性綜合考慮進(jìn)行研究。

綜上，針對蘿卜硫素的提取，一般采用液-液萃取法，包括水提法、有機(jī)溶劑萃取法、超聲波輔助萃取法等。在Tanongkankit 等[44]的試驗中，還采取了微波輔助萃取法提取甘藍(lán)中的蘿卜硫素，并與水提法、有機(jī)溶劑萃取法進(jìn)行比較，結(jié)果表明，微波輔助萃取比傳統(tǒng)萃取效率更高，在微波功率為12 W，萃取溫度為（37.5±0.5）℃時萃取1.5 min，提取率可達(dá)（0.028±0.011）mg/g。

2 蘿卜硫素的純化

液-液萃取后得到的蘿卜硫素純度較低，為了得到更高純度的蘿卜硫素，以便后續(xù)相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)，通常需要對其進(jìn)行純化。對于蘿卜硫素的純化工藝，目前已有多種方法，主要包括大孔樹脂吸附法、柱層析法、反相高效制備液相色譜法、高速逆流色譜法、半制備高效液相色譜法等。

2.1 大孔樹脂吸附法

大孔吸附樹脂是具有多孔性和較大比表面積的一類新型非離子高分子化合物，通過物理吸附從溶液中有選擇地吸附有機(jī)物質(zhì)達(dá)到分離提純的目的。大孔樹脂在天然活性成分如皂苷、黃酮、內(nèi)酯、生物堿、多酚等大分子化合物的提取分離中已被廣泛應(yīng)用，對中藥成分、抗生素、維生素等物質(zhì)也有良好的吸附效果[45]。Li 等[46]采用大孔樹脂吸附法，實現(xiàn)了蘿卜硫素的分離純化，并對蘿卜硫素在HP20、SP207、SP850 和HP2MGL 這幾種大孔樹脂上的吸附解吸性能進(jìn)行了對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SP850 樹脂對蘿卜硫素的分離性能最好，最終得到了純度為85.9%的蘿卜硫素。劉錫建等[47]也對SP850 樹脂分離蘿卜硫素進(jìn)行了報道，結(jié)果顯示，通過SP850 樹脂吸附解吸，最終得到的蘿卜硫素純度為88.7%，高于Li 等的結(jié)果。所確定的SP850 樹脂純化蘿卜硫素的最適條件為：上柱液體積20 BV、上柱流速5 BV/h，洗脫液為6 BV 的50%乙醇，洗脫速度3 BV/h。研究表明，SP850 樹脂吸附性能好、洗脫條件溫和、洗脫率高，成本相對較低，適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。

2.2 柱層析法

柱層析法又稱柱色譜法，主要原理是根據(jù)樣品混合物中各組分在固定相和流動相中分配系數(shù)不同，經(jīng)多次反復(fù)分配將組分分離開來。在蘿卜硫素的純化中，主要有硅膠柱層析法和凝膠柱層析法。

2.2.1 硅膠柱層析法 硅膠機(jī)械強(qiáng)度優(yōu)良、表面易改性，是應(yīng)用最廣泛的色譜柱填料[48]。硅膠柱層析法是根據(jù)物質(zhì)在硅膠上的吸附力不同而將其分離，極性較大的物質(zhì)與硅膠作用強(qiáng)，保留時間長；相反，極性弱的物質(zhì)與硅膠作用弱，保留時間短，物質(zhì)在固定相與流動相間通過反復(fù)的吸附、解吸過程，得以分離。張國良等[43]采用硅膠柱層析法純化蘿卜硫素，2 次上柱后得到純度為90.67%的純品；Liang 等[49]以硅膠為固定相，三氯甲烷/甲醇為流動相，以正己烷和乙醇為洗脫劑梯度洗脫，得到90%以上純度的蘿卜硫素。Liang 等認(rèn)為，該方法操作壓力低且成本相對較低。

2.2.2 凝膠柱層析法 凝膠柱層析選擇性高、干擾因素少且可以循環(huán)利用，是經(jīng)典的分離純化技術(shù)，在化工、生物、制藥、環(huán)境等領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用[50-55]。葡聚糖凝膠中最常見的是Sephadex 系列，對于蘿卜硫素的純化，常使用的型號為Sephadex LH-20。Sephadex LH-20 的分離原理主要有兩方面：一是凝膠的過濾作用，二是在反相溶劑中的反向分配作用。Sephadex LH-20 洗脫溶劑分為反相和正相兩類，樣品極性大，選用反相溶劑洗脫（甲醇-水），樣品極性小，則選用正相溶劑洗脫（氯仿-甲醇）。蘿卜硫素極性小，一般采用正相系統(tǒng)，以氯仿-甲醇為洗脫劑[56]。

為了獲得更高純度的蘿卜硫素，有些學(xué)者在試驗過程中先后采用硅膠柱和凝膠柱兩種層析法進(jìn)行純化。李揚[56]、蘇光耀[57]均采用了硅膠柱層析法初步純化，Sephadex LH-20 凝膠柱層析法進(jìn)一步純化的方法，得到蘿卜硫素精制品。蘿卜硫素粗提物上硅膠層析柱，以正己烷和丙酮為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，初步分離后上Sephadex LH-20 凝膠層析柱再進(jìn)行洗脫。蘇光耀和李揚得到的蘿卜硫素純度分別為80%±2.8%和90.4%，這可能是由于硅膠層析時梯度洗脫的濃度及Sephadex LH-20 凝膠層析時選用的洗脫劑不同所致。蘇光耀硅膠層析梯度洗脫時正己烷：丙酮的濃度為：5:5、4:6、3:7、2:8，Sephadex LH-20 凝膠柱層析的洗脫劑為丙酮；而李揚硅膠層析梯度洗脫時正己烷：丙酮的濃度為：1:1、1:3 和純丙酮，Sephadex LH-20 凝膠柱層析的洗脫劑為氯仿-甲醇。李揚還對Sephadex LH-20 凝膠柱層析的工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，確定的最佳分離條件為：流速30 s/滴、填料高度70 cm、進(jìn)樣濃度40 mg/mL。

2.3 反相高效制備液相色譜法（RP-HPLC）

高效液相色譜法（HPLC）是在經(jīng)典液相色譜法和氣相色譜法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新型分離分析技術(shù)[58]。根據(jù)固定相和流動相極性的強(qiáng)弱，可分為正相高效液相色譜法和反相高效液相色譜法，在正相高效液相色譜中，固定相的極性大于流動相的極性，而反相液相色譜正好與之相反，它的固定相極性小于流動相極性[59]。反相高效液相色譜法的應(yīng)用日益廣泛，在高效液相色譜法中占重要地位。學(xué)者常以C18為固定相[60-62]，以丙酮/水、乙腈/水或甲醇/水等為流動相，利用反相高效液相色譜法制備蘿卜硫素純品。

2.4 高速逆流色譜法（HSCCC）

2.5 半制備高效液相色譜法

半制備高效液相色譜是制備型液相色譜的一種，區(qū)別主要是流速以及色譜柱內(nèi)徑等的不同。張錦華等[31]認(rèn)為半制備HPLC 法純化和富集蘿卜硫素具有靈敏度高、分離效果好和回收率高等優(yōu)點，所得提取物雖純度略低但可通過優(yōu)化色譜條件和精確蘿卜硫素的收集時間來提高，較回收率低更易改進(jìn)。郭楠[67]對蘿卜硫素粗提取液過濾后采用半制備HPLC分離純化。以乙腈和水為流動相，進(jìn)行梯度洗脫，依據(jù)蘿卜硫素標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間對應(yīng)收集蘿卜硫素洗脫液，并以此為單元富集蘿卜硫素，洗脫液旋蒸至干得到蘿卜硫素純品。該法操作方便、高效快速，在生物、醫(yī)藥以及食品等領(lǐng)域都具有廣闊的應(yīng)用前景。

目前，以上幾種方法均已應(yīng)用在蘿卜硫素的純化中。大孔樹脂吸附法不使用有機(jī)溶劑，成本低，適合工業(yè)化生產(chǎn)，但缺點是純化的蘿卜硫素純度略低；硅膠柱層析法操作壓力低，成本較低，但一般需經(jīng)過多方法、反復(fù)多次操作才能獲得純度較高的產(chǎn)品；凝膠柱層析法選擇性高、干擾因素少、凝膠柱可循環(huán)利用，然而其分離時間較長；反相高效制備液相色譜法具有高速、高效、高靈敏度、色譜柱可反復(fù)使用、樣品易回收、純度高等的優(yōu)點，但相比于其他方法成本較高，不適合大規(guī)模生產(chǎn)；高速逆流色譜法不耗費色譜填料，樣品無需預(yù)處理且純度、回收率高，但同樣分離時間較長，且存在放大困難的問題；半制備高效液相色譜法操作方便、高效快速，具有靈敏度高、分離效果好、回收率高的優(yōu)勢，且工業(yè)型制備色譜可用于工業(yè)生產(chǎn)，但純化后樣品的純度相對較低。由此可見，每種方法都各有利弊，研究者可根據(jù)實際情況加以選擇，并通過試驗不斷優(yōu)化純化工藝，為蘿卜硫素的生產(chǎn)及應(yīng)用提供理論依據(jù)。

3 抗癌功能研究

癌癥是導(dǎo)致人類死亡的主要疾病之一，對人類的生命健康造成了嚴(yán)重的威脅，所以人們十分重視防癌抗癌的應(yīng)用研究。根據(jù)目前已有報道，經(jīng)常食用十字花科蔬菜可降低癌癥的發(fā)病率[68]。流行病研究也表明，經(jīng)常攝入十字花科蔬菜與患胰腺癌[69-73]、乳腺癌[74]、腎癌[75-76]、膀胱癌[77]、前列腺癌[78]、卵巢癌[79]的風(fēng)險成反比，這是因為十字花科蔬菜中富含硫代葡萄糖苷，經(jīng)黑芥子酶水解或腸道菌群水解后產(chǎn)生蘿卜硫素。蘿卜硫素是蔬菜中具有抗癌能力的天然活性物質(zhì)之一，具有抑制癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)解毒酶、細(xì)胞周期停滯和凋亡的能力[80-81]，如在Huang 等[82]發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素可以通過靶向miR200c/ZEB1 軸逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化來抑制膀胱癌細(xì)胞的侵襲（圖5）；Huang等[83]報道了蘿卜硫素對肝癌細(xì)胞的作用，研究表示蘿卜硫素可以阻斷肝癌細(xì)胞中MAKP7 這一信號通路，觸發(fā)HepG2 細(xì)胞的G2/M阻滯，降低肝癌HepG2 細(xì)胞的生存能力，且以劑量依賴的方式抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲（圖6）。

圖5 蘿卜硫素與人膀胱癌細(xì)胞miR-200c/ZEB1 信號通路之間關(guān)系的示意圖[82]Fig.5 Schematic representation of the relationship between sulforaphane and miR-200c/ZEB1 signaling pathway in human bladder cancer cells[82]

圖6 Transwell 分析顯示蘿卜硫素抑制HepG2細(xì)胞的侵襲[83]Fig.6 Transwell assay showing that sulforaphane inhibits the invasion of the HepG2 cells[83]

多個研究表明，蘿卜硫素可通過不同機(jī)制對多種類型癌癥發(fā)揮治療作用。Zhu 等[84]在靶向GSK3β的miR-19（一種關(guān)鍵的致癌miRNA）介導(dǎo)蘿卜硫素抑制肺癌干細(xì)胞的研究中報道了蘿卜硫素可以通過抑制miR-19 和Wnt/β-連環(huán)蛋白途徑對肺癌干細(xì)胞有抑制作用；Kiani 等[85]對花椰菜芽中提取的不同濃度的蘿卜硫素對正常和胃癌細(xì)胞系中CDX1/2 以及miRNA-9 和miRNA-326 的生存力、死亡模式和表達(dá)變化的影響進(jìn)行了評估，結(jié)果顯示，在不同濃度的蘿卜硫素下，觀察到胃癌細(xì)胞系（AGS 和MKN45）中CDX1、CDX2、miR-9 和miR-326 的表達(dá)發(fā)生顯著變化，這可能是蘿卜硫素在特定劑量下影響胃癌細(xì)胞系，并通過改變CDX1、CDX2、miR-9 和miR-326的表達(dá)來改變其增值率；對于結(jié)直腸癌，蘿卜硫素也有較好的抑制作用，Gwon 等[86]報道了相關(guān)研究，結(jié)果表明，蘿卜硫素可以通過Nrf2 和p53 軸之間的串?dāng)_影響結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和線粒體功能；Burnett等[87]還將蘿卜硫素與紫杉烷聯(lián)合使用，發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，紫杉烷或多西他賽治療在增加TNBC 細(xì)胞系中IL-6 的同時也豐富了乳腺癌干細(xì)胞，而加入蘿卜硫素不僅顯著增強(qiáng)了對大塊腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性，還大大抑制了乳腺癌干細(xì)胞的擴(kuò)張。除此之外，蘿卜硫素還被證實對胰腺癌[88]、宮頸癌[89]、前列腺癌[90]等癌細(xì)胞均有抑制作用。

4 結(jié)語與展望

蘿卜硫素已被證明可以抑制癌細(xì)胞增殖、引起癌細(xì)胞凋亡，對于多種癌癥細(xì)胞的抑制作用都有了相關(guān)報道，這引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，而蘿卜硫素的提取純化工藝就顯得尤為重要，目前仍存在一些問題有待進(jìn)一步探究：抑制西蘭花中上皮硫特異蛋白（ESP）活性可以提高蘿卜硫素得率，如何保證在抑制ESP 活性的同時保持自身黑芥子酶活性不受影響；針對添加外源芥子酶提取蘿卜硫素的研究，如何準(zhǔn)確確定酶的添加量，使酶解理化環(huán)境保持在蘿卜硫素最佳生成條件下；提取蘿卜硫素時，提取效果較好的二氯甲烷和乙酸乙酯對人體有毒性作用；要想得到更高純度的蘿卜硫素，還需將不同的純化方法相結(jié)合，但步驟過多可能會導(dǎo)致蘿卜硫素的損失。雖然蘿卜硫素對癌細(xì)胞有抑制作用，但在實際應(yīng)用中仍存在一些困難，如對于胰腺癌患者，伴隨著胰腺癌病情的發(fā)展，會產(chǎn)生食欲不振、惡心嘔吐等問題，在服用了西蘭花芽粉膠囊后會增加消化負(fù)擔(dān)[91]，一些患者攝入膠囊后可能會因為西蘭花味而惡心嘔吐，影響患者的身體健康，不利于癌癥的治療。

未來仍需不斷探索和優(yōu)化蘿卜硫素提取純化工藝，在蘿卜硫素防癌保健品及抗癌藥品上研發(fā)新的種類，以滿足市場多樣化的需求。今后可對不同環(huán)境中ESP 和黑芥子酶的活性進(jìn)行深入研究，在外源酶酶液的制備方法、濃度大小以及酶活性強(qiáng)弱等方面開展相關(guān)試驗，為硫代葡萄糖苷水解為蘿卜硫素提供最佳條件。乙醇成本較低，且毒性低，更利于蘿卜硫素在人體的應(yīng)用，今后可重點選擇以乙醇為萃取溶劑進(jìn)行研究，并不斷優(yōu)化工藝以提高提取率。在蘿卜硫素完整的生產(chǎn)工藝中，可對如何精簡步驟及減少損失進(jìn)行探索研究，以便投入工業(yè)化生產(chǎn)。對于以西蘭花為原料，因西蘭花味而影響治療效果的藥品，可在制備過程中去除西蘭花味或添加風(fēng)味物質(zhì)掩蓋西蘭花味。總之，在制備蘿卜硫素保健品或藥品時，需做到綠色、環(huán)保、無毒，并且滿足蘿卜硫素純度高、副作用小、易被消費者接受的要求，從而更好地應(yīng)用于人體的防癌抗癌當(dāng)中。