苦丁茶冬青多糖對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)和抗氧化作用

舒 翔，程 明，王 輝，朱紅英，譚樂和，顧文亮，朱科學(xué),

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所，海南萬寧 571533；2.國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作江蘇中心，江蘇蘇州 215011；3.海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，海南?？?570100；4.海南省特色熱帶作物適宜性加工與品質(zhì)控制重點實驗室，海南萬寧 571533）

多糖是一類廣泛存在于植物、動物、海洋生物和微生物中的生物活性大分子物質(zhì)。近年來，多糖的免疫調(diào)節(jié)功能受到廣泛關(guān)注。多糖可通過調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞亞群、激活免疫細(xì)胞、誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子和活化補體等多途徑發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用[1]。脾臟作為機體免疫應(yīng)答的重要場所，含有大量的T 淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞，同時刺激或選擇性刺激T、B 細(xì)胞分裂增殖并促進(jìn)相關(guān)細(xì)胞因子和抗體的分泌，直接反映機體的免疫調(diào)節(jié)能力。例如：蛹蟲草胞外多糖可提高免疫器官指數(shù)、促進(jìn)T、B 細(xì)胞增殖和增加免疫球蛋白G、免疫球蛋白A、免疫球蛋白M、腫瘤壞死因子-α、白介素-6、白介素-2 和干擾素-γ等的分泌，具有顯著的免疫調(diào)節(jié)效果[2]；庫爾勒香梨粗多糖能提高小鼠血清白介素-2 和干擾素-γ水平、增加實驗動物脾臟和胸腺等免疫器官指數(shù)，提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力等[3]；苦瓜多糖可通過提升溶血素水平、提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力和刺激小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的增殖，提高免疫抑制小鼠的免疫功能[4]。

苦丁茶冬青（Ilex kudingchaC.J. Tseng）是冬青科冬青屬（Ilex aquifoliumL.）常綠喬木，其茶葉中富含多糖、多酚、多種必需氨基酸、維生素、微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)，具有抑菌、降血壓、降血糖、降血脂等藥用價值，且安全無毒[5-8]。許實波等[9]開展了苦丁茶水提物的毒理學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)苦丁茶水提物的最大耐受量為168 g/kg，屬于無毒性級，服用安全。

苦丁茶冬青多糖是一類含α-吡喃糖環(huán)結(jié)構(gòu)的高分子化合物，具有抑制特定異常細(xì)胞增殖和分化的功效，極具開發(fā)前景[10-11]。韋曉潔等[12]研究了超臨界CO2萃取參數(shù)對苦丁茶多糖得率的影響，并優(yōu)化了其工藝條件。于淑池等[13]研究表明海南苦丁茶多糖可降低糖尿病小鼠的血糖，具有降血糖功效。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)苦丁茶冬青萃取物具有調(diào)節(jié)血脂和高膽固醇血癥的功效[14]，苦丁茶冬青多糖具有較強的體外抗氧化活性等生物活性[11]。為進(jìn)一步探索苦丁茶冬青多糖的免疫調(diào)節(jié)效果，本研究以苦丁茶冬青多糖為實驗材料，以小鼠脾臟淋巴細(xì)胞為研究對象，分析苦丁茶冬青多糖對體外培養(yǎng)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的增殖作用，并通過測定超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase, SOD）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity, T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase, CAT）活力等抗氧化酶活性，檢測腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、干 擾 素-γ（interferon-γ,IFN-γ）和白介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）等細(xì)胞因子的分泌水平，研究苦丁茶冬青多糖對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)和抗氧化作用，為海南苦丁茶資源的高值化開發(fā)和利用提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦丁茶冬青多糖 苦丁茶冬青原料由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所（興隆熱帶植物園）提供，多糖制備參照團(tuán)隊建立的方法[11]，通過熱水浸提和終濃度為20%、40%、60%和80%的四種不同濃度乙醇分級沉淀以制備苦丁茶冬青多糖，其主要由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖醛酸等組成，其相對分子質(zhì)量為440.44 kDa，純度為87.59%[15]。

BALB/c 雄性小鼠 6 周，體重20～30 g，北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0008；胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司；無水乙醇 西隴科學(xué)股份有限公司；臺盼藍(lán)染料 美國Sigma 公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基 美國Gibco 公司；CCK-8 試劑盒、SOD、T-AOC、GSHPx、CAT 和MDA 檢測試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；NO 檢測試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；TNF-α、IFN-γ和IL-1β細(xì)胞因子ELISA 檢測試劑盒 武漢博士德生物工程有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

3110 系列二氧化碳培養(yǎng)箱 Thermo Fisher Scientific 公司；奧林巴斯CKX41 倒置顯微鏡 Olympus公司；Varioskan Flash 全波長多功能酶標(biāo)儀 Thermo Fisher Scientific 公司；SW-CJ-2FD 凈化工作臺蘇州凈化設(shè)備有限公司；3K15 通用型臺式高速冷凍離心機 Sigma 公司；ZDX-35B 壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠；Milli-Q50 超純水系統(tǒng)Millipore 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的制備 小鼠脫椎處理，75%醫(yī)用酒精浸泡后取其脾臟，參照文獻(xiàn)[16]的方法制備脾淋巴細(xì)胞懸液，將收集的脾淋巴細(xì)胞用RPMI-1640 培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2無菌條件培養(yǎng)2 h，收集未貼壁的細(xì)胞懸液即為脾臟淋巴細(xì)胞。采用臺盼藍(lán)細(xì)胞活性染料對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，利用活細(xì)胞數(shù)大于95%的脾臟淋巴細(xì)胞懸液開展研究和分析。

1.2.2 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖的檢測 參照文獻(xiàn)[16]的方法將收集到的脾臟淋巴細(xì)胞懸液調(diào)整濃度至5×106個/mL，以190 μL/孔接種至96 孔板，再添加10 μL 不同濃度的苦丁茶冬青多糖溶液至RPMI-1640 培養(yǎng)基，分別調(diào)節(jié)最終作用濃度為20、40、80和160 μg/mL，設(shè)計一組僅加入10 μL RPMI-1640的培養(yǎng)基為空白對照組，每組設(shè)6 個復(fù)孔，試驗平行3 次，37 ℃、5% CO2條件下預(yù)孵育48 h。按照CCK-8試劑盒操作說明，每孔加入20 μL CCK-8 溶液繼續(xù)孵育4 h。在450 nm 處通過全波長多功能酶標(biāo)儀檢測吸光度，測定苦丁茶冬青多糖對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響。

1.2.3 抗氧化活性的測定 按1.2.2 節(jié)方法培養(yǎng)后離心收集細(xì)胞，按照SOD、T-AOC、GSH-Px、CAT 和MDA 檢測試劑盒說明測定，并計算SOD、T-AOC、GSH-Px 和CAT 等抗氧化酶活力以及MDA 含量。

1.2.4 NO 含量的測定 按照NO 檢測試劑盒的操作說明，540 nm 處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=0.0095x+0.0482，R2=0.9963)，分析苦丁茶冬青多糖對脾臟淋巴細(xì)胞NO 含量的影響。

1.2.5 細(xì)胞因子分泌水平的測定 參考Li 等[17]實驗方法，吸取收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，參照ELISA 試劑盒說明書，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（TNF-α：y=0.001x+0.0769，R2=0.9973；IFN-γ：y=0.0012x+0.2183，R2=0.9879；IL-1β：y=0.0033x+0.1259，R2=0.9989），分析小鼠脾臟淋巴細(xì)胞上清液中TNF-α、IFN-γ和IL-1β細(xì)胞因子的分泌水平。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計通過SPSS Statistics 17.0 分析軟件進(jìn)行，組間兩兩比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用ANOVA 方差分析，結(jié)果以±S 表示。P＜0.05時，表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦丁茶冬青多糖對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響

如圖1 所示，與空白對照組（0.31）相比，20 μg/mL的低濃度苦丁茶冬青多糖處理后小鼠脾臟淋巴細(xì)胞溶液的吸光度為0.34，作用效果無顯著性差異（P＞0.05）；當(dāng)濃度為40 μg/mL 時，吸光度值為0.36，與空白對照組相比具有顯著性差異（P＜0.05）；在80和160 μg/mL 濃度時，吸光度值分別為0.38 和0.41，與對照組相比，脾臟淋巴細(xì)胞的增殖作用具有極顯著差異（P＜0.01）。結(jié)果表明，苦丁茶冬青多糖可能直接作用于脾臟淋巴細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞的增殖功能，提高機體的免疫力。

圖1 苦丁茶冬青多糖對體外培養(yǎng)脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of polysaccharide of Ilex kudingcha C.J. Tseng on the proliferation of spleen lymphocyte in vitro

CCK-8 法是一種最常用的淋巴細(xì)胞增殖檢測方法[18]。李芳宇等[19]采用CCK-8 法檢測細(xì)胞的增殖情況，發(fā)現(xiàn)人參根提取物能顯著增強小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的增殖能力。龐敏等[20]利用CCK-8 法探討術(shù)芩總多糖對免疫抑制小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示濃度為0.1 μg/mL 的術(shù)芩總多糖作用小鼠脾臟淋巴細(xì)胞12 h，細(xì)胞的增殖能力最強。孫延斌等[21]發(fā)現(xiàn)苦丁茶可促進(jìn)免疫功能低下小鼠抗體生成水平和巨噬細(xì)胞的吞噬能力，調(diào)節(jié)機體免疫功能。本研究表明，苦丁茶冬青多糖能顯著提高小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的體外增殖能力（P＜0.05），推斷其可能通過增強小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力以發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用。

2.2 苦丁茶冬青多糖對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞抗氧化能力的影響

由圖2 可知，空白對照組SOD、T-AOC、GSH-Px和CAT 活性分別為0.99 U/mg 蛋白、0.21 mmol/mg蛋白、208.06 mU/mg 蛋白和416.83 U/mg 蛋白?？喽〔瓒喽嗵菨舛仍?0～160 μg/mL 范圍內(nèi)，SOD、T-AOC、GSH-Px 和CAT 活力隨濃度的增加而升高，當(dāng)濃度為80 和160 μg/mL 時，與對照組相比，抗氧化酶活力極顯著增強（P＜0.01）；其中，當(dāng)濃度為160 μg/mL 時，SOD、T-AOC、GSH-Px 和CAT 活性分別提高至4.54 U/mg 蛋白、1.06 mmol/mg 蛋白、799.01 mU/mg 蛋白和806.85 U/mg 蛋白。

圖2 苦丁茶冬青多糖對體外培養(yǎng)脾臟淋巴細(xì)胞抗氧化酶活力的影響Fig.2 Effect of polysaccharide of Ilex kudingcha C.J. Tseng on antioxidant enzyme activities in spleen lymphocytes in vitro

圖3結(jié)果顯示，空白對照組MDA 含量為43.29 μmol/mg 蛋白，苦丁茶冬青多糖濃度為20 μg/mL時，MDA 含量下降至30.76 μmol/mg 蛋白，具有顯著降低效果（P＜0.05）；在40、80 和160 μg/mL 濃度時，MDA 含量分別降到18.67、13.44 和13.022 μmol/mg蛋白，具有極顯著降低效果（P＜0.01）。

圖3 苦丁茶冬青多糖對體外培養(yǎng)脾臟淋巴細(xì)胞抗氧化產(chǎn)物MDA 含量的影響Fig.3 Effect of polysaccharide of Ilex kudingcha C.J. Tseng on MDA production in spleen lymphocytes in vitro

機體抗氧化系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)密不可分，當(dāng)機體氧化自由基的產(chǎn)生大于自身自由基的清除時，就會造成氧化損傷，誘導(dǎo)機體保護(hù)性免疫反應(yīng)。SOD、GSH-Px 和CAT 等是機體防御氧化損傷的關(guān)鍵酶，在維持體內(nèi)的氧化與自由基動態(tài)平衡中發(fā)揮著重要作用[22]。丙二醛（MDA）是衡量機體自由基代謝程度的重要指標(biāo)[23]。華巖[24]的研究結(jié)果顯示，補充黃精多糖的運動組MDA 含量明顯降低，而SOD、GSHPx 活性相較于運動組明顯升高，表明黃精多糖能改善受損細(xì)胞膜功能，降低大強度運動導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化損傷。團(tuán)隊前期研究發(fā)現(xiàn)苦丁茶多糖具有較強的DPPH 自由基和OH-自由基清除能力，本研究發(fā)現(xiàn)，苦丁茶冬青多糖對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞SOD、T-AOC、GSH-Px 和CAT 活力具有顯著增強作用，并顯著降低MDA 含量，該結(jié)果表明苦丁茶冬青多糖能夠提高抗氧化酶活性、抑制細(xì)胞的氧化損傷水平，調(diào)節(jié)細(xì)胞的免疫功能。

2.3 苦丁茶冬青多糖對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞NO 分泌水平的影響

如圖4 所示，苦丁茶冬青多糖能刺激脾臟淋巴細(xì)胞分泌NO，與空白對照組相比，苦丁茶冬青多糖濃度為20、40、80、160 μg/mL 時可分別提高小鼠脾臟淋巴細(xì)胞NO 含量1.38 倍、1.62 倍、2.31 倍和4.04倍。濃度高于40 μg/mL 時，NO 分泌效果呈顯著增強趨勢（P＜0.05）。

圖4 苦丁茶冬青多糖對體外培養(yǎng)脾臟淋巴細(xì)胞NO 分泌水平的影響Fig.4 Effect of polysaccharide of Ilex kudingcha C.J. Tseng on NO production in spleen lymphocytes in vitro

NO 被認(rèn)為是一種細(xì)胞神經(jīng)遞質(zhì)，能發(fā)揮非特異性免疫反應(yīng)，可調(diào)節(jié)多種免疫功能，包括T 淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和NK 細(xì)胞以及炎性細(xì)胞的生長和凋亡等[25]。研究表明，金線蓮多糖[26]、蕨麻多糖[27]和金櫻子多糖[28]可促進(jìn)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分泌NO；山豆根多糖能誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生NO，并通過NO 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能[29]。本研究結(jié)果表明苦丁茶冬青多糖對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分泌NO 具有較強的促進(jìn)作用，有助于增強其免疫調(diào)節(jié)能力。

2.4 苦丁茶冬青多糖對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響

如表1 所示，空白對照組TNF-α、IFN-γ和IL-1β的含量分別為475.75、41.85 和42.31 pg/mL。經(jīng)苦丁茶冬青多糖處理后，脾臟淋巴細(xì)胞TNF-α、IFN-γ和IL-1β等炎性細(xì)胞因子分泌水平均呈現(xiàn)增加趨勢，且呈濃度依賴性。在濃度為20 μg/mL 時，苦丁茶冬青多糖對細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-1β均無顯著的促進(jìn)作用（P＞0.05）；在濃度為160 μg/mL 時，苦丁茶冬青多糖對TNF-α、IFN-γ和IL-1β的分泌水平極顯著增加（P＜0.01），分別達(dá)到610.91、129.33 和84.16 pg/mL。推斷苦丁茶冬青多糖能夠促進(jìn)脾臟淋巴細(xì)胞的增殖與分化，進(jìn)而通過促進(jìn)脾臟淋巴細(xì)胞分泌TNF-α、IFN-γ和IL-1β以發(fā)揮免疫增強作用。脾臟淋巴細(xì)胞中含大量的T 細(xì)胞，T 細(xì)胞被活化后會分泌TNF-α、IFN-γ和IL-1β等多種細(xì)胞因子，而當(dāng)這些細(xì)胞因子分泌量上升時，亦促進(jìn)T 細(xì)胞激活[30-31]。T 細(xì)胞主要分為CD4＋和CD8＋亞群，其中，CD4＋細(xì)胞又分為Th1 及Th2 亞群，Th1 細(xì)胞主要分泌IFN-γ，Th2 細(xì)胞主要分泌IL-1β等細(xì)胞因子，參與細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)[32]。大量研究發(fā)現(xiàn)多糖具有調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌的功能，如太子參參須多糖[33]能夠促進(jìn)免疫功能低下小鼠分泌IL-2 和IFN-γ；懸鉤子木多糖[34]可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α；金針菇子實體多糖[35]可以提高IL-1β、IL-6 和TNF-α的分泌水平。本研究結(jié)果表明，苦丁茶冬青多糖可能通過調(diào)節(jié)Th1/Th2 平衡，促進(jìn)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞TNF-α、IFN-γ和IL-1β的分泌，通過誘導(dǎo)細(xì)胞因子的分泌發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用。

表1 苦丁茶冬青多糖對體外培養(yǎng)脾臟淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響Table 1 Effect of polysaccharide of Ilex kudingcha C.J. Tseng on cytokine secretion in spleen lymphocytes in vitro

3 結(jié)論

本文通過分析苦丁茶冬青多糖對體外培養(yǎng)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖、抗氧化和細(xì)胞因子分泌的影響，脾臟淋巴細(xì)胞的增殖分別為0.34、0.36、0.38 和0.41；濃度為160 μg/mL 時，SOD、T-AOC、GSH-Px 和CAT活性分別提高至4.54 U/mg 蛋白、1.06 mmol/mg蛋白、799.01 mU/mg 蛋白和806.85 U/mg 蛋白，MDA含量降至13.022 μmol/mg 蛋白；TNF-α、IFN-γ和IL-1β的含量分別從475.75、41.85 和42.31 pg/mL增加到610.91、129.33 和84.16 pg/mL。研究表明苦丁茶冬青多糖能夠提高小鼠脾臟淋巴細(xì)胞免疫活性，其作用機制可能是通過促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖、增強細(xì)胞抗氧化能力及誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子分泌等途徑，發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用。研究結(jié)果可為苦丁茶冬青及同類資源的營養(yǎng)健康產(chǎn)品開發(fā)和應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)，在未來研究中，將從免疫調(diào)節(jié)通路和分子機制進(jìn)行深入研究和探討。