不同加工方式對熟制克氏原螯蝦冷藏期間品質(zhì)的影響

孔金花，溫麗敏，諸永志, ，葛慶豐 ，卞 歡，閆 征，徐為民

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京 210014；2.揚州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚州 225127）

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii），又名小龍蝦、紅螯蝦、淡水克氏原螯蝦等，為螯蝦科淡水螯蝦屬淡水經(jīng)濟蝦類[1]。因其味道鮮美，風(fēng)味獨特，營養(yǎng)價值高，深受消費者喜愛[2]?？耸显r營養(yǎng)豐富，水分含量高，內(nèi)源酶活性強，且由于其生活環(huán)境導(dǎo)致自身微生物繁殖速度加快[3]，因此其在加工過程中易腐敗變質(zhì)，極大降低了克氏原螯蝦產(chǎn)品的品質(zhì)和商用價值。目前企業(yè)主要通過冷凍形式銷售克氏原螯蝦，不僅銷售成本高，同時產(chǎn)品復(fù)熱后品質(zhì)下降。因此開發(fā)出美味健康的即食克氏原螯蝦產(chǎn)品，對促進(jìn)克氏原螯蝦企業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

殺菌是即食克氏原螯蝦產(chǎn)品加工過程中的重要環(huán)節(jié)，而熱殺菌是目前應(yīng)用最廣泛的處理方式。熱殺菌技術(shù)是食品加工過程中常用的滅菌方法，能有效減少肉制品中的微生物數(shù)[4]。當(dāng)殺菌溫度超過120 ℃時就能殺滅包括耐熱性芽孢桿菌在內(nèi)的絕大部分微生物。因此熱殺菌通過熱力學(xué)作用殺滅克氏原螯蝦的微生物，提高了克氏原螯蝦產(chǎn)品的安全性，延長了產(chǎn)品的貨架期[5]，可有效提高市場需求。目前，克氏原螯蝦生產(chǎn)企業(yè)對克氏原螯蝦的主要加工方式是100 ℃煮沸5 min。為維持蝦肉品質(zhì)，企業(yè)未對克氏原螯蝦產(chǎn)品進(jìn)行后殺菌，因此為延長貨架期必須將產(chǎn)品冷凍存儲，消費者購買后需要復(fù)熱才可食用。為延長產(chǎn)品的貨架期，鄭煜飛等[6]將克氏原螯蝦煮3 min后115 ℃條件下殺菌5 min。但由于水產(chǎn)品肌肉纖維較禽肉在高溫下更易發(fā)生斷裂，因此二次熱處理會導(dǎo)致蝦肉軟爛品質(zhì)下降[7]。采用熟制殺菌一步到位的工藝，既可以通過加熱起到熟制作用，又有殺菌效果，同時可減少因反復(fù)熱處理導(dǎo)致的蝦肉軟爛。魯淑彥等[8]研究發(fā)現(xiàn)一步殺菌工藝下南美白對蝦的硬度和咀嚼性顯著優(yōu)于115 ℃、5 min 二次殺菌條件下的蝦肉。因此探究出既能延長即食克氏原螯蝦產(chǎn)品貨架期又能保持克氏原螯蝦產(chǎn)品品質(zhì)的加工工藝是克氏原螯蝦企業(yè)亟需解決的問題。

本文以克氏原螯蝦為研究對象，在不同熱加工方式下，分析無殺菌（100 ℃、5 min）、二次殺菌（100 ℃、5 min 后121 ℃、10 min）與殺菌一步到位工藝（110 ℃、10 min）對熟制樣品貯藏期間品質(zhì)的影響。通過pH、質(zhì)構(gòu)分析、總揮發(fā)性鹽基氮、硫代巴比妥酸值、持水率、肌原纖維蛋白特性、菌落總數(shù)等指標(biāo)，并結(jié)合掃描電鏡觀察，綜合評價不同熱加工方式對熟制克氏原螯蝦冷藏期間品質(zhì)的影響，探討出適宜的熱加工方式，以期為即食克氏原螯蝦的生產(chǎn)加工提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

克氏原螯蝦 購于南京集慶門水產(chǎn)批發(fā)市場，剔除死蝦后取鮮活克氏原螯蝦，重量為（25±3.00）g。磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉（分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；鹽酸（分析純） 南京化學(xué)試劑股份有限公司；平板計數(shù)瓊脂 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA） 廣東光華科技股份有限公司；硫代巴比妥酸（TBA） 上海麥克林生化科技有限公司；二硝基苯甲酸（DTNB） 上海士鋒生物科技有限公司；25%戊二醛固定液 北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；牛血清蛋白 源葉生物；經(jīng)典彩色預(yù)染蛋白Marker 美國賽默飛；其他試劑均為分析純。

HD-240L 水神次氯酸發(fā)生器 旺旺集團有限公司；KQ-300 超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；DGG-9023A 電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司；HH-8 數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；CR-400 色度儀 上海亞榮生化儀器廠；FE28 pH 計 梅特勒-托利多儀器有限公司；ZEALWAY反壓殺菌鍋 致微儀器有限公司；PTX-FA210S 分析天平 福州華志科學(xué)儀器有限公司；TMS-TOUCH質(zhì)構(gòu)儀 美國FTC 公司IKAT25 數(shù)顯勻漿機 德國IKA；UV-6100 紫外可見分光光度計 上海美譜達(dá)儀器有限公司；Gen5 全波長酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司；LS-55 熒光磷光發(fā)光分光光度計 美國Perkin Elmer；5810R 離心機 Eppendorf 艾本德；Tanon1800 凝膠成像儀 廣州譽維生物科技儀器有限公司；EVO-LS 掃描電子顯微鏡 卡爾蔡司股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 即食克氏原螯蝦加工工藝 工藝流程[9]：鮮活克氏原螯蝦→微酸性電解水清洗→超聲輔助腌制→鋁箔袋真空包裝→熱加工處理→成品。

操作要點：將克氏原螯蝦使用60 mg/L 微酸性電解水清洗處理50 min 后，進(jìn)行超聲波輔助腌制，超聲波功率210 W，腌制液氯化鈉含量為17 g/100 mL，腌制時間為30 min。腌制后的小龍蝦使用鋁箔真空袋（厚度為30 絲）進(jìn)行真空包裝，最后將包裝好的小龍蝦使用反壓殺菌鍋進(jìn)行熟化、殺菌處理。

1.2.2 不同熟化、殺菌處理克氏原螯蝦的貯藏條件克氏原螯蝦的加工方式分為3 種[10]：熟制無殺菌：100 ℃、5 min，壓力為0 MPa（記為100 ℃）；熟制后殺菌：100 ℃、5 min 后121 ℃、5 min，壓力為0.18 MPa（記為121 ℃）；熟制殺菌一步到位：110 ℃、10 min，壓力為0.13 MPa（記為110 ℃）。

熟制無殺菌工藝下的克氏原螯蝦產(chǎn)品取10 袋4 ℃貯藏，貯藏0、3、5、7 d 進(jìn)行各項指標(biāo)的檢測（貨架期終點后不再檢測）[11]；熟制后殺菌、熟制殺菌一步到位工藝下的克氏原螯蝦分別取30 袋進(jìn)行4 ℃貯藏，貯藏0、3、5、7、14、21、28、35 d 進(jìn)行各項指標(biāo)的檢測。

1.2.3 理化指標(biāo)測定

1.2.3.1 pH 參照GB 5009.237-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中pH 值的測定》[12]。

1.2.3.2 質(zhì)構(gòu)分析 將克氏原螯蝦尾部第2 節(jié)肌肉切成大小約1 cm×1 cm×0.7 cm 的肉塊，使用質(zhì)構(gòu)儀對肉塊進(jìn)行質(zhì)構(gòu)測定，包括硬度、彈性、咀嚼性等各項指標(biāo)。測試參數(shù)為：測試時間間隔為2 s，測試速率為180 mm/min，型變量50%，探頭回升樣品高度12 mm。每個樣品重復(fù)檢測10 次，取平均值[13]。

1.2.3.3 總揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N） 參照GB 5009.228-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》中的微量擴散法[14]。

1.2.3.4 硫代巴比妥酸反應(yīng)物（TBARS）值測定 參照GB 5009.181-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中丙二醛的測定》中的分光光度法測定[15]。

1.2.3.5 持水率 將克氏原螯蝦整條蝦尾去殼后稱重，用濾紙包裹后在4 ℃條件下離心10 min，離心機轉(zhuǎn)速為10000 r/min，對離心后的蝦肉稱重[16]。離心損失以蝦肉減少質(zhì)量占原始質(zhì)量的百分比。計算公式：

式中：X1為離心損失，%；m1為離心前的質(zhì)量，g；m2為離心后的質(zhì)量，g。

1.2.4 肌原纖維蛋白特性分析

1.2.4.1 肌原纖維蛋白提取 參考Shi 等[17]的方法提取肌原纖維蛋白并略作修改。稱取5 g 蝦肉，加入20 mL 磷酸緩沖液（pH7.0），隨后進(jìn)行勻漿冰浴處理（60 s），勻漿速度為10000 r/min。勻漿液離心15 min后棄去上清液后取沉淀。重復(fù)上述步驟2 次后，加入20 mL 氯化鈉緩沖液（pH6.25）并勻漿處理。用4 層紗布過濾，所得濾液離心，棄去上清液，沉淀即為肌原纖維蛋白。沉淀溶解于磷酸緩沖液（pH6.25），即為肌原纖維蛋白溶液，調(diào)節(jié)蛋白濃度為1 mg/mL 待測。蛋白濃度采用雙縮脲法進(jìn)行檢測。

1.2.4.2 巰基含量測定 參考Zhang 等[18]的方法并略作修改。取1.2.4.1 中的1 mL 肌原纖維蛋白溶液與9 mL 的50 mmol/L PBS（含8 mol/L 尿素，10 mmol/L EDTA，0.6 mol/L KCl，pH7.0）混勻。向混合溶液中加入0.4 mL 的10 mmol/L DTNB，40 ℃下孵育25 min，在412 nm 處檢測樣品吸光度。計算公式：

式中：X1為巰基含量，mmoL/g；A412為吸光值；1.36×104為摩爾消光系數(shù)，（mol/L）-1cm-1。

1.2.4.3 熒光強度測定 將1.2.4.1 中的肌原纖維蛋白溶液（1 mg/mL）采用熒光光度計進(jìn)行熒光光譜掃描，激發(fā)波長為280 nm，發(fā)射波長范圍為290～420 nm，激發(fā)和狹縫寬度為3.0 nm, 掃描速度300 nm/min[19]。

1.2.4.4 SDS-PAGE 凝膠電泳分析 參照祁雪兒等[20]的方法進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳分析。取1.2.4.1中的肌原纖維蛋白溶液（1 mg/mL）25 μL，加入100 μL 的上樣緩沖液，95 ℃滅酶5 min。取上清液進(jìn)行電泳分析，蛋白Mark（10～180 kDa）作為對照，向泳槽中緩慢倒入電泳緩沖液，先在電壓80 V 的條件下跑30 min，后在電壓120 V 條件下跑60 min。結(jié)束后，用考馬斯藍(lán)快速染色液染色15 min，脫色后進(jìn)行成像分析。

1.2.5 菌落總數(shù)的測定 參照GB 4789.2-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》[21]。

1.2.6 微觀結(jié)構(gòu)觀察 將蝦尾肉切成1 mm×1 mm×3 mm 大小的長方體，放入2.5%的戊二醛溶液中固定24 h。將固定后的樣品用磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH7.2）洗滌3 次，并用體積分?jǐn)?shù)為50%、70%、80%、90%乙醇溶液逐漸脫水（每個階段1 h）[22]。將樣品進(jìn)行冷凍干燥，然后切片噴金，進(jìn)行掃描電鏡觀察，放大倍數(shù)為100 倍。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗中質(zhì)構(gòu)指標(biāo)檢測進(jìn)10 次重復(fù)，其他指標(biāo)均進(jìn)行3 次重復(fù)。檢測結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Excel 軟件和SPSS Statistics 16.0 軟件對各個試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用單因素ANOVA 進(jìn)行差異性比較，P＜0.05 表示有顯著性差異；各數(shù)據(jù)均采用Origin 8.5 軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 即食克氏原螯蝦4 ℃冷藏期間pH 的變化

水產(chǎn)品在死亡后體內(nèi)糖原轉(zhuǎn)化為乳酸等生化反應(yīng)會影響其pH，因而pH 是評價蝦肉品質(zhì)的重要指標(biāo)。不同加工方式下克氏原螯蝦在冷藏過程中的pH 變化見圖1。在冷藏0 d 時，不同加工方式下pH差異顯著（P＜0.05），且處理溫度越高pH 越大?？赡苡捎诩庸囟仍礁?，克氏原螯蝦蛋白質(zhì)變性后氨基酸殘基暴露，導(dǎo)致pH 越高。隨著儲存時間的增加，克氏原螯蝦的pH 均持續(xù)增加，呈弱堿性狀態(tài)[23]。在貨架期終點時，100、110 和121 ℃條件下處理的克氏原螯蝦pH 分別為8.28±0.03、8.47±0.02、8.35±0.05。pH 的增加可能是由于微生物數(shù)量增殖后，三甲胺和組胺等堿性化合物的產(chǎn)生所致。鄭靜靜等[24]研究熟制克氏原螯蝦冷凍貯藏期間pH 為弱堿性且呈上升趨勢，與本文研究結(jié)論一致。在儲存過程中，121 ℃組的pH 增幅最小，其次是110 ℃處理組，這可能是因為加工溫度越高，微生物殘余越少，由微生物繁殖生成的堿性化合物越少。

圖1 不同加工方式對克氏原螯蝦冷藏期間pH 的影響Fig.1 Changes of pH value in crayfish with different processing methods during refrigerated storage

2.2 克氏原螯蝦4 ℃冷藏期間質(zhì)構(gòu)的變化

水產(chǎn)品在加工過程中質(zhì)構(gòu)會發(fā)生顯著變化，質(zhì)構(gòu)的變化會直接影響水產(chǎn)品的食用品質(zhì)和商用價值。圖2（A～B）顯示了克氏原螯蝦4 ℃冷藏期間不同加工方式下硬度和彈性的變化。由圖2A 可知，儲藏0 d 時，各處理組蝦肉硬度差異明顯（P＜0.05），且加熱溫度越高蝦肉硬度越低，這可能是因為處理溫度越高肌纖維受損程度越大，導(dǎo)致硬度下降。儲藏過程中，各處理組蝦肉的硬度隨儲藏時間的延長而降低。這主要是由于儲藏過程中，微生物的繁殖使蛋白質(zhì)水解，蝦肉組織結(jié)構(gòu)被破壞，蝦肉硬度下降[25]。

圖2 不同加工方式對克氏原螯蝦冷藏期間硬度（A）與彈性（B）的影響Fig.2 Changes of hardness (A) and springiness (B) in crayfish with different processing methods during refrigerated storage

由圖2B 可知，儲藏0 d 時，各處理組蝦肉彈性差異顯著（P＜0.05），其中110 ℃處理組蝦肉彈性值最高，為（3.15±0.03）mm，這可能是由于溫度上升，蝦肉肌動蛋白發(fā)生降解，肌球蛋白增加導(dǎo)致蝦肉彈性上升[26]。但是，溫度過高會造成蝦肉嚴(yán)重失水，蝦肉軟爛，導(dǎo)致蝦肉彈性和硬度顯著下降（P＜0.05）。因此，處理溫度121 ℃儲藏0 d 時蝦肉彈性顯著降低，為（2.64±0.03）mm。在儲藏期間，相同處理組蝦肉的彈性隨著儲藏時間的延長而降低，這一點與硬度變化趨勢一致。綜上所述，蝦肉彈性越高，Q 彈品質(zhì)越高，因此，110 ℃加工處理方式是最適宜的加工工藝。

2.3 克氏原螯蝦4 ℃冷藏期間TBARS 值的變化

脂質(zhì)氧化是影響水產(chǎn)品品質(zhì)的主要因素之一，其可影響水產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)、色澤、營養(yǎng)等品質(zhì)特性。硫代巴比妥酸值（TBARS）是目前用來評價食品脂質(zhì)氧化程度的通用指標(biāo)，用來表示脂肪氧化分解成二級氧化產(chǎn)物丙二醛的程度[27]?？耸显r4 ℃冷藏期間不同加工方式下TBARS 值見圖3。0 d 儲藏時，處理溫度越高TBARS 值越大，這是由于脂質(zhì)氧化程度與加工溫度呈正相關(guān)。在儲藏過程中，各處理組的TBARS 值隨著儲藏時間的延長顯著增加（P＜0.05），可以看出儲藏過程中脂質(zhì)氧化程度加深。儲藏7 d后，TBARS 值出現(xiàn)了下降趨勢?？赡苁怯捎诖渭壷|(zhì)氧化產(chǎn)物丙二醛極易與肉中蛋白質(zhì)、磷脂等化合物發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致TBARS 值下降[28]。向雅芳等[29]研究發(fā)現(xiàn)鱸魚加熱后在儲藏過程中TBARS 值出現(xiàn)了先升后降的情況，與本文的研究結(jié)論一致。

圖3 不同加工方式對克氏原螯蝦冷藏期間TBARS 值變化的影響Fig.3 Changes of TBARS in crayfish with different processing methods during refrigerated storage

2.4 克氏原螯蝦4 ℃冷藏期間保水性的變化

肉制品的保水性即持水性，是指肌肉在加壓加熱冷凍腌制等加工條件下保持其原有水分的能力[30]。保水能力是評價肉制品質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。組織中殘留的水分越多，產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)性能越好，經(jīng)濟價值也越高。離心損失越小就表示克氏原螯蝦的保水性越強。克氏原螯蝦4 ℃冷藏期間不同加工方式下的離心損失見圖4。由圖可知，儲藏0 d 時，110 ℃處理組保水性最好，100 ℃處理組保水性最差。121 ℃加工條件下，肌肉嚴(yán)重軟爛，大部分水在加工過程中已經(jīng)失去，因此加工后產(chǎn)品的離心損失小于100 ℃處理組。在儲藏過程中，各處理組的離心損失均隨著儲藏時間的延長而增加，這是由于儲藏期間蝦肉保水性下降，肌肉保持水分能力下降導(dǎo)致離心損失增加[31]。

圖4 不同加工方式對克氏原螯蝦冷藏期間離心損失變化的影響Fig.4 Changes of centrifugal loss in crayfish with different processing methods during refrigerated storage

2.5 克氏原螯蝦4 ℃冷藏期間肌原纖維蛋白的變化

2.5.1 克氏原螯蝦4 ℃冷藏期間肌原纖維蛋白巰基含量的變化 肌原纖維蛋白富含巰基，在氧化條件下很容易轉(zhuǎn)化為二硫鍵，導(dǎo)致巰基含量下降。因此，巰基含量是蛋白氧化程度的一個重要指標(biāo)。如圖5 所示，儲藏0 d 時處理溫度越高巰基含量越低，這說明處理溫度越高蛋白氧化程度越大。這可能是由于隨著氧化程度的增加，蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基被巰基轉(zhuǎn)化為二硫鍵（S-S），導(dǎo)致巰基含量下降[32]。這一點與Khan 等[33]的結(jié)論一致，鴨肉蛋白的處理溫度越高巰基含量越低。在儲藏期間，各處理組巰基含量均呈下降趨勢，這說明在儲藏期間各處理組的蛋白氧化程度加劇。且加工溫度越高，巰基含量下降速率越小。

圖5 不同加工方式對克氏原螯蝦冷藏期間肌原纖維蛋白巰基含量變化的影響Fig.5 Changes of sulfhydryl content of myofibrillar protein in crayfish with different processing methods during refrigerated storage

2.5.2 克氏原螯蝦4 ℃冷藏期間肌原纖維蛋白熒光強度的變化 蛋白質(zhì)中的色氨酸具有吸收紫外入射光后發(fā)生熒光的特征，且該熒光特性對蛋白質(zhì)的微環(huán)境極其敏感。根據(jù)這一特性，熒光光譜可以靈敏地反映蛋白質(zhì)的三級構(gòu)象[34]。天然蛋白質(zhì)在正常折疊條件下，色氨酸殘基通常存在于球狀蛋白質(zhì)（疏水環(huán)境）中，此時的色氨酸具有較高的熒光強度。蛋白在完全或部分折疊狀態(tài)下，色氨酸殘暴露在親水環(huán)境中，導(dǎo)致熒光強度降低[35]?？耸显r4 ℃冷藏期間肌原纖維蛋白內(nèi)源性熒光強度的變化見圖6。由圖可知，在儲藏0 d 時，克氏原螯蝦肌原纖維蛋白熒光強度隨處理溫度的升高而降低，λmax明顯紅移。λmax從335 nm 紅移到338 nm 附近。這表明高溫導(dǎo)致色氨酸從蛋白質(zhì)內(nèi)部轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)表面。這可能是因為高溫通過影響疏水微環(huán)境和氫鍵而改變了蛋白質(zhì)的表面疏水性和三級結(jié)構(gòu)[36]?？祽驯騕37]等研究高溫對牛肉肌原纖維蛋白的影響時發(fā)現(xiàn)，溫度越高肌原纖維蛋白熒光強度越低，與本文研究結(jié)論一致。在儲藏期間，各處理組的熒光強度均呈下降趨勢，這表明隨著儲藏期的延長色氨酸殘基持續(xù)暴露在親水環(huán)境中。

圖6 不同加工方式對克氏原螯蝦冷藏期間肌原纖維蛋白內(nèi)源性熒光強度變化的影響Fig.6 Changes of endogenous fluorescence intensity of myofibrillar protein in crayfish with different processing methods during refrigerated storage

2.5.3 克氏原螯蝦肌原纖維蛋白SDS-PAGE 電泳分析 克氏原螯蝦4 ℃冷藏期間肌原纖維蛋白SDSPAGE 的變化如圖7 所示。儲藏0 d 時，隨著加熱溫度的升高，肌原纖維蛋白的組成發(fā)生了明顯的變化，許多條帶變薄甚至消失；121 ℃條件下的條帶幾乎全部消失。高溫下，肌球蛋白重鏈（220 kDa）條帶消失，說明肌球蛋白重鏈發(fā)生了降解。肌動蛋白（43 kDa）和原肌球蛋白（37 kDa）條帶隨著溫度的升高逐漸消失，且肌動蛋白的降解速率大于原肌球蛋白，這與Jiang 等[38]的研究結(jié)果一致。這可能是由于原肌球蛋白的耐熱性大于肌動蛋白[39]。高溫下肌球蛋白輕鏈（17 kDa）條帶變少，說明肌球蛋白輕鏈也發(fā)生了降解。高溫處理使蛋白質(zhì)發(fā)生降解，導(dǎo)致長鏈蛋白降解呈短鏈蛋白或小肽，這些小肽不在凝膠電泳檢測范圍，因此電泳圖中條帶明顯減少?？傮w來說，高溫誘導(dǎo)肌纖維蛋白降解，蛋白質(zhì)降解程度與溫度呈正相關(guān)。121 ℃條件下的條帶幾乎全部消失。在儲藏期間，各處理組的蛋白質(zhì)降解程度無顯著性變化。這可能是由于在高溫處理過程中內(nèi)源酶被滅火，減少了冷藏期間蛋白酶對蛋白質(zhì)的降解。姜明慧等[40]研究發(fā)現(xiàn)蝦夷扇貝的肌原纖維蛋白冷藏過程中SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)各條帶無顯著性變化，與本文研究結(jié)論一致。

圖7 不同加工方式對克氏原螯蝦冷藏期間肌原纖維蛋白SDS-PAGE 變化的影響Fig.7 Changes of SDS-PAGE of myofibrillar protein in crayfish with different processing methods during refrigerated storage

2.6 克氏原螯蝦4 ℃冷藏期間TVB-N 的變化

揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）是衡量水產(chǎn)品新鮮度的重要指標(biāo)。由圖8 可知，儲藏0 d 時，不同加工方式下蝦肉的TVB-N 值有顯著性差異（P＜0.05），且處理溫度越高TVB-N 值越大，這可能是由于溫度越高，蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生的胺類含氮物質(zhì)越多，導(dǎo)致TVBN 值越高。宋盼等[41]對鹽水鴨進(jìn)行殺菌時發(fā)現(xiàn)殺菌溫度越高，TVB-N 值越高，與本文研究結(jié)論一致。在儲藏期間，各處理組的TVB-N 值隨著儲藏時間的延長而增加。這可能是由于儲藏期間，克氏原螯蝦微生物的繁殖使蝦肉蛋白質(zhì)發(fā)生降解，導(dǎo)致TVB-N 值增加。整個儲藏期間，100 ℃處理組TVB-N 值增長較快，110 和121 ℃處理組TVB-N 值增長較慢。綜上所述，在整個4 ℃冷藏期間，110 和121 ℃處理組可以抑制TVB-N 值增加，也就是有效地抑制了酶的活性和微生物的生長，延長了克氏原螯蝦的貨架期。

圖8 不同加工方式對克氏原螯蝦冷藏期間TVB-N變化的影響Fig.8 Changes of TVB-N value in crayfish with different processing methods during refrigerated storage

2.7 克氏原螯蝦4 ℃冷藏期間菌落總數(shù)的變化

菌落總數(shù)是判定食物品質(zhì)優(yōu)劣的重要標(biāo)志，國家標(biāo)準(zhǔn)GB 10236-2015 規(guī)定克氏原螯蝦產(chǎn)品的菌落總數(shù)限值是5 lg（CFU/g），即克氏原螯蝦菌落總數(shù)超過5 lg（CFU/g）為不可食用，此時為貨架期的終點。圖9顯示了不同加工工藝下克氏原螯蝦產(chǎn)品的菌落總數(shù)變化。由圖可知，100 ℃處理組，克氏原螯蝦的初始菌落總數(shù)為1.98±0.03 lg（CFU/g），顯著大于其他處理（P＜0.05）；110 ℃處理組的克氏原螯蝦儲藏5 d 時菌落總數(shù)未檢出；121 ℃處理組的克氏原螯蝦儲藏21 d 時菌落總數(shù)未檢出。這說明殺菌溫度越高，殺菌效果越好。在儲藏期間，克氏原螯蝦的菌落總數(shù)隨儲藏時間的延長而增加。常思盎等[42]研究發(fā)現(xiàn)殺菌后的黃燜雞的菌落總數(shù)隨貯藏時間延長而增加，與本文研究結(jié)論一致。根據(jù)國標(biāo)菌落總數(shù)限值判定，100 ℃處理組克氏原螯蝦貨架期為7 d，110 ℃貨架期為35 d，121 ℃貨架期大于35 d。由此可知，加工溫度越高，產(chǎn)品貨架期越長。綜上所述，加工溫度高于110 ℃能夠有效延長克氏原螯蝦產(chǎn)品的貨架期。

圖9 不同加工方式對克氏原螯蝦冷藏期間菌落總數(shù)變化的影響Fig.9 Changes of total number of colonies in crayfish with different processing methods during refrigerated storage

2.8 克氏原螯蝦4 ℃冷藏期間微觀結(jié)構(gòu)的變化

不同加工方式下克氏原螯蝦4 ℃冷藏期間微觀結(jié)構(gòu)見圖10。新鮮克氏原螯蝦的肌纖維排列緊密無縫隙，肌束排列整齊，肌肉組織結(jié)構(gòu)完整。儲藏0 d時，100 ℃處理組與新鮮蝦差異不大，肌纖維之間稍有間隙，排列比較整齊。110 ℃加熱條件下，肌纖維間隙增加。121 ℃處理組的肌纖維結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，纖維斷裂，間隙較大。由此可以看出，溫度越高，蝦肉纖維組織被破壞程度越大。這是由于蝦肉受熱蛋白質(zhì)發(fā)生變性，克氏原螯蝦肌肉發(fā)生收縮，肌內(nèi)膜以及肌束膜變性收縮，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。因此肌纖維完整性遭到破壞，肌纖維之間和肌原纖維之間的空間狀態(tài)發(fā)生了改變。肌纖維因擠壓而斷裂，肌纖維之間空隙增加，持水性下降。溫度越高，肌纖維斷裂程度越劇烈。Jiang 等[43]研究了加熱對草魚的影響，發(fā)現(xiàn)加熱溫度越高，肌纖維收縮越嚴(yán)重，水分流失越大，這與本文的結(jié)果一致。在儲藏期間，儲藏時間越長，肌纖維受損程度越大。100 ℃處理組儲藏7 d 時，肌纖維間隙增加，出現(xiàn)了粘性物質(zhì)，可能貨架期終點，微生物的繁殖導(dǎo)致肌肉分解。110 ℃在儲藏21 d 時，纖維間隙增大；儲藏35 d 時，纖維間隙進(jìn)一步增大并出現(xiàn)粘性物質(zhì)。121 ℃處理組儲藏35 d 內(nèi)變化較小，可能是由于初始階段纖維已經(jīng)嚴(yán)重斷裂，因此后期變化小。韋依儂等[44]在研究魚糜制品微觀結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)在儲藏期間纖維孔徑逐漸變大，與本文研究結(jié)論一致。綜合蝦肉微觀結(jié)構(gòu)來看，121 ℃處理組蝦肉纖維嚴(yán)重斷裂，蝦肉軟爛，該工藝不適宜用于克氏原螯蝦加工。100 ℃、110 ℃加工工藝對蝦肉肌纖維破壞較小，可以用于克氏原螯蝦加工。

圖10 不同加工方式下克氏原螯蝦冷藏期間掃描電鏡圖（100×）Fig.10 Scanning electron microscopy in crayfish with different processing methods during refrigerated storage (100×)

3 結(jié)論

本實驗對克氏原螯蝦采用3 種熱加工方式進(jìn)行加工，分別是熟制無殺菌（100 ℃、5 min）、熟制后殺菌（100 ℃、5 min 后121℃、10 min）、熟制殺菌一步到位工藝（110 ℃、10 min）。結(jié)果表明：不同加工方式對克氏原螯蝦產(chǎn)品品質(zhì)有顯著性影響（P＜0.05）；先熟制后殺菌條件下小龍蝦的肌肉斷裂程度、脂質(zhì)和蛋白氧化程度顯著大于其他組（P＜0.05）。熟制殺菌一步工藝下的蝦肉硬度和彈性顯著優(yōu)于其他組（P＜0.05）。各處理組在冷藏過程中，克氏原螯蝦的品質(zhì)呈下降趨勢，蝦肉肌原纖維蛋白巰基含量和熒光強度下降，pH、離心損失、TVB-N、菌落總數(shù)上升，TBARS值先上升后下降。3 種工藝條件下小龍蝦的貨架期分別為：7 d（100 ℃）、35 d（110 ℃）、35 d 以上（121 ℃）。綜上所述，熟制殺菌一步到位（110 ℃、10 min）加工方式下能夠使克氏原螯蝦保持較好的品質(zhì)，且4 ℃冷藏條件下貨架期可達(dá)35 d，比傳統(tǒng)熟制無殺菌加工方法延長了28 d。