茶樹R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子CsTT2表達(dá)分析及功能初步鑒定

王玉源，劉任堅(jiān)，劉少群，舒燦偉，孫彬妹，鄭鵬*

茶樹R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子CsTT2表達(dá)分析及功能初步鑒定

王玉源1，劉任堅(jiān)1，劉少群1，舒燦偉2，孫彬妹1，鄭鵬1*

1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東 廣州 510642；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/廣東省微生物信號與作物病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/群體微生物研究中心，廣東 廣州 510642

兒茶素是茶樹中特色的次生代謝產(chǎn)物之一，是影響茶葉的品質(zhì)與風(fēng)味的主要組分，具有抗氧化、抗病毒、降脂減肥等藥理功效。通過系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析、基因表達(dá)模式分析和分子生物學(xué)試驗(yàn)對茶樹兒茶素生物合成相關(guān)調(diào)控因子CsTT2的功能進(jìn)行初步鑒定。結(jié)果顯示，CsTT2是R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子，與擬南芥中調(diào)控次生代謝產(chǎn)物的MYB轉(zhuǎn)錄因子同在一個分支。在茶樹品種頂芽組織中總兒茶素含量較高，和兒茶素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)水平也較高。亞細(xì)胞定位、酵母試驗(yàn)和雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)試驗(yàn)結(jié)果表明，定位在細(xì)胞核中，其編碼的蛋白是具有轉(zhuǎn)錄激活能力的調(diào)控因子，可以結(jié)合兒茶素生物合成關(guān)鍵基因的啟動子激活其表達(dá)。

茶樹；R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子；；兒茶素生物合成

茶樹[(L.) O. Kuntze]屬于山茶屬（Theaceae）灌木或小喬木，主要包括中國種（var）和阿薩姆種（var）兩個栽培品種[1]，是中國、日本、印度和肯尼亞等地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)作物[2]。兒茶素屬于類黃酮物質(zhì)，是茶樹中重要的次生代謝產(chǎn)物，在茶樹的各個器官中均有分布。兒茶素含量占茶葉干重的12%～24%，占多酚類總量的70%～80%[3]。兒茶素作為茶樹中重要的次生代謝產(chǎn)物之一，不僅能夠影響茶葉的品質(zhì)風(fēng)味，還具有抗癌[4]、抗衰老[5-6]、抗氧化[7]、抗病毒[8-9]、保護(hù)神經(jīng)[10]、調(diào)節(jié)免疫力[11]及降脂減肥[12]等藥理功能。

在植物中，許多次生代謝產(chǎn)物的生物合成途徑是保守的。研究表明，茶樹中類黃酮生物合成途徑可以參照大多數(shù)模式植物，特別是擬南芥中花青素的生物合成途徑[13]。與植物類黃酮生物合成途徑比較，兒茶素類化合物種類較多，其生物合成途徑涉及多條代謝途徑，是相對復(fù)雜、需要受多種因素協(xié)調(diào)調(diào)控的過程。前人研究發(fā)現(xiàn)，茶樹兒茶素生物合成通路主要包括莽草酸途徑、苯丙烷途徑、非酯型兒茶素合成和酯型兒茶素合成等4個環(huán)節(jié)[13-17]。目前，茶樹兒茶素生物合成過程中主要的催化酶基因已經(jīng)被克隆，包括苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸羥化酶、4-香豆酸CoA連接酶、查爾酮合成酶、查爾酮異構(gòu)酶、黃烷酮3-羥化酶、3',5'-類黃酮羥化酶、二氫黃酮醇還原酶、無色花色素還原酶、花青素合酶、花青素還原酶等[18]。茶樹中的兒茶素又分為非酯型兒茶素和酯型兒茶素。非酯型兒茶素生物合成的主要途徑已經(jīng)清晰[19-21]，而酯型兒茶素的生物合成通路尚未明確。有研究者推測，酯型兒茶素是由非酯型兒茶素沒食子酯化得到，但這一猜測并未被試驗(yàn)證實(shí)[13]。Niemetz和Gross認(rèn)為1--沒食子酰--葡萄糖是單寧合成的有效酰基供體和受體[22-23]。Liu等[24]在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步證實(shí)，表兒茶素（EC）和表沒食子兒茶素（EGC）在沒食子?；?1----葡萄糖轉(zhuǎn)移酶（UGGT）和1--沒食子?；?--沒食子酰基轉(zhuǎn)移酶（ECGT）的催化下合成酯型兒茶素。與此同時，酯型兒茶素也會在水解酶的作用下水解得到非酯型兒茶素EC和EGC[25]。也有研究發(fā)現(xiàn)，基因家族能夠參與非酯型兒茶素轉(zhuǎn)化為酯型兒茶素的過程[26]。近年來，有關(guān)茶樹兒茶素生物合成的調(diào)控已有相關(guān)報(bào)道。Luo等[27]研究發(fā)現(xiàn)，CsWRKY31和CsWRKY48能夠結(jié)合甲基化兒茶素生物合成相關(guān)基因、和的啟動子，抑制它們的表達(dá)。Wang等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在煙草中過表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株中兒茶素單體的含量上升，且煙草中相關(guān)合成基因和的表達(dá)上調(diào)。綜上所述，茶樹兒茶素的生物合成途徑已經(jīng)取得了許多研究進(jìn)展，然而其生物合成的分子調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步探究。

MYB是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族，它在植物的生長發(fā)育、植物響應(yīng)生物和非生物脅迫以及調(diào)控植物次生代謝產(chǎn)物生物合成方面起著重要作用[29]。它通常具有兩個不同的區(qū)域，一個是位于N端的高度保守的DNA結(jié)合域，另一個是位于C端的負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性的調(diào)節(jié)區(qū)域。根據(jù)結(jié)構(gòu)域所含R結(jié)構(gòu)的數(shù)量，植物中的MYB轉(zhuǎn)錄因子可分為4類，分別是1R-MYB/MYB-related（1個R結(jié)構(gòu)）、R2R3-MYB（2個R結(jié)構(gòu)）、R1R2R3-MYB蛋白（3個R結(jié)構(gòu)）和4R-MYB（4個R結(jié)構(gòu)）[29]。在植物中，大多數(shù)MYB屬于R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子[30]，通常作為轉(zhuǎn)錄激活子或者抑制子直接或間接調(diào)控類黃酮生物合成中相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，從而影響物質(zhì)的積累[31-33]。TT2類轉(zhuǎn)錄因子是R2R3-MYB蛋白，通過激活相關(guān)合成酶基因的表達(dá)調(diào)控次生代謝產(chǎn)物的生物合成[34-37]。目前，在許多植物中，TT2類轉(zhuǎn)錄因子已被克隆和鑒定，包括擬南芥[38]、葡萄[39]、草莓和[33]、蘋果和[40]、楊樹[41]等，這些基因都參與調(diào)控植物中次生代謝產(chǎn)物的生物合成。

本研究通過系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析、基因表達(dá)模式分析和分子生物學(xué)試驗(yàn)對茶樹兒茶素生物合成相關(guān)調(diào)控因子CsTT2的功能進(jìn)行初步鑒定，為研究茶樹兒茶素生物合成的分子調(diào)控機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為嶺頭單叢（LTDC）、紅柄單叢（HBDC）和龍井長葉（LJCY）茶樹品種的多年生灌木茶苗，種植于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹種質(zhì)資源圃。于2020年，分別采摘3個茶樹品種一芽二葉頂芽組織，用液氮速凍后置于–80℃冰箱貯存，用于提取RNA和測定兒茶素含量；采摘LTDC品種的一芽二葉頂芽、嫩葉、成熟葉、老葉、根、莖、花和果實(shí)組織，用液氮速凍后置于–80℃冰箱貯存，用于提取RNA；以上每個樣本設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。此外，試驗(yàn)用到的本氏煙草（），種子來自本實(shí)驗(yàn)室。

1.2 同源比對分析及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建

將擬南芥AtTT2（AT5G35550）蛋白序列比對到茶樹基因組數(shù)據(jù)庫（http://tpdb.shengxin.ren/index.html）中，找到茶樹同源基因（），并下載其蛋白序列。將CsTT2的蛋白序列放入到NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，下載其他物種中同源蛋白序列，并在DNAMAN軟件中進(jìn)行蛋白序列比對分析。從擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫（https://www.arabidopsis.org）下載擬南芥所有MYB蛋白序列，用clustalW軟件對CsTT2蛋白序列和擬南芥所有MYB蛋白序列進(jìn)行完全比對分析。根據(jù)已有報(bào)道，使用Jalview軟件截取R2R3-MYB蛋白的保守結(jié)構(gòu)域區(qū)域[42]，再使用MEGA-X軟件中的鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.3 兒茶素含量測定

兒茶素（C）、EC、沒食子兒茶素（GC）、EGC、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）和表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）標(biāo)準(zhǔn)樣品購自上海源葉生物科技有限公司。用70%甲醇溶液將標(biāo)準(zhǔn)樣品分別配制成質(zhì)量濃度為0.01、0.1、0.2、0.5?mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)液，用于兒茶素單體標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建。

使用冷凍干燥機(jī)將樣品凍干，用研缽將樣品磨成粉末狀，準(zhǔn)確稱取0.1?g粉末加入到含有5?mL 70%甲醇的10?mL離心管中，浸提5?min后（期間上下振蕩），70℃水浴超聲振蕩30?min，在12?000?r·min-1下離心5?min，用1?mL注射器吸取上清液，通過0.45?μm微孔過濾器過濾到棕色樣品瓶中，最后用Waters Alliance 2489高效液相色譜儀（Waters Technologies，美國）測定樣品中兒茶素的含量。上機(jī)條件：柱溫，(30±5)℃；流速，1?mg·mL-1；波長，280?nm；進(jìn)樣量，10?μL；上機(jī)程序如表1所示。

1.4 實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）

表1 梯度程序

1.5 基因表達(dá)模式分析

從茶樹基因組數(shù)據(jù)庫（http://tpdb.shengxin.ren/index.html）中下載茶樹頂芽、嫩葉、成熟葉、老葉、根、莖、花和果實(shí)等8個不同組織部位的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，用TBtools軟件進(jìn)行相關(guān)基因表達(dá)量熱圖的構(gòu)建[45]，分析基因表達(dá)模式。

1.6 載體構(gòu)建

根據(jù)的CDS序列以及載體酶切位點(diǎn)，使用CE Design V1軟件設(shè)計(jì)同源重組引物，引物見表3，下劃線部分為載體的酶切位點(diǎn)。以白葉單叢的cDNA為模板，使用PrimeSTAR酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳后回收目的條帶，連接到對應(yīng)的線性化載體上，轉(zhuǎn)化至DH5后進(jìn)行鑒定并測序，將陽性克隆提取質(zhì)粒，用于轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌和酵母菌。

1.7 亞細(xì)胞定位試驗(yàn)

將的CDS序列（去除終止密碼子）構(gòu)建到pEAQ-EGFP載體上，以空白載體為對照，使用熱激法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101。用侵染液（200?μmol·L-1AS，10?mmol·L-1MgCl2，10?mmol·L-1MES，PH為5.6，現(xiàn)配現(xiàn)用）將活化后的菌體重懸至OD值為0.4～0.6，活化2?h后，將空載體（35S::CsTT2::EGFP）與細(xì)胞核marker（35S::NLS::Dsred）按體積比1∶1混合，使用無針頭注射器將菌液從葉片下表皮注射到本氏煙草中，黑暗保濕培養(yǎng)48?h后，用生物顯微鏡BX53（OLYMPUS，日本）進(jìn)行觀察和拍照。

1.8 酵母自激活試驗(yàn)

將全長CDS序列以及根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域短截后的序列構(gòu)建到pGBKT7（BD）載體上，以空白載體為對照，將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到酵母感受態(tài)Y2HGold。用100?μL ddH2O重懸陽性單克隆菌，分別在SD/-Trp和SD/-Trp-His-Ade培養(yǎng)基上點(diǎn)5?μL菌液，30℃倒置培養(yǎng)3?d后，用X--gal對菌斑進(jìn)行染色，然后觀察和拍照。

1.9 轉(zhuǎn)錄激活試驗(yàn)

將全長CDS序列構(gòu)建到pEAQ-PBD載體上，以空白載體為陰性對照，pEAQ-PBD-VP16為陽性對照，將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101。用侵染液（200?μmol·L-1AS，10?mmol·L-1MgCl2，10?mmol·L-1MES，PH為5.6，現(xiàn)配現(xiàn)用）將活化后的菌體重懸至OD值為0.2，活化2?h后，將陰性對照/陽性對照/pEAQ-PBD-CsTT2與報(bào)告載體（GAL-LUC）按體積比1∶1混合，使用無針頭注射器將菌液從葉片下表皮注射到本氏煙草中，黑暗保濕培養(yǎng)24?h，再正常培養(yǎng)48?h后，使用Promega公司的雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)試劑盒檢測螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase，LUC）和海腎熒光素酶（Renilla luciferase，REN）的活性。

表2 定量引物序列

表3 載體引物序列

1.10 酵母單雜交試驗(yàn)

使用在線數(shù)據(jù)庫JASPAR（https://jaspar.genereg.net）對兒茶素合成基因啟動子中可能存在的MYB結(jié)合元件進(jìn)行預(yù)測和統(tǒng)計(jì)。

根據(jù)預(yù)測結(jié)果，將兒茶素合成基因啟動子短截為4個片段，分別構(gòu)建到pAbAi載體上，并整合到Y(jié)1HGold酵母菌中，形成誘餌特異性報(bào)告菌株，篩選每個啟動子的自激活抑制濃度（其中，ProLAR和ProSCPL的自激活活性在AbA質(zhì)量濃度為1?000?ng·mL-1下仍無法抑制，因此沒進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)）。將基因的CDS全長序列構(gòu)建到pGADT7（AD）載體上，再轉(zhuǎn)化到誘餌特異性報(bào)告菌株中。用ddH2O重懸陽性單克隆菌，將濃度OD600調(diào)為0.2、0.02、0.002，分別在SD/-Leu和SD/-Leu+AbA培養(yǎng)基上點(diǎn)5?μL菌液，30℃倒置培養(yǎng)3?d后，進(jìn)行觀察和拍照。

1.11 雙熒光素酶試驗(yàn)

將全長CDS序列構(gòu)建到pEAQ載體上，將兒茶素合成基因啟動子（、、）構(gòu)建到pGreenII-0800-LUC載體上，以空白載體pEAQ作為對照，將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101。用侵染液（200?μmol·L-1AS，10?mmol·L-1MgCl2，10?mmol·L-1MES，pH為5.6，現(xiàn)配現(xiàn)用）將活化后的菌體重懸至OD值為0.2，活化2?h后，將pEAQ/pEAQ-CsTT2+pGreenII-0800-ProANR-LUC/pGreenII-0800-ProLAR-LUC/pGreenII-0800-ProSCPL-LUC分別按體積比20∶1混合，使用無針頭注射器將菌液從葉片下表皮注射到本氏煙草中，黑暗保濕培養(yǎng)24?h，再正常培養(yǎng)48?h后，使用Promega公司的雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)試劑盒檢測Firefly和REN值。

1.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)方差分析使用IBM SPSS Statistics 22軟件完成，圖片處理和組合使用Adobe Illustrator 2020軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsTT2保守結(jié)構(gòu)域及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析

多序列比對結(jié)果顯示，CsTT2具有兩個串聯(lián)不完整重復(fù)序列R2和R3，表明CsTT2是R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子（圖1）。在擬南芥中，根據(jù)DNA結(jié)合域和C端氨基酸基序的保守性，對MYB轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行了分組；其中，R2R3-MYB蛋白被分成23個亞組[46]。本研究對CsTT2和擬南芥中所有MYB蛋白進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析，將蛋白分為6個主要亞組，Group Ⅵ又進(jìn)一步分為Group Ⅵa、Group Ⅵb、Group Ⅵc、Group Ⅵd和Group Ⅵe。結(jié)果顯示，CsTT2和擬南芥S2、S3、S5、S6、S7和S15中的R2R3-MYB蛋白聚集在同一亞組（Group Ⅳ）中（圖2）。S7中的成員可以調(diào)控黃酮醇的合成[47]，S6中的成員可以調(diào)控營養(yǎng)生殖過程中花青素的合成[48]，S5中的成員可以調(diào)控?cái)M南芥種皮原花青素的合成[49]，而S3中的成員可以激活導(dǎo)管中的木質(zhì)素生物合成[50-51]。因此，CsTT2可能參與調(diào)控茶樹類黃酮次生代謝物生物合成的過程。

2.2 茶樹頂芽兒茶素含量與兒茶素生物合成相關(guān)基因表達(dá)水平分析

兒茶素主要分布在茶樹的頂芽部位。本研究使用高效液相色譜法測定LTDC、HBDC和LJCY 3個茶樹品種頂芽部位中6種常見兒茶素的含量（圖3-A）。如圖3-B所示，在3個茶樹品種中，GC的含量沒有顯著差異，而HBDC中EGC和C的含量顯著高于其他兩個品種，EC的含量顯著高于LJCY。此外，LTDC和HBDC中EGCG的含量顯著高于LJCY，而ECG的含量則相反。

注：葡萄：VvTT2（RVW44110.1），木豆：CcMYB6（XP_020227123.1），楊梅：MrTT2（KAB1209459.1），雞血藤：SsTT2（TKY54429.1），大豆：GmMYB23（XP_003541301.1），擬南芥AtTT2（AT5G35550）

注：擬南芥中的R2R3-MYB蛋白被分為23個亞組[46]，每個亞組對應(yīng)分支的顏色如圖右上方所示，而黑色分支為除R2R3-MYB外的其他MYB成員。本研究構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹主要分為6個亞組，對應(yīng)分組情況如圖紫色弧線所示

注：A. 液相色譜峰圖。B. 3個茶樹品種中6種兒茶素單體的含量。數(shù)據(jù)是用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤來表示，圖中不同的字母表示顯著不同的值（P<0.05, Tukey’s test）

Fig.3 Contents of catechincomponents in apical bud of different tea cultivars

進(jìn)一步對3個茶樹品種頂芽的總兒茶素含量以及兒茶素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，LTDC和HBDC中總兒茶素含量顯著高于LJCY（圖4-A）。此外，在LTDC和HBDC中，除了（）外，目的基因和兒茶素生物合成相關(guān)基因（）、（）、（）、（）和（）的表達(dá)量均顯著高于LJCY（圖4-B和圖4-C）。

2.3 CsTT2轉(zhuǎn)錄活性分析

為了進(jìn)一步分析CsTT2的轉(zhuǎn)錄活性，本研究還進(jìn)行了亞細(xì)胞定位、雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)試驗(yàn)和酵母自激活試驗(yàn)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)入pEAQ-EGFP空載體的本氏煙草葉片中的細(xì)胞膜和細(xì)胞核均激發(fā)出綠色熒光，轉(zhuǎn)入pEAQ-CsTT2-EGFP的本氏煙草葉片中僅細(xì)胞核激發(fā)出綠色熒光（圖5-A），這表明定位在細(xì)胞核中。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果顯示，相對于pEAQ-PBD陰性對照，CsTT2可以顯著提高Firefly LUC的活性（圖5-B），表明CsTT2在植物中具有轉(zhuǎn)錄激活功能。為了進(jìn)一步研究CsTT2的激活區(qū)域，根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域的位置將CsTT2序列短截后進(jìn)行酵母自激活試驗(yàn)。結(jié)果顯示，CsTT2蛋白的激活區(qū)域主要位于C端的113—308氨基酸（圖5-C）。上述結(jié)果表明，定位在細(xì)胞核中，是具有轉(zhuǎn)錄激活能力的調(diào)控基因，且轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域主要位于C端的113—308氨基酸處。

2.4 CsTT2結(jié)合調(diào)控兒茶素合成基因ANR啟動子活性的分析

對和兒茶素生物合成相關(guān)基因（、、、、和）在茶樹8個不同組織部位中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，（）、（）和（）在茶樹8個不同組織部位中的表達(dá)模式和一致，主要在茶樹的幼嫩芽葉部位中表達(dá)，且表達(dá)量在嫩葉組織中最高（圖6-A）。qRT-PCR結(jié)果進(jìn)一步證明，、（）、（）和（）在LTDC 8個不同組織部位中的表達(dá)模式一致，均在頂芽和嫩葉中高表達(dá)（圖6-B）。

注：A. 3個茶樹品種頂芽中總兒茶素的含量。B. CsTT2在3個茶樹品種頂芽中的表達(dá)量。C. 兒茶素生物合成相關(guān)基因（LAR、ANR、DFR、CHS、ANS和SCPL）在3個茶樹品種頂芽中的表達(dá)量。數(shù)據(jù)是用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤來表示，采用Student’s test與對照“LJCY”進(jìn)行顯著性分析（**，P<0.01）

注：A. CsTT2的亞細(xì)胞定位分析。比例尺=50?μm。Bright field：明場通道；DsRed channel：紅色熒光通道；GFP channel：綠色熒光通道；Merged channel：融合通道。B. CsTT2在煙草中的轉(zhuǎn)錄活性分析。pEAQ-PBD和pEAQ-PBD-VP16為陰性和陽性對照。數(shù)據(jù)是用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤來表示，采用Student’s test與陰性對照進(jìn)行顯著性分析（**，P<0.01）。C. CsTT2在酵母中的轉(zhuǎn)錄活性分析。BD載體為陰性對照。圖上方為CsTT2蛋白結(jié)構(gòu)圖。SD/-Trp代表SD培養(yǎng)基缺少色氨酸；SD/-Trp-His-Ade/+X-α-Gal代表SD培養(yǎng)基缺少色氨酸、組氨酸、腺嘌呤且添加X-α-Gal

Fig.5 Subcellular localization and transcription activity analysis of CsTT2

進(jìn)一步通過酵母單雜交試驗(yàn)驗(yàn)證CsTT2與啟動子的結(jié)合能力。如圖7-A所示，克隆出來的啟動子區(qū)域（–1?bp至–1?423?bp）可能存在16個MYB-bingding-element。根據(jù)預(yù)測結(jié)果，將其啟動子短截成4段約為350?bp的短片段，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。與AD+pAbAi-ProANR2酵母菌相比，轉(zhuǎn)化AD-CsTT2+pAbAi-ProANR2的菌株能在SD/Leu和SD/Leu+AbA的平板上生長，這說明CsTT2能夠與的啟動子相結(jié)合（圖7-B）。此外，雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)試驗(yàn)結(jié)果顯示，在植物體內(nèi)，CsTT2能夠激活啟動子，進(jìn)而驅(qū)動下游螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)，增強(qiáng)Firefly LUC的活性；而它不能激活和的啟動子（圖7-C）。上述結(jié)果表明，CsTT2蛋白能夠結(jié)合兒茶素生物合成相關(guān)基因的啟動子，進(jìn)而激活的表達(dá)。

3 討論

茶樹兒茶素不僅能決定茶葉的品質(zhì)和風(fēng)味，還具有抗氧化、抗癌和降脂減肥等藥理功效。目前，茶樹兒茶素生物合成途徑的研究已取得了重要的進(jìn)展，然而其分子調(diào)控機(jī)制尚未清晰。許多研究表明，R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成過程中起著重要作用[52-54]。本研究通過系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析、基因表達(dá)模式和分子生物學(xué)試驗(yàn)對茶樹兒茶素生物合成相關(guān)調(diào)控因子CsTT2的功能進(jìn)行初步鑒定。

在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中，同一分支的基因往往具有相似的功能。本研究通過系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，CsTT2與擬南芥中S2、S3、S5、S6、S7和S15中的R2R3-MYB蛋白聚集在同一亞組中（圖2）。S3、S5、S6和S7中的成員均參與調(diào)控?cái)M南芥類黃酮次生代謝物的生物合成[47-51]。此外，S2中的成員AtMYB15能夠控制以及其他基因的表達(dá)去響應(yīng)低溫脅迫[55]，S15中的成員參與調(diào)控?cái)M南芥毛狀體以及根毛的形成[56]。這表明CsTT2不僅可能參與調(diào)控茶樹類黃酮次生代謝生物合成，還可能響應(yīng)低溫脅迫以及參與調(diào)控茶樹毛狀體和根毛的形成?；虮磉_(dá)模式分析有利于挖掘該基因的潛在功能。本研究通過高效液相色譜法和qRT-PCR技術(shù)測定茶樹品種頂芽的兒茶素含量以及兒茶素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)量。結(jié)果顯示，在兒茶素含量高的品種中，目的基因和兒茶素生物合成相關(guān)基因（、、、和）的表達(dá)量均上調(diào)（圖4）。

注：A. CsTT2和兒茶素生物合成相關(guān)基因在茶樹8個不同組織部位的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析。熱圖右側(cè)顯示每個基因的ID號。B. CsTT2和兒茶素生物合成相關(guān)基因在LTDC的8個不同組織部位的qRT-PCR分析。數(shù)據(jù)是用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤來表示，圖中不同的字母表示顯著不同的值（P<0.05，Tukey’s test）。RT：根，ST：莖，F(xiàn)L：花，F(xiàn)R：果實(shí)，AB：頂芽，YL：嫩葉，ML：成熟葉，OL：老葉

注：A. 兒茶素生物合成相關(guān)基因ANR啟動子MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件的預(yù)測。紅色的三角符號表示MYB轉(zhuǎn)錄因子特異結(jié)合元件。B. CsTT2結(jié)合兒茶素生物合成相關(guān)基因ANR啟動子的鑒定。ProANR1：–1?074?bp至–1?423?bp，ProANR2：–724?bp至–1?073?bp，ProANR3：–374?bp至–723?bp，ProANR4：–1?bp至–373?bp。SD/-Leu表示SD培養(yǎng)基缺乏亮氨酸，SD/-Leu+AbA表示SD/-Leu添加AbA，AbA使用濃度：ProANR1和ProANR3: 1?000?ng·mL-1，ProANR2：850?ng·mL-1，ProANR4：900?ng·mL-1；藍(lán)色三角符號代表菌液稀釋的倍數(shù)。C. CsTT2調(diào)控兒茶素生物合成相關(guān)基因（ANR、LAR和SCPL）啟動子活性的分析。數(shù)據(jù)是用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤來表示，采用Student’s test與對照（pEAQ+ProANR/ProLAR/ProSCPL）進(jìn)行顯著性分析（**，P<0.01）

在茶樹中，基因具有多個拷貝。其中，在煙草中過表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株的花青素含量得到積累，而MYB5b能夠調(diào)控兒茶素單體C和EC的合成。在煙草中過表達(dá)（），煙草中類黃酮物質(zhì)生物合成相關(guān)基因（、、和）的表達(dá)量上調(diào)，但是轉(zhuǎn)基因株系中的花青素含量并沒有明顯變化[28,57-58]，它如何影響相關(guān)基因的表達(dá)以及是否參與調(diào)控茶樹中兒茶素生物合成還有待進(jìn)一步探究。因此，為了進(jìn)一步研究CsTT2的功能，本研究進(jìn)行了亞細(xì)胞定位、酵母自激活、酵母單雜交以及雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)試驗(yàn)。結(jié)果表明，定位在細(xì)胞核中，是具有轉(zhuǎn)錄激活能力的調(diào)控因子（圖5）。進(jìn)一步試驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，CsTT2可以結(jié)合兒茶素生物合成重要基因的啟動子，從而激活它的表達(dá)（圖7）。CsTT2有可能是通過直接激活基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控茶樹兒茶素的生物合成。若后續(xù)能在茶樹本體上直接進(jìn)行基因功能驗(yàn)證，則更能進(jìn)一步鑒定CsTT2的調(diào)控功能。

本研究通過基本的生物信息學(xué)分析和一系列分子生物學(xué)試驗(yàn)對CsTT2的功能進(jìn)行初步鑒定。結(jié)果表明，CsTT2可以結(jié)合茶樹兒茶素生物合成重要合成基因的啟動子，并激活其表達(dá)。本研究為研究茶樹兒茶素生物合成的分子調(diào)控機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

[1] Ming T, Bartholomew B. Theaceae [J]. Flora China, 2007, 12: 366-478.

[2] Zhao M, Zhang N, Gao T, et al. Sesquiterpene glucosylation mediated by glucosyltransferase UGT91Q2 is involved in the modulation of cold stress tolerance in tea plants [J]. New Phytol, 2020, 226(2): 362-372.

[3] 宛曉春. 茶葉生物化學(xué)[M]. 3版. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2003.

Wan X C. Biochemistry of tea: the third edition [M]. 3rd ed. Beijing: China Agriculture press, 2003.

[4] Zhao M, Yu Y, Sun L, et al. GCG inhibits SARS-CoV-2 replication by disrupting the liquid phase condensation of its nucleocapsid protein [J]. Nature Communications, 2021, 12(1): 2114.doi: 10.1038/s41467-021-22297-8.

[5] Xiong L G, Chen Y J, Tong J W, et al. Epigallocatechin-3-gallate promotes healthy lifespan through mitohormesis during early-to-mid adulthood in[J]. Redox Biology, 2018, 14: 305-315.

[6] Yuan H, Li Y, Ling F, et al. The phytochemical epigallocatechin gallate prolongs the lifespan by improving lipid metabolism, reducing inflammation and oxidative stress in high-fat diet-fed obese rats [J]. Aging cell, 2020, 19(9): e13199. doi: 10.1111/acel.13199.

[7] Lwxa B, Shang C, Tsza B, et al. Green tea derivative epigallocatechin-3-gallate (EGCG) confers protection against ionizing radiation-induced intestinal epithelial cell death bothand[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2020, 161: 175-186.

[8] Zhang Z, Zhang X, Bi K, et al. Potential protective mechanisms of green tea polyphenol EGCG against COVID-19 [J]. Trends in Food Science & Technology, 2021, 114: 11-24.

[9] Zhao J, Blayney A, Liu X, et al. EGCG binds intrinsically disordered N-terminal domain of p53 and disrupts p53-MDM2 interaction [J]. Nature Communications, 2021, 12(1): 986. doi: 10.1038/s41467-021-21258-5.

[10] Bernier L P, York E M, Kamyabi A, et al. Microglial metabolic flexibility supports immune surveillance of the brain parenchyma [J]. Nat Commun, 2020, 11(1): 1559. doi: 10.1038/s41467-020-15267-z.

[11] Liu Z S, Cai H, Xue W, et al. G3BP1 promotes DNA binding and activation of cGAS [J]. Nat Immunol, 2019, 20(1): 18-28.

[12] Yang C S, Hong J. Prevention of chronic diseases by tea: possible mechanisms and human relevance [J]. Annual Review of Nutrition, 2013, 33: 161-181.

[13] 夏濤, 高麗萍. 類黃酮及茶兒茶素生物合成途徑及其調(diào)控研究進(jìn)展[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 42(8): 2899-2908.

Xia T, Gao L P. Research progress on biosynthesis pathway and regulation of flavonoids and catechins [J]. Scientia Agricultura Sinica, 2009, 42(8): 2899-2908.

[14] Weisshaar B, Jenkins G I. Phenylpropanoid biosynthesis and its regulation [J]. Current Opinion in Plant Biology, 1998, 1(3): 251-257.

[15] Furukawa T, Eshima A, Koiya M, et al. Coordinate expression of genes involved in catechin biosynthesis incells [J]. Plant Cell Reports, 2002, 21(4): 385-389.

[16] 夏濤, 高麗萍, 劉亞軍, 等. 茶樹酯型兒茶素生物合成及水解途徑研究進(jìn)展[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 46(11): 2307-2320.

Xia T, Gao L P, Liu Y J, et al. Advances in biosynthesis and hydrolysis of catechins from tea tree[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2013, 46(11): 2307-2320.

[17] 宛曉春. 茶樹次生代謝[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2015.

Wan X C. Secondary metabolism of tea plant [M]. Beijing: Science Press, 2015.

[18] 陸建良, 林晨, 駱穎穎, 等. 茶樹重要功能基因克隆研究進(jìn)展[J]. 茶葉科學(xué), 2007, 27(2): 95-103.

Lu J L, Lin C, Luo Y Y, et al. Advances in cloning of important functional genes from[J]. Journal of Tea Science, 2007, 27(2): 95-103.

[19] Stafford H A. Flavonoid metabolism pathway to proanthocyanindins (condensed tannins), flavan-3-ols, and unsubstituted flavans [M]. New York: CRC Press, 1990.

[20] Stafford H A, Lester H H. The conversion of ()-dihydromyricetin to its flavan-3, 4-diol (leucodelphinidin) and to ()-gallocatechin by reductase extracted from tissue cultures ofand[J]. Plant Physiology, 1985, 78(4): 791-794.

[21] Punyasiri P, Abeysinghe I, Kumar V, et al. Flavonoid biosynthesis in the tea plant: properties of enzymes of the prominent epicatechin and catechin pathways [J]. Archives of Biochemistry & Biophysics, 2004, 431(1): 22-30.

[22] Niemetz R, Gross G G. Enzymology of gallotannin and ellagitannin biosynthesis [J]. Phytochemistry, 2005, 66(17): 2001-2011.

[23] Gross G G. From lignins to tannins: forty years of enzyme studies on the biosynthesis of phenolic compounds [J]. Phytochemistry, 2008, 69(18): 3018-3031.

[24] Liu Y, Gao L, Liu L, et al. Purification and characterization of a novel galloyltransferase involved in catechin galloylation in the tea plant () [J]. Journal of Biological Chemistry, 2012, 287(53): 44406-44417.

[25] Zhong K, Zhao S Y, J?nsson L J, et al. Enzymatic conversion of epigallocatechin gallate to epigallocatechin with an inducible hydrolase from[J]. Biocatalysis, 2009, 26(4): 306-312.

[26] Wei C, Hua Y, Wang S, et al. Draft genome sequence ofvar.provides insights into the evolution of the tea genome and tea quality [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2018, 115(18): E4151-E4158.

[27] Luo Y, Yu S, Li J, et al. Molecular characterization of WRKY transcription factors that act as negative regulators of O-Methylated catechin biosynthesis in tea plants (L.) [J]. J Agric Food Chem, 2018, 66(43): 11234-11243.

[28] Wang P, Zhang L, Jiang X, et al. Evolutionary and functional characterization of leucoanthocyanidin reductases from[J]. Planta, 2018, 247(1): 139-154.

[29] 牛義嶺, 姜秀明. 植物轉(zhuǎn)錄因子MYB基因家族的研究進(jìn)展[J]. 分子植物育種, 2016, 14(8): 2050-2059.

Niu Y L, Jiang X M. Research progress of plant transcription factor MYB gene family [J]. Molecular Plant Breeding, 2016, 14(8): 2050-2059.

[30] Martin C, Paz-Ares J. MYB transcription factors in plants [J]. Trends in Genetics, 1997, 13(2): 67-73.

[31] Verdonk J C, Haring M A, Tunen A J, et al. ODORANT1 regulates fragrance biosynthesis in[J]. Plant Cell, 2005, 17(5): 1612-1624.

[32] Bomal C, Bedon F, Caron S, et al. Involvement ofMYB1 and MYB8 in phenylpropanoid metabolism and secondary cell wall biogenesis: a comparative in planta analysis [J]. Journal of Experimental Botany, 2008, 59(14): 3925-3939.

[33] Schaart J G, Dubos C, Romero De La Fuente I, et al. Identification and characterization of MYB-bHLH-WD40 regulatory complexes controlling proanthocyanidin biosynthesis in strawberry [J]. The New Phytologist, 2013, 197(2): 454-467.

[34] An X H, Tian Y, Chen K Q, et al. MdMYB9 and MdMYB11 are involved in the regulation of the JA-induced biosynthesis of anthocyanin and proanthocyanidin in apples [J]. Plant Cell Physiol, 2015, 56(4): 650-662.

[35] Tian J, Zhang J, Han Z Y, et al. McMYB12 transcription factors co-regulate proanthocyanidin and anthocyanin biosynthesis in[J]. Scientific Reports, 2017, 7(1): 43715. doi: 10.1038/srep43715.

[36] James A M, Ma D, Mellway R, et al. Poplar MYB115 and MYB134 transcription factors regulate proanthocyanidin synthesis and structure [J]. Plant Physiology, 2017, 174(1): 154-171.

[37] Wang N, Qu C, Jiang S, et al. The proanthocyanidin-specific transcription factor MdMYBPA1 initiates anthocyanin synthesis under low temperature conditions in red-fleshed apple [J]. The Plant J, 2018, 96(1): 39-55.

[38] Xu W, Dubos C, Lepiniec L. Transcriptional control of flavonoid biosynthesis by MYB-bHLH-WDR complexes [J]. Trends in Plant Science, 2015, 20(3): 176-185.

[39] Terrier N, Torregrosa L, Ageorges A, et al. Ectopic expression of VvMybPA2 promotes proanthocyanidin biosynthesis in grapevine and suggests additional targets in the pathway [J]. Plant Physiol, 2009, 149(2): 1028-1041.

[40] Gesell A, Yoshida K, Tran L T, et al. Characterization of an apple TT2-type R2R3 MYB transcription factor functionally similar to the poplar proanthocyanidin regulator PtMYB134 [J]. Planta, 2014, 240(3): 497-511.

[41] Mellway R D, Tran L T, Prouse M B et al. The wound-, pathogen-, and ultraviolet B-responsivegene encodes an R2R3 MYB transcription factor that regulates proanthocyanidin synthesis in poplar [J]. Plant Physiology, 2009, 150(2): 924-941.

[42] Stracke R, Werber M, Weisshaar B. The R2R3-MYB gene family in[J]. Curr Opin Plant Biol, 2001, 4(5): 447-456.

[43] Liu R, Wang Y, Tang S, et al. Genome-wide identification of the tea plant bHLH transcription factor family and discovery of candidate regulators of trichome formation [J]. Sci Rep, 2021, 11(1): 10764. doi: 10.21203/rs.3.rs-148784/v1.

[44] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta DeltaC(T)) method [J]. Methods, 2001, 25(4): 402-408.

[45] Chen C, Chen H, Zhang Y, et al. TBtools: an integrative toolkit developed for interactive analyses of big biological data [J]. Mol Plant, 2020, 13(8): 1194-1202.

[46] Dubos C, Stracke R, Grotewold E, et al. MYB transcription factors in[J]. Trends Plant Sci, 2010, 15(10): 573-581.

[47] Stracke R, Ishihara H, Huep G, et al. Differential regulation of closely related R2R3-MYB transcription factors controls flavonol accumulation in different parts of theseedling [J]. Plant J, 2007, 50(4): 660-677.

[48] Gonzalez A, Zhao M, Leavitt J M, et al. Regulation of the anthocyanin biosynthetic pathway by the TTG1/bHLH/Myb transcriptional complex inseedlings[J]. Plant J, 2008, 53(5): 814-827.

[49] Lepiniec L, Debeaujon I, Routaboul J M, et al. Genetics and biochemistry of seed flavonoids [J]. Annu Rev Plant Biol, 2006, 57: 405-430.

[50] Zhong R, Lee C, Zhou J, et al. A battery of transcription factors involved in the regulation of secondary cell wall biosynthesis in[J]. Plant Cell, 2008, 20(10): 2763-2782.

[51] Zhou J, Lee C, Zhong R, et al. MYB58 and MYB63 are transcriptional activators of the lignin biosynthetic pathway during secondary cell wall formation in[J]. Plant Cell, 2009, 21(1): 248-266.

[52] Sun B, Zhu Z, Cao P, et al. Purple foliage coloration in tea (L.) arises from activation of the R2R3-MYB transcription factor CsAN1 [J]. Sci Rep, 2016, 6: 32534. doi: 10.1038/srep32534.

[53] Wang X C, Wu J, Guan M L, et al.MYB4 plays dual roles in flavonoid biosynthesis [J]. Plant J, 2020, 101(3): 637-652.

[54] Ma D, Constabel C P. MYB repressors as regulators of phenylpropanoid metabolism in plants [J]. Trends Plant Sci, 2019, 24(3): 275-289.

[55] Agarwal M, Hao Y, Kapoor A, et al. A R2R3 type MYB transcription factor is involved in the cold regulation of CBF genes and in acquired freezing tolerance [J]. J Biol Chem, 2006, 281(49): 37636-37645.

[56] Kang Y H, Kirik V, Hulskamp M, et al. Thegene provides a positive feedback loop for cell fate specification in theroot epidermis [J]. Plant Cell, 2009, 21(4): 1080-1094.

[57] Jiang X, Huang K, Zheng G, et al. CsMYB5a and CsMYB5e fromdifferentially regulate anthocyanin and proanthocyanidin biosynthesis [J]. Plant Sci, 2018, 270: 209-220.

[58] Wang P, Ma G, Zhang L, et al. A sucrose-induced MYB (SIMYB) transcription factor promoting proanthocyanidin accumulation in the tea plant () [J]. J Agric Food Chem, 2019, 67(5): 1418-1428.

Expression Analysis and Functional Identification ofTranscription Factor in Tea Plants

WANG Yuyuan1, LIU Renjian1, LIU Shaoqun1, SHU Canwei2, SUN Binmei1, ZHENG Peng1*

1. College of Horticulture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 2. College of Agriculture, South China Agricultural University/Guangdong Province Key Laboratory of Microbial Signals and Disease Control/Integrative Microbiology Research Center, Guangzhou 510642, China

Catechin is one of the most characteristic secondary metabolites in tea plants and the main component affecting tea quality and flavor. It possesses rich pharmacological effects, such as anti-oxidation, anti-virus, lipid lowering and weight loss, etc. In this study, the function of a catechin biosynthetic regulator CsTT2 was preliminarily identified using phylogenetic analysis, gene expression pattern analysis and molecular biology experiments. The results show that CsTT2 was a R2R3-MYB transcription factor that shares a branch withthe MYB transcription factor inthat regulates secondary metabolites. The expression levels ofand catechin biosynthesis genes were relatively high in the apical bud tissue of tea plants with higher total catechin content. The results of subcellular localization, yeast assay and dual luciferase reporting system further reveal thatwas located into the nucleus and the protein it encodes possessed transcriptional activation capacity. CsTT2 could bind to the promoter of a key catechin biosynthetic geneto activate its expression.

tea plant, R2R3-MYB transcription factor,, catechin biosynthesis

S571.1

A

1000-369X(2022)04-463-14

2021-12-27

2022-01-19

廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（202102020290）、廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2018A030313089、2021A1515012091）

王玉源，女，碩士研究生，主要從事茶樹遺傳育種與分子生物學(xué)，wangyy@stu.scau.edu.cn。*通信作者：zhengp@scau.edu.cn