響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵蔗渣制備膳食纖維工藝及結(jié)構(gòu)特性分析

張 智，閆建英，馮麗榮，湯華京，宋 偉，薛紅洋

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040；2.黑龍江國宏節(jié)能環(huán)保有限公司，黑龍江哈爾濱 150040）

甘蔗渣通常是甘蔗制糖過程中被壓榨處理后剩余的殘?jiān)?，是甘蔗加工過程中的副產(chǎn)物，我國每年有大量的甘蔗渣被廢棄，應(yīng)該對其進(jìn)行充分的處理和加工，避免造成資源浪費(fèi)。由于甘蔗渣中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素成分居多，因此甘蔗渣中膳食纖維含量較高。膳食纖維對人體的健康起著重要的作用，既可促進(jìn)健康又可預(yù)防疾病。根據(jù)其溶解性的不同，將膳食纖維分為可溶性膳食纖維和不可溶性膳食纖維。相比于不可溶膳食纖維，可溶性膳食纖維能量低，吸水性強(qiáng)，可以使人產(chǎn)生飽腹感，可以控制肥胖、調(diào)節(jié)血糖，減少高血壓等疾病。因此學(xué)者致力于利用各種方法來提高可溶性膳食纖維的含量。

目前常用的膳食纖維的制備方法有化學(xué)法、物理法、酶法和微生物發(fā)酵法等。微生物發(fā)酵法作為一種新型的制備方法，相比酶制劑制備成本較低，操作簡便且安全性較高。對于微生物法制備膳食纖維的報道常見的是利用保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、乳酸菌、黑曲霉、綠色木霉、紅曲霉等。保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌是酸奶生產(chǎn)所用常規(guī)菌種，對于溫度、氧氣等發(fā)酵條件要求嚴(yán)苛；黑曲霉等絲狀真菌發(fā)酵時間較長、發(fā)酵條件需氧且固態(tài)發(fā)酵時容易產(chǎn)生孢子，形態(tài)不佳導(dǎo)致其應(yīng)用比較受限。相較而言，枯草芽孢桿菌發(fā)酵時間較短，培養(yǎng)條件粗放，生長溫度范圍較寬，且菌體自身能合成消化性酶類，如蛋白酶、纖維素酶等，還能夠直接分泌到培養(yǎng)基中發(fā)揮作用。閔鐘熳等利用枯草芽孢桿菌為發(fā)酵菌種，制備米糠粕中可溶性膳食纖維，提取率為12.88%。對于甘蔗渣中膳食纖維制備報道較少，林杰等利用酶法制備蔗渣膳食纖維，利用發(fā)酵法制備蔗渣中膳食纖維對于蔗渣利用具有重要意義。

本研究以枯草芽孢桿菌為發(fā)酵菌種，利用微生物發(fā)酵法從蔗渣中制備可溶性膳食纖維，利用響應(yīng)面法對工藝流程進(jìn)行優(yōu)化，提高可溶性膳食纖維的提取率，通過對比持水性、持油性及膨脹力，分析發(fā)酵后理化性質(zhì)的改變；利用掃描電鏡、紅外光譜及X-射線分析發(fā)酵處理前后膳食纖維的結(jié)構(gòu)變化，并對其抗氧化活性進(jìn)行研究。本研究旨在提高蔗渣中可溶性膳食纖維的含量，改善其膳食纖維理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特性，從而提高蔗渣資源的利用率，減少資源浪費(fèi)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮甘蔗渣 廣西南寧甘蔗榨汁后副產(chǎn)物；枯草芽孢桿菌B01 東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院食品微生物實(shí)驗(yàn)室保存；其他試劑均為分析純；斜面培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，瓊脂20.0 g/L，pH7.4；種子培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，pH7.4；蔗渣發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗渣粉20.0 g/L，磷酸氫二鉀2.5 g/L，磷酸氫二鈉2.5 g/L，蛋白胨2.0 g/L，酵母浸粉0.5 g/L，pH7.2±0.2。

THZ-98A 振蕩培養(yǎng)箱 上海一恒公司；STIK高壓滅菌器 美國STIK 公司；JSM-7500F 掃描電鏡日本JEOL 公司；Spectrum 400 傅里葉紅外光譜美國Thermo Nicolet 公司；X,Pert3 PowedrX 射線衍射儀 荷蘭馬爾文帕納科儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蔗渣預(yù)處理 利用粉碎機(jī)粉碎蔗渣，50 ℃烘干后過80 目篩備用。

1.2.2 發(fā)酵法蔗渣膳食纖維制備工藝 配制蔗渣發(fā)酵培養(yǎng)基50 mL，121 ℃滅菌20 min，待冷卻后，按照一定的比例接種枯草芽孢桿菌B01，在37 ℃、120 r/min 條件下?lián)u床培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后，4000 r/min離心10 min，沉淀即為不可溶膳食纖維（IDF），上清液加入4 倍體積95%乙醇過夜醇沉后在4000 r/min條件下離心10 min，干燥所得沉淀即為可溶性膳食纖維（SDF），收集稱重。

膳食纖維提取率公式：

式中：m 表示蔗渣原料的質(zhì)量，g；m表示可溶性膳食纖維質(zhì)量，g；m表示不可溶性膳食纖維質(zhì)量，g。

1.2.3 發(fā)酵法制備可溶性膳食纖維的單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 發(fā)酵時間對SDF 提取率的影響 配制七組50 mL 蔗渣發(fā)酵培養(yǎng)基，每組三個平行樣，調(diào)節(jié)pH 為7，121 ℃、20 min 滅菌冷卻后，按照6%的接種量接入已活化的枯草芽孢桿菌，在37 ℃發(fā)酵溫度下分別搖瓶發(fā)酵24、36、48、60、72、84、96 h，計算SDF 的提取率。

1.2.3.2 接種量對SDF 提取率的影響 配制七組50 mL 蔗渣發(fā)酵培養(yǎng)基，每組三個平行樣，調(diào)節(jié)pH為7，121 ℃、20 min 滅菌冷卻后，分別按照2%、4%、6%、8%、10%、12%和14%的接種量接入已活化的枯草芽孢桿菌，在37 ℃發(fā)酵溫度下?lián)u瓶發(fā)酵48 h后，計算SDF 的提取率。

1.2.3.3 培養(yǎng)基pH 對SDF 提取率的影響 配制六組50 mL 蔗渣發(fā)酵培養(yǎng)基，每組三個平行樣，分別調(diào)節(jié)pH 為4、5、6、7、8 和9。121 ℃、20 min 滅菌冷卻后，按照6%的接種量接入已活化的枯草芽孢桿菌，在37 ℃發(fā)酵溫度下?lián)u瓶發(fā)酵48 h 后，計算SDF的提取率。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化可溶性膳食纖維制備工藝 以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)Box-Behnken 設(shè)計原理，以發(fā)酵時間、接種量及培養(yǎng)基pH 作為響應(yīng)因素，以可溶性膳食纖維（SDF）的提取率作為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平的分析實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個平行樣，取平均值，對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析及顯著性檢驗(yàn)，確定最佳工藝。試驗(yàn)因素水平如表1 所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.5 持水力、持油力及膨脹力的測定 對發(fā)酵前及發(fā)酵后的膳食纖維進(jìn)行持水力、持油力及膨脹率的測定。

1.2.5.1 持水力 參照文獻(xiàn)[20]的方法，取50 mL離心管稱重記為m，準(zhǔn)確稱取1 g 膳食纖維（記為m）加入離心管，室溫下加入25 mL 蒸餾水，不斷攪拌30 min 后離心，去上清液后用濾紙濾干，稱取其質(zhì)量記為m。

1.2.5.2 持油力 參照文獻(xiàn)[20]的方法，取50 mL離心管稱重記為m，準(zhǔn)確稱取1 g 膳食纖維（記為m）加入離心管，室溫下加入25 mL 油，不斷攪拌30 min 后離心，去上清液后用濾紙吸干油分，稱取其質(zhì)量記為m。

1.2.5.3 膨脹力 參照文獻(xiàn)[20]的方法，將0.5 g 膳食纖維（記為m）置于10 mL 量筒中，體積記為V，室溫下加入5 mL 蒸餾水放置24 h，體積記為V。

1.2.6 膳食纖維的結(jié)構(gòu)測定

1.2.6.1 電鏡檢測 參照文獻(xiàn)[21]將發(fā)酵前和發(fā)酵后的膳食纖維樣品放置于烘箱中，干燥至質(zhì)量恒定，利用掃描電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)，進(jìn)行分析比較。

1.2.6.2 紅外光譜分析 參照文獻(xiàn)[21]分別取兩種微量樣品研磨壓片后，在4000～400 cm范圍內(nèi)進(jìn)行紅外測定，并對比分析結(jié)果。

1.2.6.3 X-射線衍射分析 參照文獻(xiàn)[22]通過X-射線衍射儀測定發(fā)酵前和發(fā)酵后膳食纖維的晶體結(jié)構(gòu)，取適量樣品，磨細(xì)后放入樣品槽，用表面光滑的玻璃板壓實(shí)表面，將樣品槽插入儀器測定，對其進(jìn)行定性定量分析。

1.2.7 抗氧化活性測定

1.2.7.1 DPPH 自由基清除力的測定 參照涂宗財?shù)鹊姆椒ú⑸宰龈膭?，將發(fā)酵前后膳食纖維配制成不同濃度梯度的溶液，實(shí)驗(yàn)組：取1 mL 樣品與1 mL 0.1 mmol/L 的DPPH-乙醇混合溶液，反應(yīng)30 min，在517 nm 處測定各濃度膳食纖維溶液的吸光度值，記為A；對照組：以乙醇代替DPPH 與樣品反應(yīng)測得吸光度值記為A；空白組：用蒸餾水代替樣品在同等條件下測定吸光度值，標(biāo)記為A；陽性對照組：相同濃度的V溶液，計算DPPH 自由基清除能力公式如下：

1.2.7.2 還原力的測定 參照鐵氰化鉀法，將發(fā)酵前后膳食纖維配制成不同濃度梯度的溶液，然后依次加入2.5 mL 0.2 mol/L 的PBS 緩沖液和2.5 mL 1%的KFe（CN）溶液，輕輕搖勻后將混合溶液在50 ℃條件下恒溫反應(yīng)20 min，再加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，6000 r/min 離心10 min 后吸取上清液2.5 mL，再依次加入2.5 mL 去離子水、1.0 mL 濃度為0.1%的FeC1。以雙蒸水為參照用紫外分光光度計在700 nm 處測定吸光值，并用V作為陽性參照。

1.2.7.3 羥基自由基清除力的測定 參照文獻(xiàn)[25]的方法，將發(fā)酵前后膳食纖維配制成不同濃度梯度的溶液，實(shí)驗(yàn)組：取1 mL 樣品依次加入1.0 mL 9 mmol/L的硫酸亞鐵溶液、1.0 mL 9 mmol/L 的水楊酸溶液和0.5 mL 0.1%的過氧化氫溶液后搖勻，在37 ℃下反應(yīng)30 min 后在510 nm 波長條件下測定吸光度值，記為A；對照組：以蒸餾水代替硫酸亞鐵溶液、過氧化氫溶液和水楊酸與樣品反應(yīng)，相同條件下所測得的吸光度值記為A；空白組：用蒸餾水代替樣品溶液，測定同樣的條件下的吸光度值記為A；陽性對照組：相同濃度的V溶液，計算羥基自由基清除率公式如下：

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均平行測定3 次，基礎(chǔ)數(shù)據(jù)采用Excel 處理，響應(yīng)面試驗(yàn)由Design Expert 8.0.6 進(jìn)行設(shè)計分析，作圖采用Origin2021b 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵時間對SDF 提取率的影響 圖1 結(jié)果顯示，在發(fā)酵初期，隨著時間的增長，蔗渣SDF 的提取率也逐漸上升，發(fā)酵時間在72 h 的時候，SDF 提取率達(dá)到最大，之后就呈現(xiàn)下降趨勢，這與閔鐘熳等研究結(jié)果相似。這是由于隨著時間的增長，菌體也在逐漸增長和繁殖，分泌的降解酶也逐漸增多，對底物逐漸進(jìn)行分解利用，積累的SDF 也逐漸增多，而在72 h之后，SDF 提取率開始下降，可能是細(xì)菌生長到達(dá)了發(fā)酵后期，菌體逐漸開始死亡，所以發(fā)酵效率開始逐漸降低，也可能由于發(fā)酵后期底物中的營養(yǎng)物質(zhì)不足以提供菌體生長繁殖，導(dǎo)致SDF 積累減少，所以，最適發(fā)酵時間為72 h。

圖1 發(fā)酵時間對蔗渣SDF 提取率的影響Fig.1 Effect of fermentation time on extraction rate of bagasse soluble dietary fiber

2.1.2 接種量對SDF 提取率的影響 由圖2 可知在接種量為2%～10%之間，隨著接種量的增大，SDF 的提取率也在逐漸增大，接種量達(dá)到10%時，SDF 提取率達(dá)到了最大值，接種量大于10%后，SDF 提取率開始下降。許睿娉研究發(fā)現(xiàn)在裝液量為50 mL時，枯草芽孢桿菌最佳接種量為10%；隨著接種量的增大，菌體生長繁殖逐漸旺盛，對底物充分利用，分泌的酶量也逐漸增多，將會促進(jìn)SDF 的積累，在接種量達(dá)到10%時，SDF 提取率達(dá)到了最大值，提高接種量到12%的時候，SDF 提取率開始下降，可能是由于菌體生長繁殖過于旺盛，底物營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足以促使分解，開始逐漸消耗積累的膳食纖維，造成SDF 的含量下降，所以最適接種量為10%。

圖2 接種量對蔗渣SDF 提取率的影響Fig.2 Effect of inoculation amount on extraction rate of bagasse soluble dietary fiber

2.1.3 pH 對SDF 提取率的影響 由圖3 可知培養(yǎng)基pH 在7 時，蔗渣SDF 提取率達(dá)到了最大值，這與閔鐘熳等研究發(fā)現(xiàn)利用枯草芽孢桿菌制備米糠粕中膳食纖維時，最佳發(fā)酵pH 為7 的結(jié)果一致，在pH 偏酸性或者堿性時，SDF 提取率均較低，這可能是由于菌體的最適pH 為7，微生物在生長繁殖時都有一定最適的pH 范圍，查閱資料可知大多數(shù)細(xì)菌生長的最適范圍在6.3～7.5。且芽孢桿菌芽孢形成最適pH 為6.5～7.8，而且當(dāng)pH 在最適范圍內(nèi)時其芽孢的形成量比較恒定。所以此時菌體生長最好，分解效率也最高，所以最佳pH 為7。

圖3 pH 對蔗渣SDF 提取率的影響Fig.3 Effect of pH on extraction rate of bagasse soluble dietary fiber

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果 以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)Box-Behnken 設(shè)計原理，以發(fā)酵時間、接種量及培養(yǎng)基pH 作為響應(yīng)因素，以可溶性膳食纖維的提取率（SDF）作為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平的分析實(shí)驗(yàn)，對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析及顯著性檢驗(yàn)，確定最佳工藝，結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental scheme and results of Box-Behnken design

2.2.2 回歸方程與方差分析 對回歸模型進(jìn)行方差分析（表3），可知值＜0.0001，表明回歸方程達(dá)到了極顯著水平，模型顯著回歸。模型失擬項(xiàng)值為0.6869，大于0.05，表示失擬項(xiàng)不顯著，實(shí)驗(yàn)誤差較小，擬合度高。顯著性檢驗(yàn)表明二次項(xiàng)C表現(xiàn)極為顯著，而二次項(xiàng)A、B和交互項(xiàng)BC 表現(xiàn)顯著，說明這些因素對蔗渣SDF 提取率的影響較大。由值的大小可知影響因素影響大小順序：接種量＞pH＞發(fā)酵時間。回歸模型=0.9749，大于90%，代表其相關(guān)性較好；=0.9427 說明有94.27%的SDF 提取率變異分布在3 個相關(guān)因素中。此模型回歸方程為：Y=17.92-0.19A+0.40B-0.34C-0.21AB+0.79AC-1.05BC-2.51A-2.60B-4.12C。分析結(jié)果表明利用響應(yīng)面法設(shè)計所得的回歸模型適用于蔗渣SDF 制備實(shí)驗(yàn)。

表3 回歸模型的方差分析和顯著性檢驗(yàn)Table 3 Analysis of variance and significance test of regression model

2.2.3 響應(yīng)面圖分析 表3 顯示，＞＞，比較值可知發(fā)酵時間與接種量的交互作用對蔗渣膳食纖維制備量干擾最小，而接種量與pH 的交互作用對蔗渣膳食纖維制備量干擾最大。根據(jù)發(fā)酵時間、接種量、pH 三個因素交互作用與響應(yīng)值的關(guān)系得出三維響應(yīng)面和等高線，結(jié)果見圖4。響應(yīng)面坡度越陡、等高線越接近橢圓且越稀疏，代表兩兩因素交互作用對響應(yīng)值的影響越顯著，響應(yīng)值的改變越敏感；可以看出，BC 曲面拱形明顯更陡峭，等高線為橢圓形且相對稀疏，其次是AC，這說明接種量與pH 交互作用最顯著，其次顯著的是發(fā)酵時間和pH 的交互作用，而AB 曲面拱形不明顯，等高線形狀較圓潤且相對密集，說明發(fā)酵時間和接種量之間的交互作用不顯著，這與方差分析結(jié)果一致。通過Design Expert 8.0.6軟件分析模型確定微生物發(fā)酵制備蔗渣膳食纖維最優(yōu)工藝條件為：接種量10.18%、pH 為6.94、發(fā)酵時間71.4 h，理論值為18.732%，為方便實(shí)際生產(chǎn)，對各因素進(jìn)行了調(diào)整：接種量10%、pH 為7、發(fā)酵時間71 h，在此條件下蔗渣SDF 提取率為17.95%，與理論值相差0.782%，表明實(shí)測值和理論值擬合度較高。

圖4 各因素交互作用對SDF 提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface plots of the effects of factors on the extraction rate of soluble dietary fiber

2.3 理化性質(zhì)的測定

發(fā)酵前（DF）和發(fā)酵后膳食纖維（F-DF）的持水力、持油力及膨脹力如表4 所示：

表4 發(fā)酵前和發(fā)酵后膳食纖維的理化性質(zhì)Table 4 Physicochemical properties of dietary fiber before and after fermentation

由表可知，發(fā)酵后的膳食纖維持水力、持油力及膨脹力均優(yōu)于未發(fā)酵原料，說明在經(jīng)過發(fā)酵處理后，蔗渣的理化性質(zhì)發(fā)生了變化，在持水、持油及膨脹性方面都有所提升。李楊等提出持水性更高可能是由于可溶性膳食纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，所以得出經(jīng)過發(fā)酵處理后，蔗渣致密的結(jié)構(gòu)遭到破壞，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)疏松，產(chǎn)生更多的可溶性膳食纖維，所以持水性更強(qiáng)，同時也有利于水油分子進(jìn)入，改善其膨脹性。

2.4 結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 微觀結(jié)構(gòu)測定 圖5 是發(fā)酵前（DF）及發(fā)酵后膳食纖維（F-DF）放大500 倍的微觀結(jié)構(gòu)圖。從圖中可以看出經(jīng)過發(fā)酵處理的膳食纖維與原料的表觀并未發(fā)生太大的變化，發(fā)酵前原料表面光滑，結(jié)構(gòu)致密，呈現(xiàn)大塊狀。經(jīng)過發(fā)酵處理后，膳食纖維顆粒變小，表面出現(xiàn)裂紋，有球狀顆粒物附著且結(jié)構(gòu)較疏松，可能是由于細(xì)菌分泌的降解酶對纖維素進(jìn)行了降解。且發(fā)酵后膳食纖維棱角明顯，呈現(xiàn)片層狀態(tài)，纖維素降解酶將膳食纖維分解成塊狀及片層狀，這說明發(fā)酵處理都對蔗渣原料進(jìn)行了不同程度的降解，并對其微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行了改善。

圖5 發(fā)酵前和發(fā)酵后膳食纖維掃描電子顯微鏡圖Fig.5 Scanning electron microscopy of dietary fiber before and after fermentation

2.4.2 紅外光譜 圖6 為發(fā)酵前和發(fā)酵后膳食纖維的傅里葉紅外光譜分析圖，圖中3429 cm出現(xiàn)的吸收峰是由于纖維素和半纖維素O-H 伸縮振動，代表分子間氫鍵形成，發(fā)酵后膳食纖維F-DF 在此處吸收峰的強(qiáng)度比發(fā)酵前原料DF 更強(qiáng)，說明經(jīng)過發(fā)酵處理F-DF 發(fā)生糖苷鍵斷裂，促使合成氫鍵的羥基增多，導(dǎo)致其內(nèi)部締合的氫鍵較多；1603 cm處出現(xiàn)的峰可能是多糖分子中羰基的吸收峰，由C=O 鍵伸縮振動引起，表明其中存在糖醛酸，此處F-DF 吸收峰強(qiáng)度增大，代表經(jīng)過發(fā)酵及酶處理，樣品中糖醛酸增多；1354 cm處的吸收峰是由于纖維素與半纖維素結(jié)構(gòu)的O-H 或C-O 基團(tuán)的伸縮振動，而1054 cm處的吸收峰可能源于纖維素和半纖維素C-O 的伸縮振動，兩種纖維素吸收峰在此處稍減弱，表明經(jīng)過發(fā)酵處理樣品中纖維素和半纖維素減少；551 cm處的吸收峰可能是-C-H 的振動特征峰。說明經(jīng)過處理之后纖維素和半纖維素發(fā)生降解，晶體結(jié)構(gòu)被破壞導(dǎo)致結(jié)晶度減小，且發(fā)酵處理對于纖維素及半纖維素降解更加徹底。

圖6 發(fā)酵前和發(fā)酵后膳食纖維傅里葉紅外光譜圖Fig.6 Fourier transform infrared spectra of dietary fiber before and after fermentation

2.4.3 X-射線結(jié)構(gòu)分析 對發(fā)酵前和發(fā)酵后膳食纖維進(jìn)行X-射線衍射分析，如圖7 所示，衍射角2在15°～25°的范圍內(nèi)均出現(xiàn)了衍射峰，符合I 型纖維素曲線的特征，圖中經(jīng)過發(fā)酵處理的樣品衍射峰出現(xiàn)的位置和峰形都未發(fā)生改變，說明經(jīng)過發(fā)酵處理并沒有改變膳食纖維的的結(jié)晶構(gòu)型，而經(jīng)過發(fā)酵處理后的膳食纖維衍射峰強(qiáng)度減弱，說明經(jīng)過發(fā)酵處理之后纖維素和半纖維素發(fā)生降解，晶體結(jié)構(gòu)被破壞導(dǎo)致結(jié)晶度減小，且發(fā)酵處理對于纖維素及半纖維素降解更加徹底。

圖7 發(fā)酵前和發(fā)酵后膳食纖維X-射線衍射光譜Fig.7 X-ray diffraction pattern of dietary fiber before and after fermentation

2.5 抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 DPPH 自由基清除力 圖8 中分別描述了發(fā)酵前及發(fā)酵后膳食纖維的DPPH 自由基清除能力，以V作為對照。整體來看DPPH 自由基清除力V＞F-DF＞DF，V的DPPH 自由基清除力一直處于平穩(wěn)狀態(tài)，發(fā)酵前（DF）和發(fā)酵后（F-DF）膳食纖維DPPH自由基清除力均隨質(zhì)量濃度的增大而增大，且發(fā)酵后膳食纖維的DPPH 自由基清除力逐漸接近V，在質(zhì)量濃度為6 mg/mL 時DPPH 自由基清除率達(dá)到了82.91%，與V相差較小。張志旭等研究發(fā)現(xiàn)苦瓜膳食纖維在質(zhì)量濃度為5 mg/mL 時DPPH 自由基清除率也達(dá)到了80%左右。結(jié)果證明在質(zhì)量濃度為6 mg/mL 時F-DF 有良好的DPPH 自由基清除能力，與未發(fā)酵原料DF 相比，經(jīng)過發(fā)酵法所得的膳食纖維的DPPH 自由基清除率提高了32.9%，可能是經(jīng)過發(fā)酵處理，菌體分泌降解酶，作用后使膳食纖維中還原糖含量增多，使得其DPPH 自由基清除能力增強(qiáng)，表現(xiàn)出更優(yōu)的清除能力。

圖8 發(fā)酵前和發(fā)酵后膳食纖維DPPH 自由基清除能力Fig.8 DPPH radical scavenging ability of dietary fiber before and after fermentation

2.5.2 還原力 圖9 表示發(fā)酵前及發(fā)酵后膳食纖維的還原力，以V作為對照。隨著質(zhì)量濃度的增高，V、F-DF、DF 均呈現(xiàn)遞增趨勢，且V表現(xiàn)出較強(qiáng)的還原力，F(xiàn)-DF 次之。經(jīng)過發(fā)酵處理的膳食纖維還原力更接近V，在質(zhì)量濃度為6 mg/mL 時還原力達(dá)到了0.89，相較于未發(fā)酵膳食纖維DF 還原力提高了0.70。賈瑋等研究發(fā)現(xiàn)木瓜果皮中膳食纖維還原力為0.43±0.01，與其相比，發(fā)酵后的蔗渣膳食纖維還原力更高，可能是經(jīng)過發(fā)酵處理使樣品中可溶性膳食纖維積累量增多，使其表現(xiàn)出良好的還原性。

圖9 發(fā)酵前和發(fā)酵后膳食纖維還原力Fig.9 Reducing force of dietary fiber before and after fermentation

2.5.3 羥基自由基清除力 圖10 表示發(fā)酵前及發(fā)酵后膳食纖維的羥基自由基清除能力，以V作為對照。V表現(xiàn)出很強(qiáng)的羥基自由基清除能力，一直趨于一個穩(wěn)定的狀態(tài)，接近100%，F(xiàn)-DF 和DF 的羥基清除力隨著質(zhì)量濃度的增大而增大，且F-DF 羥基清除力整體大于DF，并逐漸趨向于V，在質(zhì)量濃度為9 mg/mL 時F-DF 羥基清除力達(dá)到了78.53%，相較于未發(fā)酵膳食纖維DF 羥基清除率提高了50.55%。證明經(jīng)過發(fā)酵處理的膳食纖維具有良好的羥基自由基清除能力。

圖10 發(fā)酵前和發(fā)酵后膳食纖維羥基自由基清除能力Fig.10 Hydroxyl radical scavenging ability of dietary fiber before and after fermentation

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以甘蔗渣作為原料，枯草芽孢桿菌作為發(fā)酵菌種，利用微生物發(fā)酵法進(jìn)行可溶性膳食纖維的制備，以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，利用Box-Behnken設(shè)計響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析得到最佳制備工藝為：接種量10.18%、pH 為6.94、發(fā)酵時間71.4 h，在該條件下重復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，對各因素進(jìn)行調(diào)整為接種量10%、pH 為7、發(fā)酵時間71 h，在此條件下蔗渣SDF提取率為17.95%，與理論值相差0.782%，表明實(shí)測值和理論值擬合度較高。利用持水力、持油力及膨脹力作為指標(biāo)，分析發(fā)酵前后膳食纖維理化性質(zhì)的變化，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過發(fā)酵處理理化性質(zhì)改善；對經(jīng)過發(fā)酵前后膳食纖維進(jìn)行掃描電鏡、紅外光譜及X-射線衍射分析，超微結(jié)構(gòu)顯示發(fā)酵后的膳食纖維疏松多孔，呈現(xiàn)片層狀，表明發(fā)酵處理對蔗渣原料進(jìn)行了降解，使其變得疏松柔軟；紅外圖譜結(jié)果表明發(fā)酵所得膳食纖維與原料相比，發(fā)酵后膳食纖維的吸收峰強(qiáng)度增大，經(jīng)過降解糖醛酸增多。X-射線衍射圖譜表明發(fā)酵后膳食纖維符合I 型纖維素曲線的特征，但相比原料衍射峰強(qiáng)度減弱，即經(jīng)過發(fā)酵處理，原料中纖維素發(fā)生降解，纖維的結(jié)晶區(qū)域被破壞。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明，在質(zhì)量濃度為6 mg/mL 時，發(fā)酵后膳食纖維表現(xiàn)出較強(qiáng)的DPPH 自由基清除力、相對還原力分別達(dá)到了82.91%、0.89，在質(zhì)量濃度為9 mg/mL 時羥基自由基清除力達(dá)到了78.53%，接近于V，表明經(jīng)過發(fā)酵處理可以可以改善膳食纖維理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)，有效提高膳食纖維的體外抗氧化活性。

本試驗(yàn)利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備膳食纖維，SDF 提取率略高于保加利亞乳桿菌及嗜熱鏈球菌發(fā)酵制備的SDF，可能是由于枯草芽孢桿菌可以直接分泌大量纖維素酶等消化酶類作用于蔗渣；相較于黑曲霉等絲狀真菌制備膳食纖維，雖然枯草芽孢桿菌制備膳食纖維發(fā)酵時間更短，且在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生多種物質(zhì)抑制病原微生物，但枯草芽孢桿菌SDF 提取率略低于黑曲霉發(fā)酵SDF 提取率，這是由于絲狀真菌中纖維素酶含量較高，這也正是本實(shí)驗(yàn)的不足之處，因此，還有待進(jìn)一步深入尋找能夠高效降解纖維素且發(fā)酵時間較短且過程簡易的菌株。經(jīng)過枯草芽孢桿菌制備的膳食纖維粒徑變小蔗渣膳食纖維理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特性都有所改善，可溶性膳食纖維含量增多，持水膨脹性變強(qiáng)，可以增加飽腹感；結(jié)構(gòu)疏松，入口更加柔軟，促進(jìn)腸道蠕動，使其成為優(yōu)質(zhì)膳食纖維的制備原料，提高了蔗渣在食品工業(yè)中的利用率，為蔗渣的有效利用提供了依據(jù)，減少了資源浪費(fèi)。