發(fā)酵玉米粉酶解液制備天然鮮味料

盧慧芳，上官玲玲，夏會(huì)麗，宋慶怡，李 沛，李 庫(kù)，陳 雄，代 俊,

（1.發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北省工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北省工業(yè)發(fā)酵協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北武漢 430068；2.安琪酵母股份有限公司酵母功能湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北宜昌 443000）

在食品中添加鮮味料可增強(qiáng)食品的風(fēng)味特征，如持續(xù)性、溫和感、濃厚感等。近年來(lái)，隨著市場(chǎng)巨大消費(fèi)潛力的釋放，傳統(tǒng)的鮮味產(chǎn)品已不能滿足消費(fèi)者對(duì)健康和新口味的追求，美味、安全、健康、天然的新型發(fā)酵調(diào)味產(chǎn)品逐漸在國(guó)內(nèi)外成為一種趨勢(shì)，特別是營(yíng)養(yǎng)型鮮味調(diào)味產(chǎn)品數(shù)量逐年增長(zhǎng)。目前，我國(guó)批準(zhǔn)許可使用的鮮味調(diào)味料有L-谷氨酸鈉（MSG）、5′-鳥苷酸二鈉（GMP）、5′-肌苷酸二鈉（IMP）、5′-呈味核苷酸二鈉、琥珀酸二鈉、L-丙氨酸、甘氨酸，以及植物水解蛋白（HVP）、動(dòng)物水解蛋白（HAP）、酵母抽提物（Yeast extracts）等。這幾類鮮味調(diào)味料中最主要的，應(yīng)用最廣的是L-谷氨酸鈉，俗稱味精。

谷氨酸的制備方法有多種，主要為蛋白質(zhì)水解法、合成法和發(fā)酵法。發(fā)酵法是國(guó)內(nèi)外普遍采用的方法，發(fā)酵菌株主要為谷氨酸棒狀桿菌（）。我國(guó)谷氨酸發(fā)酵水平長(zhǎng)期居于世界領(lǐng)先水平。谷氨酸發(fā)酵基本工藝為淀粉水解制成糖后，配制成發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)，然后通過(guò)等電等方法分離純化，再精制成為谷氨酸鈉結(jié)晶。因傳統(tǒng)發(fā)酵工藝存在原料來(lái)源不清潔、發(fā)酵產(chǎn)物雜質(zhì)多、產(chǎn)物需要純化等問(wèn)題，不適合用于天然調(diào)味品的生產(chǎn)。

以天然植物來(lái)源玉米粉進(jìn)行發(fā)酵可實(shí)現(xiàn)鮮味料的天然化。玉米粉是指由玉米去麩研磨之后所形成的粉末狀物質(zhì)，里面包含除玉米皮之外的所有成分，如蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、維生素、礦物質(zhì)等，物產(chǎn)資源豐富，但僅作為糧食而言，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較低，所以對(duì)玉米的深加工及多方面的應(yīng)用尤為重要。然而，目前用玉米粉作為原料發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸的研究較少，微生物直接利用玉米發(fā)酵的效率不高，如果將玉米粉中25%的碳水化合物經(jīng)淀粉酶酶解后，可作為優(yōu)質(zhì)碳源供微生物生長(zhǎng)利用。此外，酵母抽提物是發(fā)酵工業(yè)中的主要原料之一，營(yíng)養(yǎng)豐富，可以大大提高菌種的生產(chǎn)速率及發(fā)酵產(chǎn)品得率，常作為氮源使用。同時(shí)酵母抽提物也是一種優(yōu)良的天然調(diào)味料，其主要成分為多肽、氨基酸、呈味核苷酸、B 族維生素及微量元素。這兩者共同發(fā)酵制備天然鮮味料，可大大提高發(fā)酵生產(chǎn)獲得鮮味調(diào)味品的可能性，豐富天然鮮味料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，使其風(fēng)味更加細(xì)膩，口感更加自然、順暢，同時(shí)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品天然化。

為提高玉米粉的利用率，生產(chǎn)更加美味、安全、健康、天然的新型鮮味調(diào)味品。本文以玉米粉為原料利用谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)天然鮮味料，首先通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化玉米粉酶解工藝，然后在搖瓶水平對(duì)谷氨酸棒桿菌GL-6 發(fā)酵產(chǎn)谷氨酸的條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳氮源及含量和最佳玉米粉酶解液添加量，接著在20 L 發(fā)酵罐中進(jìn)行驗(yàn)證，并將發(fā)酵液離心后噴霧干燥制成天然鮮味產(chǎn)品，最后評(píng)價(jià)其指標(biāo)。本研究以期得到綠色、健康、安全，且更具市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的新產(chǎn)品，為天然植物來(lái)源為底物發(fā)酵生產(chǎn)新型鮮味料提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

谷氨酸棒桿菌GL-6（GL-6） 由湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏；玉米粉 河南省璞陽(yáng)縣英倫玉米加工有限公司；淀粉酶AHA-400（酶活4000 U/mL） 安琪酵母股份有限公司；酵母抽提物FA31、FIG12LS、FM888、KA02、KU012 安琪酵母股份有限公司；食品級(jí)麥芽糊精（純度98%） 浙江一諾生物科技有限公司。

玉米粉具體成分如表1 所示。

表1 玉米粉營(yíng)養(yǎng)成分Table 1 Nutritional composition of corn meal

20 L 發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備工程有限公司；SBA-40X 型生物傳感儀 濟(jì)南延和生物科技有限公司；V-1300 型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美析儀器有限公司；HH-2 型電子恒溫不銹鋼水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司；FE28 型pH 計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Ultimate 3000 型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；HP6890/5975C型氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS） 美國(guó)安捷倫公司；自動(dòng)微萃取裝置及萃取纖維 美國(guó)安捷倫公司；DBWAX 色譜柱 美國(guó)安捷倫公司；B-290 型微型噴霧干燥器 瑞士步琦公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 玉米粉酶解工藝 稱取100 g 玉米粉，加入純水充分溶解，確保溶解完全后總體積為1 L，加入占玉米粉干基1%的淀粉酶AHA-400，于90 ℃水浴鍋中酶解2 h，酶解過(guò)程中每隔0.5 h 用玻璃棒攪拌1 min。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 本研究使用的玉米粉主要成分如表1 所示，為提高玉米粉的利用率，用淀粉酶AHA-400 進(jìn)行酶解，選取固液比、酶添加量（以原料質(zhì)量為基準(zhǔn)）、溫度和時(shí)間這四個(gè)主要影響酶解度（DE 值）大小的因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。在酶添加量1%，溫度90 ℃，酶解時(shí)間2 h 的條件下，研究固液比1:9、1:4、1:2.3、1:1.5 和1:1 對(duì)酶解度的影響；在溫度90 ℃，酶解時(shí)間2 h，固液比1:4 的條件下，研究酶添加量0.5%、1%、2%、3%和4%對(duì)酶解度的影響；在酶添加量1%，酶解時(shí)間2 h，固液比1:4 的條件下，研究酶解溫度75、80、85、90 和95 ℃對(duì)酶解度的影響；在酶添加量1%，溫度85 ℃，固液比1:4 的條件下，研究酶解時(shí)間1、2、3、4 和5 h 對(duì)酶解度和相對(duì)酶解率的影響。

1.2.3 正交試驗(yàn) 以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，選擇四因素三水平作L（3）正交試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表2，以DE 值為考察目標(biāo)分析最佳酶解工藝方案。

表2 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 2 Factors and levels of the orthogonal tests

1.2.4 菌種活化方法 將實(shí)驗(yàn)室斜面保藏的GL-6 接種1 環(huán)到裝有5 mL 的液體培養(yǎng)基的西林瓶中活化，在32 ℃，200 r/min 恒溫培養(yǎng)振蕩器培養(yǎng)24 h 得到一級(jí)種子液。再將一級(jí)種子液按2%的接種量接種至裝有50 mL 液體培養(yǎng)基的250 mL 搖瓶中培養(yǎng)，在30 ℃，200 r/min 條件下培養(yǎng)24 h 得到二級(jí)種子液。將二級(jí)種子液按2%的接種量接種到后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用的培養(yǎng)基中，置于32 ℃，200 r/min 恒溫培養(yǎng)振蕩器進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)。

1.2.5 玉米粉酶解液培養(yǎng)基組分優(yōu)化及添加量的確定 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定培養(yǎng)基組分為：葡萄糖22 g/L，蛋白胨10 g/L，琥珀酸1 g/L，尿素10 g/L，七水硫酸鎂0.4 g/L，蛋氨酸0.5 g/L，磷酸氫二鉀2.4 g/L，生物素0.3 mg/L，一水硫酸錳10 mg/L，維生素B1 0.2 mg/L。用HCl 或NaOH 調(diào)節(jié)pH 至7.0，滅菌條件為121 ℃，20 min。在此基礎(chǔ)上對(duì)氮源及其含量進(jìn)行優(yōu)化，采用不同型號(hào)的酵母抽提物FA31、FIG12LS、FM888、KA02、KU012 替換培養(yǎng)基中的蛋白胨（peptone），在其他實(shí)驗(yàn)條件不變的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，比較GL-6 的生長(zhǎng)情況及生產(chǎn)谷氨酸的能力，確定最佳氮源，并對(duì)其含量進(jìn)行優(yōu)化。

最佳酶解液添加量的確定：玉米粉酶解液用水稀釋至不同濃度，在培養(yǎng)基優(yōu)化后的基礎(chǔ)上，在搖瓶水平添加不同含量玉米粉酶解液（0%、25%、50%、75%、100%）進(jìn)行發(fā)酵，比較GL-6 生產(chǎn)谷氨酸的能力。

1.2.6 玉米粉酶解液培養(yǎng)條件 搖瓶培養(yǎng)條件：在250 mL 搖瓶中裝入50 mL 液體培養(yǎng)基，接入2%的二級(jí)種子液，培養(yǎng)溫度32 ℃，200 r/min，培養(yǎng)48 h。

20 L 發(fā)酵罐培養(yǎng)條件：裝液量60%，接入8%的二級(jí)種子液，通氣量1.2 L/min，罐壓0.03 MPa，消泡劑10 mL，初始pH 為7.5，溫度32 ℃，發(fā)酵周期為52 h。調(diào)控策略為0～44 h 溫度32 ℃，44～52 h 溫度36 ℃；溶氧20%，溶氧與轉(zhuǎn)速偶聯(lián)（轉(zhuǎn)速范圍為100～500 r/min）。發(fā)酵9 h 開(kāi)始持續(xù)補(bǔ)葡萄糖（50%），流速100 mL/h，流加濃氨水控制pH 為7.5。發(fā)酵完成后葡萄糖糖含量低于3 g/L，發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液離心取上清于4 ℃冷藏備用。

1.3 分析方法

1.3.1 酶解度及相對(duì)酶解率的測(cè)定 還原糖含量用3,5-二硝基水楊酸（DNS）比色法測(cè)定。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確配制濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/L 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，以可見(jiàn)分光光度計(jì)吸收波長(zhǎng)為540 nm 測(cè)定的不同葡萄糖濃度的值（OD）為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)方程為Y=1.808X+0.088，其中=0.9997。還原糖計(jì)算公式如下：

DNS 法測(cè)定酶解度即DE（dextrose equivalent）值，計(jì)算公式如下：

相對(duì)酶解率：以1 h 酶解度為酶解率單位1，計(jì)算單位時(shí)間內(nèi)增加的酶解度為相對(duì)酶解率，計(jì)算公式如下：

1.3.2 生物量的測(cè)定 取1 mL 的發(fā)酵液，在離心機(jī)中12000 r/min，離心5 min，去掉上清，加入1 mL 去離子水重懸菌種細(xì)胞，相同條件離心水洗三次，最后用1 mL 去離子水重懸細(xì)胞，適當(dāng)稀釋后以去離子水為對(duì)照在可見(jiàn)光分光光度計(jì)600 nm 處進(jìn)行比色測(cè)定。讀取OD讀數(shù)乘以稀釋倍數(shù)得到的值作為最終OD值。

1.3.3 谷氨酸含量的測(cè)定 使用SBA-40X 型三通道生物傳感儀測(cè)定谷氨酸含量。配制100 g/dL 的谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液作為標(biāo)品定標(biāo)，進(jìn)樣體積為25 μL，定標(biāo)通過(guò)后，根據(jù)儀器檢測(cè)范圍適當(dāng)稀釋待測(cè)樣品，然后測(cè)定讀數(shù)。

1.3.4 鮮味料的制備 將發(fā)酵液離心取上清，在上清液中加5%的麥芽糊精用B-290 型微型噴霧干燥器進(jìn)行噴霧干燥。噴霧干燥的條件為：進(jìn)口溫度120 ℃，出口溫度60 ℃，風(fēng)機(jī)工作效率100%，蠕動(dòng)泵工作效率18%。最終得到粉末狀的樣品即為鮮味料，本文天然鮮味料樣品為MJ（酶解組），鮮味料樣品為CK（對(duì)照組，不加酶解液）。噴霧干燥會(huì)使發(fā)酵液發(fā)生濃縮，得到的鮮味料樣品谷氨酸含量約為發(fā)酵液谷氨酸含量的4 倍左右，且用生物傳感儀和氨基酸分析儀對(duì)谷氨酸含量的檢測(cè)結(jié)果是一致的。

1.3.5 滋味評(píng)定 由12 名實(shí)驗(yàn)室感官評(píng)價(jià)員（6 男6 女），主要從鮮味、咸味、甜味、酸味和苦味5 個(gè)項(xiàng)目進(jìn)行打分，打分分值范圍為0～10 分，0～4 分滋味評(píng)定一般，5～8 分滋味評(píng)定中等，9～10 滋味評(píng)定強(qiáng)烈，隨后取平均值為滋味評(píng)價(jià)結(jié)果。

1.3.6 總氮的測(cè)定 采用凱氏定氮法測(cè)定總氮的含量。

1.3.7 總砷和總鉛的測(cè)定 總砷的含量參考食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《GB 5009.11-2014》進(jìn)行測(cè)定，總鉛的含量參考食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《GB 5009.12-2017》進(jìn)行測(cè)定。

1.3.8 17 種游離氨基酸的測(cè)定 使用氨基酸分析儀測(cè)定17 種游離氨基酸的含量。樣品制備方式為：稱取樣品0.5～1 g（精確到 0.001 g）置于50 mL 容量瓶中。加入20 mL 磺基水楊酸超聲至充分溶解后，定容至50 mL 刻度，充分混勻，靜置1 h 后準(zhǔn)確吸取上清液1 mL 于25 mL 容量瓶中，加入檸檬酸鈉緩沖液定容至刻度，混勻后經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾至進(jìn)樣瓶，待檢。溶劑標(biāo)準(zhǔn)為：氫氧化鈉溶液：500 g/L；磺基水楊酸溶液：50 g/L；檸檬酸鈉緩沖液：pH=2.2。稱取19.6 g 二水合檸檬酸鈉，溶解后轉(zhuǎn)入1000 mL 容量瓶中，加入16.5 mL 濃鹽酸，加水至刻度，混勻。必要時(shí)，可用HCL 或NaOH 調(diào)節(jié)pH 至2.2。

1.3.9 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定 使用氣相-質(zhì)普聯(lián)用儀GC-MS 測(cè)定。樣品處理方式為：稱取1 g（精確到0.001 g）樣品，1.5 g 氯化鈉和10 μL 濃度為1.98 g/L的4-甲基2-戊醇（色譜純）溶于5 mL 去離子水中，經(jīng)過(guò)0.22 μm 濾膜過(guò)濾后取2 mL 放入頂空萃取瓶中并放置于頂空進(jìn)樣器上，樣品吹掃時(shí)間：30 min，樣品預(yù)熱時(shí)間：5 min，樣品解吸附溫度：180 ℃，樣品吹掃溫度：70 ℃。GC 條件為：色譜柱為安捷倫DBWAX 柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），柱溫為40 ℃（保持2 min），以2 ℃·min升溫至250 ℃，保持5 min，總運(yùn)行時(shí)間為112 min，汽化室溫度為250 ℃，載氣為高純度He（99.999%），溶劑延遲時(shí)間為2 min。MS 條件為：離子源為EI 源，離子源溫度為230 ℃，四級(jí)桿溫度為150 ℃，電子源能量為70 eV，激活電壓為1.6 V。用Qualitative Navigator B.08.00 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是三組平行實(shí)驗(yàn)的均值，用Origin Pro2016 軟件作圖，采用Excel 2010 進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米粉酶解工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn) 由圖1a 所示，隨著固液比的增加，酶解度（DE 值）表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，在固液比1:4 時(shí)達(dá)到最大值，之后呈緩慢下降的趨勢(shì)。這是因?yàn)樵诿柑砑恿恳欢〞r(shí)，隨著固液比的增加，淀粉酶與玉米粉在反應(yīng)過(guò)程中達(dá)到飽和平衡點(diǎn)并出現(xiàn)最大值。固液比1:4 時(shí)，DE 值達(dá)到54.64%，因此，1:4 是最佳固液比。

圖1 固液比（A）、酶添加量（B）、溫度（C）和時(shí)間（D）對(duì)玉米粉酶解度的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio （A）, enzyme dosage （B）,temperature （C） and time （D） on enzymatic hydrolysis of corn meal

由圖1b 所示，隨著淀粉酶添加量的增加，DE 值表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，在酶添加量1%時(shí)達(dá)到最大值，之后呈緩慢下降的趨勢(shì)。這是因?yàn)楫?dāng)?shù)孜锍渥銜r(shí)，隨著酶添加量的增加，反應(yīng)速率也隨之增大，并隨著結(jié)合程度逐漸增大，酶與玉米粉在反應(yīng)過(guò)程中達(dá)到飽和平衡點(diǎn)并出現(xiàn)最大值。酶添加量1%時(shí)，DE值達(dá)到55.16%，酶解效果最好。因此，1%是最佳酶添加量。

由圖1c 所示，隨著酶解溫度的升高，DE 值表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)酶解溫度為85 ℃時(shí)，DE 值最大，酶反應(yīng)速率最大。這是由于酶促反應(yīng)都有最適的溫度范圍，酶解溫度過(guò)高和過(guò)低都會(huì)使酶的活力和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致玉米粉酶解不夠充分。當(dāng)酶解溫度為85 ℃時(shí)，DE 值達(dá)到58.05%，酶解效果最好。因此，85 ℃是最佳酶解溫度。

由圖1d 所示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，DE 值表現(xiàn)出持續(xù)上升的趨勢(shì)。這是因?yàn)殡S著酶解時(shí)間的增加，淀粉酶與玉米粉之間充分接觸，使反應(yīng)速度增加，當(dāng)酶解時(shí)間為5 h 時(shí)，DE 值達(dá)到58.92%。但3 h 后DE 值上升緩慢，考慮到不能一味的追求酶解度最高，而忽略時(shí)間成本。因此計(jì)算了相對(duì)酶解率進(jìn)行篩選，比較單位時(shí)間內(nèi)酶解度增加的速率，選擇相對(duì)酶解率高的為最佳，酶解3 h 相對(duì)酶解率達(dá)到3.01，酶解度為57.41%。因此，3 h 是最佳酶解時(shí)間。

2.1.2 正交試驗(yàn) 以上單因素實(shí)驗(yàn)確定了各因素的最佳酶解條件，但各因素之間可能存在交互作用。為進(jìn)一步研究各因素對(duì)玉米粉酶解的影響，采用L（3）4 因素3 水平正交設(shè)計(jì)對(duì)酶解參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果如表3 所示。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Orthogonal experimental design and results

R 值越大，該因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響越大。由表3 所示，各因素影響玉米粉酶解效果的順序?yàn)椋汗桃罕龋ˋ）＞溫度（C）＞時(shí)間（D）＞酶添加量（B）。固液比是主要影響因素，其次是溫度和時(shí)間，酶添加量對(duì)酶解度影響最小。基于以上分析確定最佳酶解工藝條件為ABCD，即固液比1:4，酶添加量1%，溫度90 ℃，時(shí)間3 h。在此最佳條件下，酶解度達(dá)到60.84%。

2.2 C. glutamicum GL-6 發(fā)酵產(chǎn)谷氨酸的條件優(yōu)化

2.2.1 培養(yǎng)基氮源優(yōu)化 采用不同型號(hào)的酵母抽提物FA31、FIG12LS、FM888、KA02、KU012 替換培養(yǎng)基中的蛋白胨（peptone）培養(yǎng)48 h，GL-6 的生長(zhǎng)情況及生產(chǎn)谷氨酸的能力如圖2a、b 所示，用酵母抽提物KA02 培養(yǎng)12 h 后OD值達(dá)到16.49，用蛋白胨培養(yǎng)12 h 后OD值維持在10 左右。酵母抽提物整體比蛋白胨培養(yǎng)效果要好，但數(shù)據(jù)有些波動(dòng)，且每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)相差較小，難以區(qū)分哪種型號(hào)的酵母抽提物培養(yǎng)最佳。用酵母抽提物FIG12LS 培養(yǎng)的谷氨酸含量相對(duì)較多，然而用蛋白胨培養(yǎng)的谷氨酸含量較低。用酵母抽提物FIG12LS培養(yǎng)24 h 后，GL-6 的OD值維持在13.00 和16.00 之間，谷氨酸含量最高為15.4 g/L，是蛋白胨培養(yǎng)的谷氨酸含量最高時(shí)的1.26 倍。酵母抽提物FIG12LS 雖然不是每個(gè)數(shù)據(jù)監(jiān)測(cè)點(diǎn)含量都是最高的，但整體呈逐漸上升趨勢(shì)，處于高點(diǎn)的數(shù)據(jù)監(jiān)測(cè)點(diǎn)較多。因此，選用酵母抽提物FIG12LS 培養(yǎng)效果最佳。

圖2 不同氮源培養(yǎng)對(duì)C. glutamicum GL-6 生物量（a）和谷氨酸含量（b）的影響Fig.2 Effects of different nitrogen sources on C. glutamicum GL-6 biomass （a） and glutamate content （b）

2.2.2 培養(yǎng)基氮源含量?jī)?yōu)化 確定酵母抽提物型號(hào)后，對(duì)其含量進(jìn)行優(yōu)化。如圖3a、b 所示，當(dāng)酵母抽提物FIG12LS 含量為30 g/L 時(shí)，GL-6生長(zhǎng)相對(duì)較好，培養(yǎng)16 h 生物量最高，OD值為19.15，且谷氨酸含量相對(duì)較高，培養(yǎng)24 h 谷氨酸含量最高為17.9 g/L。綜上，酵母抽提物FIG12LS 30 g/L作為培養(yǎng)基氮源最佳。

圖3 氮源不同含量培養(yǎng)對(duì)C. glutamicum GL-6 生物量（a）和谷氨酸含量（b）的影響Fig.3 Effects of different nitrogen sources content on C.glutamicum GL-6 biomass （a） and glutamate content （b）

2.2.3 玉米粉酶解液添加量的確定 玉米粉酶解后成分復(fù)雜，在培養(yǎng)基中添加不僅會(huì)使培養(yǎng)基初糖含量發(fā)生變化，還可能含有某些抑制因子影響菌種生長(zhǎng)。如圖4 所示，添加25%、50%、75%、100%玉米粉酶解液谷氨酸含量在前24 h 均比0%的玉米粉酶解液添加量低，添加酶解液GL-6 生長(zhǎng)緩慢，谷氨酸積累受到抑制，而添加50%和75%的玉米粉酶解液發(fā)酵24 h 后谷氨酸含量比0%的玉米粉酶解液添加量高。當(dāng)酶解液含量在100%時(shí)，谷氨酸含量增加較少（3.0 g/L）。綜上，添加50%的玉米粉酶解液即玉米粉含量100 g/L 效果最佳，發(fā)酵42 h谷氨酸含量達(dá)到15.9 g/L。

圖4 玉米粉酶解液添加量對(duì)C. glutamicum GL-6 發(fā)酵形成谷氨酸的差異性比較Fig.4 Comparison of different addition amount of corn meal hydrolysate on glutamate formation by C. glutamicum GL-6 fermentation

2.2.4 20 L 發(fā)酵罐水平擴(kuò)大培養(yǎng) 為滿足工業(yè)化生產(chǎn)需要，在20 L 發(fā)酵罐水平擴(kuò)大培養(yǎng)，以添加0%的玉米粉酶解液發(fā)酵作為對(duì)照組（圖5a），以加入50%玉米粉酶解液發(fā)酵為酶解組（圖5b），分別發(fā)酵52 h 比較谷氨酸含量。有研究表明，谷氨酸棒桿菌的最適生長(zhǎng)溫度與產(chǎn)物生成所需溫度不同，其最適生長(zhǎng)溫度為30～32 ℃，谷氨酸形成的最適溫度為34～37 ℃。發(fā)酵結(jié)果如圖5a 所示，對(duì)照組發(fā)酵44 hGL-6 OD值達(dá)到79.87，在44 h 時(shí)升溫至36 ℃，生物量下降，谷氨酸含量升高，發(fā)酵52 h谷氨酸含量達(dá)到84.0 g/L。如圖5b 所示，酶解組發(fā)酵44 hGL-6 OD值達(dá)到75.01，在44 h 時(shí)升溫至36 ℃，生物量下降，谷氨酸含量升高，發(fā)酵52 h 谷氨酸含量達(dá)到98.0 g/L。酶解組和對(duì)照組OD值基本一致，酶解組比對(duì)照組谷氨酸含量提高16.7%，酶解組由于加入了玉米酶解液發(fā)酵，初糖含量較高，較對(duì)照組高77.3%。綜上，玉米粉酶解液不僅可以用來(lái)發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸，而且可以促進(jìn)谷氨酸的積累。

圖5 對(duì)照組（a）和酶解組（b）的發(fā)酵結(jié)果Fig.5 Fermentation results of control group （a） and enzymolysis group （b）

2.3 天然鮮味料檢測(cè)分析

2.3.1 外觀及滋味評(píng)定 將上述兩罐發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液離心后在上清液中分別添加5%的麥芽糊精進(jìn)行噴霧干燥，得到鮮味料樣品CK（對(duì)照組）和天然鮮味料樣品MJ（酶解組）。產(chǎn)品圖片如圖6 所示，樣品CK 和樣品MJ 均為微黃色粉末，但樣品MJ 相較于樣品CK 黃色偏深。

圖6 兩種樣品Fig.6 Two kinds of samples

對(duì)圖6 所示的兩種樣品進(jìn)行滋味評(píng)定，結(jié)果如圖7 所示。兩種樣品主要為咸鮮味，且樣品MJ 比樣品CK 更鮮。兩種樣品均有甜味，且樣品MJ 較樣品CK 甜。樣品MJ 基本無(wú)酸味，樣品CK 略微有些酸味。兩種樣品基本都無(wú)苦味。綜上，樣品MJ 不僅比樣品CK 鮮味更強(qiáng)，感官整體評(píng)價(jià)還更優(yōu)。

圖7 兩種樣品滋味評(píng)價(jià)Fig.7 Taste evaluation of two samples

2.3.2 基礎(chǔ)指標(biāo) 根據(jù)調(diào)味料的質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)了樣品的幾個(gè)主要指標(biāo)，如表4 所示，樣品CK 還原糖含量為4.3 g/100 g，總氮含量為59.2 g/100 g，樣品MJ 還原糖含量為14.0 g/100 g，總氮含量為72.5 g/100 g。樣品MJ 還原糖和總氮含量分別比樣品CK高225.6%和22.5%，而且圖7 所示的滋味評(píng)定中甜味感官與兩種樣品檢測(cè)到的還原糖含量基本一致。樣品總砷總鉛均未超標(biāo)，符合食品添加劑安全標(biāo)準(zhǔn)。

表4 各樣品指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果Table 4 Test results of each sample

2.3.3 17 種游離氨基酸 氨基酸種類較多，具有功能和營(yíng)養(yǎng)性，除了谷氨酸有較強(qiáng)的鮮味外，甘氨酸具有甜味，能調(diào)和酸味和咸味，丙氨酸具有特殊鮮味和甜味，可提高食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，改善食品的風(fēng)味。因此，兩種樣品進(jìn)行氨基酸成分測(cè)定，結(jié)果如圖8 所示，樣品CK 的氨基酸總量為36.3 g/100 g，其中谷氨酸含量為35.4 g/100 g，樣品MJ 的氨基酸總量為44.8 g/100 g，其中谷氨酸含量為43.9 g/100 g，是樣品CK 的1.2 倍。圖7 所示的滋味評(píng)定中鮮味感官與氨基酸含量檢測(cè)結(jié)果基本一致。各樣品中氨基酸的主要成分為谷氨酸，其他氨基酸含量很少，其中樣品MJ 的谷氨酸和丙氨酸含量最高，其他氨基酸含量也相對(duì)較高，可能是加入玉米酶解液共同發(fā)酵產(chǎn)生的。

圖8 樣品氨基酸含量Fig.8 Amino acid content in the samples

2.3.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì) 揮發(fā)性風(fēng)味是產(chǎn)品可接受性重要因素之一，良好的風(fēng)味可帶來(lái)愉悅的感覺(jué)，對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行風(fēng)味分析尤為重要。如表5 所示，樣品中共檢測(cè)到23 種主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中吡嗪類物質(zhì)8 種，酸類物質(zhì)5 種，酮類物質(zhì)5 種。吡嗪類物質(zhì)種類多且含量高，樣品CK 2,5-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪含量分別達(dá)到1.301 μg/g 和1.429 μg/g，樣品MJ 2,3,5-三甲基吡嗪和川芎嗪含量分別達(dá)到7.118 μg/g 和6.113 μg/g。此外，樣品CK 酸味較重，醋酸和辛酸含量分別達(dá)到1.855 μg/g 和3.994 μg/g，樣品MJ 也有些許酸味，己酸含量達(dá)到1.152 μg/g。吡嗪類物質(zhì)是鮮味的主要來(lái)源，它不僅能夠提供鮮味，還有堅(jiān)果和咖啡的風(fēng)味，此外，一些吡嗪類物質(zhì)，如川芎嗪還具有一定的藥用價(jià)值。醋酸和辛酸具有刺激性和酸敗感，己酸則具有脂肪果味。圖7所示的滋味評(píng)定與表5 所示的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果基本一致。綜上，樣品MJ 作為天然鮮味調(diào)味品風(fēng)味良好，可廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域。

表5 兩種樣品揮發(fā)性風(fēng)味檢測(cè)結(jié)果Table 5 Volatile flavor test results of two samples

3 結(jié)論

該研究以玉米粉為主要原料，利用谷氨酸棒桿菌GL-6（GL-6）發(fā)酵生產(chǎn)新型天然鮮味料。首先通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)得到玉米粉最佳酶解工藝為固液比1:4，酶添加量1%，溫度90 ℃，時(shí)間3 h，在此最佳條件下DE 值達(dá)到60.84%；同時(shí)在搖瓶水平確定了GL-6 發(fā)酵產(chǎn)谷氨酸的最佳氮源為酵母抽提物FIG12LS 30 g/L，玉米粉酶解液最佳添加量為50%（v/v），接著在20 L 發(fā)酵罐水平進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證，并將發(fā)酵液離心取上清加入5%的麥芽糊精噴霧干燥成粉末，該粉末即為本文研究所得的天然鮮味料；最后對(duì)樣品進(jìn)行成分檢測(cè)和評(píng)定。結(jié)果表明該產(chǎn)品MJ 谷氨酸含量為43.9 g/100 g，氨基酸總含量為44.8 g/100 g，相較于樣品CK 含量分別提高了24.0%和23.4%。此外，產(chǎn)品富含堅(jiān)果及咖啡風(fēng)味的吡嗪類物質(zhì)，相較于對(duì)照組鮮味物質(zhì)含量和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值均有提高，風(fēng)味也更加豐富。綜上所述，玉米粉發(fā)酵生產(chǎn)的天然鮮味料，不僅風(fēng)味良好，營(yíng)養(yǎng)素更豐富，還實(shí)現(xiàn)了大宗農(nóng)產(chǎn)品的深加工，為生產(chǎn)企業(yè)利用天然食品原料發(fā)酵生產(chǎn)新型鮮味料開(kāi)辟了一條新的途徑，具有廣闊的市場(chǎng)前景。