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    棉酚降解菌的篩選、鑒定及棉粕固態(tài)發(fā)酵效果研究

    2022-08-27 13:55:30張維樹葉林燕李夢(mèng)托曾維斯閆達(dá)中
    食品工業(yè)科技 2022年17期
    關(guān)鍵詞:棉粕棉酚碳源

    汪 豐,張維樹,崔 穎,葉林燕,李夢(mèng)托,曾維斯,周 煥,劉 楠,閆達(dá)中,

    (1.武漢輕工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,湖北武漢 430023;2.武漢中糧食品科技有限公司,湖北武漢 430023)

    棉籽粕為棉籽經(jīng)過脫殼、壓榨等工序得到的副產(chǎn)品,我國年產(chǎn)量600 萬噸。棉籽粕作為一種農(nóng)業(yè)廢棄物,價(jià)格低廉,粗蛋白含量可達(dá)40%左右,是極具開發(fā)潛力的植物蛋白質(zhì)飼料資源。然而其含有棉酚、單寧、植酸等多種抗?fàn)I養(yǎng)因子,它的應(yīng)用價(jià)值受到限制。按棉酚的存在形式,可將其分為游離棉酚和結(jié)合棉酚,而前者會(huì)在動(dòng)物體內(nèi)蓄積,通過氧化應(yīng)激反應(yīng),造成動(dòng)物肝損傷,生殖功能障礙,引發(fā)呼吸窘迫、心律失常和溶血性貧血,有研究報(bào)道飼糧游離棉酚含量為162.5 mg/kg 時(shí),導(dǎo)致育肥豬中毒死亡,更嚴(yán)重的是不同畜禽體內(nèi)殘留的游離棉酚通過食物鏈累積威脅著人類的健康。盡管我國棉籽粕產(chǎn)量很高,但受限于游離棉酚的毒性,其在飼料生產(chǎn)中的利用率還不到35%。因此,研究如何去除棉粕中的棉酚具有重要意義。

    通過物理方法或者化學(xué)方法去除棉酚還存在諸多問題,或是能耗太高,或是會(huì)造成溶劑殘留、破壞原有營(yíng)養(yǎng)成分等。近年來,微生物處理法逐漸成為研究熱點(diǎn),它不僅可以降解包括棉酚在內(nèi)的抗?fàn)I養(yǎng)因子,無二次污染,還可以提高棉籽粕的蛋白質(zhì)含量,發(fā)酵產(chǎn)物中存留的許多酶類、維生素、氨基酸以及促生長(zhǎng)因子,大大改善棉籽粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和飼用價(jià)值。目前文獻(xiàn)報(bào)道的棉酚降解菌有曲霉、酵母菌、紅球菌、芽孢桿菌、乳桿菌等,侯敏等通過對(duì)比飼喂正常飼料和棉粕飼料下棉鈴蟲()腸道微生物的異同,分離棉酚耐受性腸道內(nèi)生菌32 株,對(duì)棉酚最高降解率達(dá)90.83%。在棉酚降解產(chǎn)物鑒定方面,周生飛運(yùn)用LC-MS/MS 對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行檢測(cè),獲得18 種棉酚降解產(chǎn)物,推導(dǎo)出相應(yīng)分子結(jié)構(gòu),提出了近平滑假絲酵母菌降解棉酚的代謝途徑。棉酚與萘的結(jié)構(gòu)相似,可以將其看成萘的衍生物,有學(xué)者認(rèn)為微生物降解棉酚的過程可能與萘的降解相似;同時(shí)棉酚是一種多環(huán)芳烴,目前已報(bào)道的參與多環(huán)芳烴降解的酶有加氧酶、脫氫酶和木質(zhì)素降解酶。關(guān)于微生物降解棉酚蛋白組學(xué)方面的研究報(bào)道寥寥無幾,目前僅有Yang 等以黑曲霉()AN-1 為研究對(duì)象,以棉酚為唯一碳源培養(yǎng)后對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析,并利用MALDI-TOFMS測(cè)定其中可能參與棉酚降解的20種蛋白質(zhì)。

    目前微生物降解棉酚的研究大多集中在降解菌的篩選和發(fā)酵條件的優(yōu)化,對(duì)于菌體利用棉酚為唯一碳源的生長(zhǎng)和降解過程關(guān)注較少,而該部分研究對(duì)于闡明棉酚的微生物降解途徑及生物學(xué)機(jī)制具有重要意義。本研究從山東棉花種植地及棉籽榨油廠附近采集土壤樣品,篩選出一株可高效降解棉酚的菌株,研究該菌在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)降解特性,根據(jù)底物譜分析初步推斷棉酚的開環(huán)途徑,旨在為棉粕的微生物脫毒產(chǎn)業(yè)化提供更多的微生物降解菌種資源,也為深入研究棉酚降解機(jī)理提供支持。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    棉籽粕 來自新疆棉粕加工廠;土樣 山東濱州薊縣棉花種植地及棉籽榨油廠(土樣取自土表層3 cm 以下);醋酸棉酚 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;LB 培養(yǎng)基:蛋白胨10.0 g,酵母提取物5.0 g,NaCl 5.0 g,蒸餾水1000 mL,pH7.2~7.4;篩選培養(yǎng)基:醋酸棉酚5.0 g,(NH)SO2.0 g,MgSO·7HO 0.2 g,KHPO0.5 g,CaCl·2HO 0.1 g,KHPO0.5 g,瓊脂15 g,蒸餾水1000 mL,pH7.2~7.4;無機(jī)鹽培養(yǎng)基(Mineral salts medium,MM)(1000 mL):(NH)SO2.0 g,NaHPO·12HO 14.3 g,KHPO3 g,F(xiàn)eSO·7HO 0.3 mg,儲(chǔ)存緩沖液(500×)2 mL;儲(chǔ) 存 緩 沖 液:MnSO·HO 0.07 g,MgSO·7HO 0.015 g,CuSO0.0125 g,ZnSO0.0125 g,HBO0.0125 g,溶于蒸餾水,定容至500 mL,過濾除菌。

    T-GRADIENT PCR 儀 德國Biometra 公司;SPX-3008SH-II 生化培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司;ZQLY300F 振蕩培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;DYY-6C 電泳儀、DYY-6C 瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng) 北京六一儀器廠;SW-CJ-IBM 超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣有限公司;5417R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf 公司;EC20 pH 計(jì) 梅特勒-托利多儀器有限公司;UV1780 紫外分光光度計(jì)日本島津;Agilent 1260Ⅱ高效液相色譜 美國安捷倫;LDZM-80L-Ⅲ高壓自動(dòng)滅菌鍋 上海申安;ZF-288 瓊脂糖電泳凝膠成像系統(tǒng) 上海金鵬分析儀器廠;YS100 顯微鏡 日本尼康。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 棉酚降解菌株的篩選 來自山東的土壤取10 g樣品分散到90 mL 無菌水中,放入28 ℃恒溫?fù)u床180 r/min 培養(yǎng),24 h 后將土壤懸液取出,并進(jìn)行梯度稀釋。分別取10和10的梯度稀釋液100 μL,涂布于無機(jī)鹽加棉酚的培養(yǎng)基中,置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱5 d。挑取不同形態(tài)的單菌落,分別劃線轉(zhuǎn)接到以棉酚為唯一碳源的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中,28 ℃恒溫培養(yǎng),獲得可以棉酚為唯一碳源生長(zhǎng)的純培養(yǎng)物。同時(shí)利用添加5 g/L 棉酚的篩選培養(yǎng)基加入土壤懸液進(jìn)行連續(xù)的傳代培養(yǎng)4~5 周,富集后稀釋涂布平板。從上述平板上挑選長(zhǎng)出的單菌落,接種到添加1 mmol/L棉酚無機(jī)鹽培養(yǎng)基,鑒定是否可以利用底物棉酚作為碳源生長(zhǎng)。

    1.2.2 棉酚降解菌的鑒定 從土樣中篩選到一株以棉酚為唯一碳源生長(zhǎng)的菌株,并將其命名為 YL01。將YL01 制片,進(jìn)行革蘭氏染色,用光學(xué)顯微鏡油鏡觀察細(xì)菌形態(tài)。

    YL01 生理生化鑒定參考文獻(xiàn)[23-24]進(jìn)行。

    用細(xì)菌通用引物進(jìn)行16S rRNA 基因PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系(50 μL)為PCR Buffer (5×)10 μL,10 mmol/L dNTP 1 μL,引物27F (5'-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3') 1 μL,引物1492R (5'-GGTTAC CTTGTTACGACTT-3') 1 μL,Taq 酶(5 U/μL) 0.5 μL,模板4 μL (單菌落加50 μL 無菌水100 ℃煮8 min,離心后取上清為模板),無菌水32.5 μL。PCR 反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,30 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。將PCR 產(chǎn)物送上海生工測(cè)序,測(cè)得的序列登錄NCBI用blastn 進(jìn)行序列比對(duì),利用Clustal W 和MEGA 7.0 軟件進(jìn)行分析,Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

    1.2.3 YL01 抗生素抗性分析 在無機(jī)鹽培養(yǎng)基平板上挑取單菌落接種到添加不同抗生素(氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素、四環(huán)素、萘啶酸、慶大霉素和鏈霉素的濃度分別為50、34、10、15、20、10、10 μg/mL)的5 mL 1/4 LB 培養(yǎng)基中,每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置三重復(fù),對(duì)照組為不加抗生素的1/4 LB 培養(yǎng)基。180 r/min,28 ℃搖床培養(yǎng),分別在第1、2、3 d 觀察其是否生長(zhǎng),以測(cè)試其對(duì)抗生素的抗性情況。

    1.2.4 菌株生長(zhǎng)曲線和對(duì)棉酚的降解效果

    1.2.4.1 棉酚標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 配制摩爾濃度為0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mmol/L 的棉酚標(biāo)準(zhǔn)溶液,溶劑為0.2%磷酸-乙腈(15:85 V/V)溶液,每個(gè)濃度設(shè)置三重復(fù),經(jīng)HPLC 測(cè)定計(jì)算峰面積。色譜條件如下,色譜柱:Thermo Fisher Accucore C柱,流動(dòng)相:0.2%磷酸-乙腈(20:80 V/V),流速:0.5 mL/min,紫外檢測(cè)波長(zhǎng):235 nm,進(jìn)樣量:5 μL,柱溫:25 ℃。以棉酚標(biāo)準(zhǔn)液的摩爾濃度(mmol/L)為縱坐標(biāo),以峰面積為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并求得回歸方程為:y=(2×10)x-0.004,=0.999。

    1.2.4.2 菌體生物量和棉酚降解率的測(cè)定 在以0.65 mmol/L 濃度的醋酸棉酚為唯一碳源的液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,接種YL01 單菌落,180 r/min,28 ℃搖床培養(yǎng)。同時(shí)設(shè)置不接菌的空白對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組與空白組均設(shè)置三重復(fù)。通過平板稀釋計(jì)數(shù)法檢測(cè)其10 d 內(nèi)的生長(zhǎng)情況。在第3、15、24、36、48、72、96、132、168、204、240 h 取100 μL 菌液,稀釋后取50 μL 涂布于1/4 LB 平板(稀釋倍數(shù)為10~10,以長(zhǎng)出的單菌落數(shù)量在30~300 之間為宜),每個(gè)稀釋度設(shè)置三重復(fù),置于28 ℃培養(yǎng),1 d 后計(jì)菌落數(shù),按下列公式進(jìn)行計(jì)算:

    同時(shí)取1 mL 菌液加入等體積的乙酸乙酯,渦旋充分萃取,靜置分層后取上清液,重復(fù)兩次后合并上清液,取1 mL 用氮?dú)獯蹈?,?.2%磷酸-乙腈(15:85 V/V)溶液重新溶解后,經(jīng)HPLC 測(cè)定,將峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算棉酚含量。根據(jù)下式計(jì)算降解率。

    式(2)中:c為最后一天實(shí)驗(yàn)組棉酚含量,mmol/L;c為第0 d 實(shí)驗(yàn)組的棉酚含量,mmol/L。

    1.2.5 YL01 底物譜分析 將新活化的單菌落,接種到添加2 mmol/L 不同底物(萘、聯(lián)苯、水楊酸、鄰苯二酚、原兒茶酸、龍膽酸、對(duì)苯醌)的MM 培養(yǎng)基中,通過測(cè)定OD觀察其是否生長(zhǎng)。

    1.2.6 發(fā)酵培養(yǎng)基最適碳源實(shí)驗(yàn) 為將來大規(guī)模培養(yǎng)菌株sp. YL01,考慮使用廉價(jià)的原料,降低生產(chǎn)成本,確定玉米漿為氮源,探索YL01 的最佳碳源及碳源濃度條件。固定氮源為濃度40 g/L 的玉米漿,設(shè)置5 mmol/L 和10 mmol/L 濃度梯度的甘油、淀粉和葡萄糖為碳源,每組三重復(fù),保持其余組分添加濃度與種子培養(yǎng)基濃度相同。分別接種,于28 ℃ 200 r/min 搖床過夜培養(yǎng),除去過夜時(shí)間,每隔3 h 取樣測(cè)定吸光度OD,探究菌株在組分優(yōu)化培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況。

    1.2.7 固態(tài)發(fā)酵過程中蛋白含量以及棉酚降解效率測(cè)定

    1.2.7.1 Bradford 法制作蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線 配制1 mg/mL 牛血清蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)品溶液,分別吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0 mL 的BSA 標(biāo)準(zhǔn)溶液,再分別加入0.9、0.8、0.6、0.4、0.2 和0 mL 的雙蒸水,混勻后準(zhǔn)確吸取40 μL 于離心管中,加入考馬斯亮藍(lán)試劑2 mL,混勻后遮光反應(yīng)5 min,以雙蒸水為空白對(duì)照,在波長(zhǎng)595 nm 處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo),以蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并求得回歸方程為:y=0.565x+0.108,=0.971。

    1.2.7.2 固態(tài)發(fā)酵 稱量0.1156 g 醋酸棉酚,溶解到5 mL 丙酮中,在100 g 滅菌棉粕(精確至0.001 g)中逐滴加入棉酚溶液,拌勻后取12 g 棉粕接種YL01 菌液10 mL(接種量為7×10CFU),同時(shí)設(shè)置不加菌的空白對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組與空白組均設(shè)置三重復(fù)。放置在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)酵。

    1.2.7.3 棉粕中棉酚含量的測(cè)定 從第0 d 開始,每48 h 取1 g 樣品加入14 mL 丙酮后進(jìn)行渦旋,超聲輔助萃取,靜置取上清1 mL 氮吹至干,用0.2%磷酸-乙腈(15:85 V/V)溶液溶解后,經(jīng)HPLC 測(cè)定峰面積,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算棉酚含量。

    1.2.7.4 棉粕粗蛋白的提取 準(zhǔn)確稱取1 g 棉柏樣品,粉碎過80 目篩,按1:15(W/V)的料液比加水渦旋5 min,用1 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)體系pH 至11.5,50 ℃浸提2 h,6000 r/min 離心10 min,分離得上清液,再往殘?jiān)屑?0 mL 水渦旋2 min,50 ℃浸提過夜,6000 r/min 離心10 min,分離得上清液,合并兩次提取液。

    1.2.7.5 棉粕蛋白含量的測(cè)定 取40 μL 棉粕蛋白提取液,加水稀釋至2 mL,再取40 μL 稀釋液和2 mL 考馬斯亮藍(lán)試劑混合,遮光反應(yīng)5 min 后在波長(zhǎng)595 nm 處測(cè)吸光值。平行重復(fù)三次,以40 μL 水和2 mL 考馬斯亮藍(lán)試劑混勻后調(diào)零。將吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算蛋白質(zhì)含量。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    2 結(jié)果與分析

    2.1 棉酚降解菌株的篩選

    從土樣中篩選到一株以棉酚為唯一碳源生長(zhǎng)的菌株,并將其命名為YL01。菌株YL01 在無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上菌落濕潤(rùn)、粘稠、邊緣整齊,如圖1。在光學(xué)顯微鏡下觀察,菌體呈現(xiàn)球形。

    圖1 YL01 菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of bacterium YL01

    2.2 棉酚降解菌的鑒定

    2.2.1 菌株YL01 革蘭氏染色鑒定 對(duì)棉酚降解菌YL01 進(jìn)行革蘭氏染色,呈現(xiàn)紅色,因此鑒定該菌株為革蘭氏陰性菌(G),如圖2。

    圖2 YL01 革蘭氏染色鑒定Fig.2 Gram staining identification of bacterium YL01

    2.2.2 YL01 生理生化特征 YL01 能在5、10、41 ℃生長(zhǎng),不能在50 ℃生長(zhǎng),能水解尿素,不能產(chǎn)吲哚,也不能使L-鳥氨酸脫羧(見表1),這些特征與相同。但是YL01 能利用L-阿拉伯糖、淀粉和葡萄糖生長(zhǎng),而.不能;YL01 能在5 ℃生長(zhǎng),能利用L-鼠李糖、D-果糖、淀粉和葡萄酸鈣,而1GBT 不能;YL01 不能利用松三糖,而1GBT、可以。YL01 能在41 ℃生長(zhǎng)、能水解尿素、能利用淀粉、葡萄糖、葡萄酸鈣和檸檬酸鈉生長(zhǎng),而不能;YL01 不能產(chǎn)吲哚,也不能使L-鳥氨酸脫羧,而可以。經(jīng)過全基因組測(cè)序,YL01 的DNA 的GC 含量為55.64%,與.NBRC 14939 的55.4% GC 含量相接近。結(jié)果表明,YL01 的生理生化性質(zhì)與和較為接近。

    表1 YL01 生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of YL01

    2.2.3 16S rRNA 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建將測(cè)得的16S rRNA 序列與NCBI GenBank 中所有已測(cè)定的原核生物的16S rRNA 序列進(jìn)行比對(duì),與IL11 的一致性達(dá)到99%以上。使用MEGA7.0 軟件處理所得數(shù)據(jù),得到了YL01及相關(guān)菌株的進(jìn)化距離并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。初步鑒定YL01 為拉烏爾菌屬(sp.)。

    圖3 菌株YL01 的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strainYL01

    2.3 YL01 抗生素抗性分析

    在1/4 LB 培養(yǎng)基中添加不同的抗生素,通過測(cè)定OD觀察YL01 生長(zhǎng)情況,結(jié)果顯示菌株可以在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng),表明其具有氨芐青霉素的抗性,而對(duì)氯霉素、卡那霉素、四環(huán)素、萘啶酸、慶大霉素、鏈霉素均無抗性(表2)。因此YL01在環(huán)境中釋放較為安全,具有較好的應(yīng)用前景。

    表2 YL01 在含有不同抗生素的1/4 LB 培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況Table 2 Growth of YL01 in 1/4 LB medium containing different antibiotics

    2.4 YL01 生長(zhǎng)曲線和對(duì)棉酚的降解效果

    在以棉酚為唯一碳源的培養(yǎng)基中,YL01 從24 h開始進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期,第168 h 生物量達(dá)到最大值并進(jìn)入穩(wěn)定期(圖4)。第10 d 棉酚降解率為48%。由于底物棉酚難溶于水,當(dāng)用丙酮溶解后加入液體培養(yǎng)基會(huì)形成渾濁的懸濁液,無法使用分光光度計(jì)測(cè)定OD了解菌體生長(zhǎng)情況,因此采用平板稀釋涂布計(jì)數(shù)法來監(jiān)測(cè)菌體生長(zhǎng),菌落總數(shù)統(tǒng)計(jì)檢測(cè)存在一定計(jì)數(shù)誤差。

    圖4 YL01 的生長(zhǎng)曲線和底物棉酚濃度隨時(shí)間的變化Fig.4 The growth curve of YL01 and the change of substrate gossypol concentration with time

    2.5 YL01 底物譜分析

    在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中添加不同的底物(濃度均為2 mmol/L),觀察YL01 7 d 內(nèi)的生長(zhǎng)情況,結(jié)果顯示其除了可以利用棉酚外,還能利用鄰苯二酚、原兒茶酸和對(duì)苯醌作為唯一碳源生長(zhǎng),不能利用萘和聯(lián)苯作為唯一碳源生長(zhǎng)(表3)。說明菌株YL01 可能以鄰苯二酚或原兒茶酸開環(huán)途徑代謝棉酚,可能存在多條與芳香族化合物代謝相關(guān)的基因簇,但是降解途徑不經(jīng)過萘和聯(lián)苯,具體開環(huán)方式仍需進(jìn)一步研究。

    表3 YL01 在不同底物中的生長(zhǎng)情況Table 3 The growth of YL01 in different substrates

    2.6 發(fā)酵培養(yǎng)基最適碳源實(shí)驗(yàn)

    在不同碳源(甘油、淀粉、葡萄糖)組成的培養(yǎng)基中,YL01 均在第9 h 進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(圖5),在第27 h 生物量達(dá)到最大值,其在10 mmol/L 葡萄糖中OD最高,可以達(dá)到11.5。但是考慮到原料價(jià)格成本因素,確定5 mmol/L 淀粉為最適碳源培養(yǎng)YL01用于后續(xù)固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

    圖5 YL01 在不同碳源中的生長(zhǎng)情況Fig.5 Growth of YL01 in different carbon sources

    2.7 固態(tài)發(fā)酵效率及蛋白含量變化

    對(duì)棉粕固態(tài)發(fā)酵不僅能降低棉酚含量,還可提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,改善飼料適口性,同時(shí)檢驗(yàn)YL01的實(shí)際脫毒效果。與空白對(duì)照組相比,8 d 內(nèi)棉酚含量極顯著降低(<0.01),降解率為43%(圖6),同時(shí)蛋白含量增加了10%(圖7)。隨著時(shí)間延長(zhǎng)棉粕中水分蒸發(fā)會(huì)使其質(zhì)量減少,帶來棉酚含量的上升,考慮到這一點(diǎn),實(shí)際降解率應(yīng)高于測(cè)定值。蛋白含量的增加是由于在發(fā)酵的過程中,菌株分泌的各種酶。由于菌體接種量較小,僅為5.83×10CFU/g,通過加大接種量可以提高固態(tài)發(fā)酵過程中對(duì)棉酚的降解率。為了排除棉粕中土著菌株和高溫高壓對(duì)棉酚含量的影響,本實(shí)驗(yàn)將棉粕滅菌后額外加入棉酚,在部分已發(fā)表的文獻(xiàn)中,固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)并沒有這一步操作,其真實(shí)降解效率值得商榷。

    圖6 棉粕中棉酚含量隨時(shí)間的變化Fig.6 Changes of gossypol content in cottonseed meal with time

    圖7 棉粕中蛋白含量隨時(shí)間的變化Fig.7 Changes of protein content in cottonseed meal with time

    3 結(jié)論

    從土壤中篩選分離到一株以棉酚為唯一碳源生長(zhǎng)的菌株,經(jīng)16S rRNA 基因測(cè)序和生理生化鑒定,鑒定其為sp.。YL01 在以棉酚為唯一碳源的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)10 d,棉酚的降解率為48%;接種該菌株到棉粕中,固態(tài)發(fā)酵8 d 后棉酚的降解率達(dá)43%,蛋白含量增加10%。YL01 與其他拉烏爾菌屬的種在進(jìn)化上親緣關(guān)系較遠(yuǎn),是否是一個(gè)新種,需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。本研究在以棉酚為唯一碳源的培養(yǎng)基中測(cè)定菌株的生長(zhǎng)和對(duì)棉酚的降解,還同時(shí)測(cè)定了液體培養(yǎng)和固態(tài)發(fā)酵條件下的棉酚降解效率,二者互相印證了該菌對(duì)棉酚的降解能力。本研究提供了更多降解棉酚的微生物菌種資源,對(duì)運(yùn)用生物技術(shù)消除棉粕中棉酚具有潛在的應(yīng)用前景,也為進(jìn)一步開展棉酚的微生物降解機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)。

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