紅棗多糖羧甲基化修飾及其抗氧化活性研究

符玉霞，郭 欣，魏亞博，鄧小蓉，雷用東，劉萍萍，張 建

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子 832000）

紅棗（Mill.）通常被稱為紅棗或大棗，是棗樹的果實(shí)，屬于鼠李科，原產(chǎn)于中國，由于其營養(yǎng)豐富且具有多種藥用價(jià)值，2002 年被國家衛(wèi)生健康委員會(huì)列為藥食同源食品。此外，紅棗中含有多種重要的生物活性成分，如：維生素C、多酚、黃酮、多糖、環(huán)核苷酸，在人體保健和疾病防治方面可以發(fā)揮重要作用。植物多糖特性獨(dú)特，在臨床上多用于增強(qiáng)機(jī)體免疫力與抗氧化能力，調(diào)節(jié)機(jī)體糖代謝等。多糖是紅棗的主要生物活性成分，具有抗疲勞、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤、保肝、降血糖和胃腸保護(hù)等作用。

多糖的分子修飾逐漸成為研究熱點(diǎn)之一。羧甲基化修飾是指多糖分子鏈上引入羧甲基基團(tuán)的反應(yīng)，修飾后，多糖的理化性質(zhì)和組成結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，對(duì)其活性有較大的影響，主要體現(xiàn)為修飾后的多糖生物活性增強(qiáng)，更具有研究意義。再加上其所需設(shè)備簡單、反應(yīng)條件溫和、投資少、成本低，所以本文采用此方法開展試驗(yàn)。希望通過對(duì)紅棗多糖的分子修飾，提高原有生物活性或增加新活性，擴(kuò)大多糖利用范圍，并應(yīng)用于功能食品領(lǐng)域，有利于實(shí)現(xiàn)紅棗產(chǎn)業(yè)的高值化應(yīng)用。

本研究以一氯乙酸為羧甲基化試劑，NaOH 為反應(yīng)溶劑，通過單因素和響應(yīng)面對(duì)羧甲基化條件進(jìn)行了優(yōu)化，利用紅外光譜和掃描電鏡圖對(duì)其進(jìn)行了分析?？紤]到對(duì)紅棗多糖進(jìn)行羧甲基化修飾的目的是提高其抗氧化活性，以DPPH、羥基自由基清除率及還原力和Fe螯合能力為指標(biāo)，探究羧甲基化修飾對(duì)多糖抗氧化的影響，以期為紅棗多糖分子修飾及其抗氧化特性改善提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅棗多糖（純度為60%） 西安澤郎生物科技有限公司；透析袋（截留分子量：8000～14000 Da） 上海源葉生物科技有限公司；大孔吸附樹脂AB-8 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；三氯乙酸 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；正丁醇、硫酸 天津市富宇精細(xì)化工有限公司；過氧化氫 成都市科隆化學(xué)有限公司；鄰苯三酚、硫酸亞鐵、氫氧化鈉 天津市鑫鉑特化工有限公司；菲啰嗪、水楊酸、抗壞血酸、三氯化鐵 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸氫二鈉 天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鈉 天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；一氯乙酸 上海麥克林生化科技有限公司。

H2500R-2 型冷凍離心機(jī) 北京澎昆博遠(yuǎn)科貿(mào)發(fā)展有限責(zé)任公司；RE-52 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器公司；ENK-PRO 型酶標(biāo)儀 美國Bioteck公司；NJF-120-01 型掃描電子顯微鏡 蘇州晉松計(jì)量儀器有限公司；Nicolet IS 10 型傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo 公司；HX-10-50B 型真空冷凍干燥機(jī) 上海圣科儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紅棗多糖前處理

1.2.1.1 蛋白質(zhì)的脫除 采用Sevage 法脫除紅棗多糖中的游離蛋白質(zhì)。取0.05 g/mL 的粗多糖溶液，按體積3:1 比例加入Sevage 試劑（氯仿與正丁醇3:1，v/v），放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，充分振蕩30 min，使蛋白質(zhì)充分變性。4000 r/min 離心10 min，待分層完全后除去水層和試劑層交界處的變性蛋白質(zhì)，取出上層多糖液。反復(fù)操作5～8 次直至中間變性蛋白層幾乎消失。將脫蛋白后的糖液進(jìn)行蒸發(fā)濃縮、干燥、稱重，分析蛋白含量，計(jì)算蛋白脫除率和多糖保存率。

1.2.1.2 脫色 準(zhǔn)確稱取活化的大孔樹脂20 g 于250 mL 錐形瓶，然后向其中加入100 mL 濃度為0.05 g/mL 脫蛋白紅棗多糖溶液，置于搖床中，225 r/min、室溫振蕩24 h，抽濾，取濾液測定其脫色后在420 nm 處的吸光度值，計(jì)算色素脫除率和多糖保存率。

1.2.1.3 多糖含量的測定 參考王迎香等的方法，準(zhǔn)確量取濃度為0.2 mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 于試管，補(bǔ)水至2.0 mL，加1.0 mL 質(zhì)量濃度5%的苯酚，滴加5.0 mL 濃硫酸，搖勻，靜置30 min，待其溫度降低后，于490 nm處測其吸光度，以2.0 mL 水按同樣顯色操作為空白。同一濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)測定3 次，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到線性回歸方程：y=0.8589x+0.0068，其中=0.991，x 為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，y 為對(duì)應(yīng)濃度下的吸光度值。

取2.0 mL 適宜濃度的紅棗多糖，加1.0 mL 質(zhì)量濃度5%的苯酚，滴加5.0 mL 濃硫酸，搖勻，靜置30 min，待其溫度降低后，于490 nm 處測其吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。

1.2.1.4 蛋白質(zhì)含量的測定 參考曹澤虹等和楊靜等的方法，量取濃度為0.2 mg/mL 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 分別置試管中，加蒸餾水補(bǔ)至1.0 mL，分別加5.0 mL 考馬斯亮藍(lán)試劑，混勻，于30 ℃恒溫水浴5 min，冷卻至室溫。另以蒸餾水1.0 mL，同上操作為空白對(duì)照，在595 nm處測量吸光度值。同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別重復(fù)測定3 次。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：y=0.7817x+0.0425，其中=0.9956，x 是蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，y 為不同濃度下測得的吸光度值。

紅棗多糖溶液稀釋至適當(dāng)濃度，取1.0 mL 于試管中，加入5.0 mL 考馬斯亮藍(lán)溶液，混勻，于30 ℃恒溫水浴5 min，冷卻至室溫，在595 nm 處測量吸光度值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算紅棗多糖溶液中蛋白含量。

1.2.2 羧甲基化紅棗多糖的制備 參照陳柵和程浩羧甲基化改性的方法，準(zhǔn)確稱取0.8 g 除雜后的紅棗多糖于錐形瓶中，加入50 mL 一定濃度的NaOH攪拌1 h，使其堿化完全。加入一定量的一氯乙酸，置于一定溫度水浴鍋中反應(yīng)5 h，冷卻，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH 為7.0，透析3 d，冷凍干燥（-50 ℃，72 h），獲得羧甲基化紅棗多糖。

1.2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn) a.NaOH 濃度對(duì)羧甲基取代度的影響：將50 mL 濃度為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mol/L 的NaOH 加入紅棗多糖中，攪拌30 min，再加入50 mL 質(zhì)量濃度為3%的一氯乙酸，在80 ℃水浴鍋中反應(yīng)5 h,制備羧甲基化紅棗多糖，測定羧甲基取代度，研究NaOH 濃度對(duì)紅棗多糖的羧甲基化修飾的影響。

b.溫度對(duì)羧甲基取代度的影響：向紅棗多糖中加入3 mol/L 的NaOH 和質(zhì)量濃度為3%一氯乙酸各50 mL，分別在50、60、70、80、90 ℃下制備羧甲基化紅棗多糖，測定羧甲基取代度，研究反應(yīng)溫度對(duì)紅棗多糖的羧甲基化修飾的影響。

c.一氯乙酸添加量對(duì)羧甲基取代度的影響：在紅棗多糖中加入50 mL 濃度3 moL/L 的NaOH 和50 mL 質(zhì)量濃度為1%、2%、3%、4%、5%的一氯乙酸，在70 ℃下制備羧甲基化紅棗多糖，測定羧基取代度，研究一氯乙酸添加量對(duì)紅棗多糖的羧甲基化修飾的影響。

1.2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用三因素三水平Box-Behnken 的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法（表1），以A：一氯乙酸添加量；B：溫度；C：NaOH 濃度為自變量，取代度為因變量，利用響應(yīng)面分析軟件Design-Expert8 建立數(shù)字回歸模型，確定紅棗多糖羧甲基化的最佳條件。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Experimental design factors and levels

1.2.2.3 羧甲基取代度的測定 參照張洋婷和房斐等的方法。取10 mg 羧甲基化紅棗多糖，向其中加入10 mL 0.01 mol/L 的NaOH，攪拌30 min 使其完全溶解，滴1～3 滴酚酞，然后用0.01 mol/L 的HCl 滴定，以紅色消失且30 s 不變色為滴定終點(diǎn)，計(jì)算公式為：

式中：DS 為羧甲基取代度；A 為羧甲基含量（%）；W 為羧甲基化紅棗多糖質(zhì)量（g）；C為NaOH濃度（mol/L）；V為NaOH 體積（mL）；C是HCl 的濃度（mol/L）；V為樣品滴定過程中消耗HCl 的體積（mL）。

1.2.3 紅棗多糖結(jié)構(gòu)表征

1.2.3.1 傅里葉紅外光譜（FTIR） 分別稱取2 mg 羧甲基化修飾前后的紅棗多糖，加200 mg KBr 粉末研磨均勻，壓片處理，分析4000～500 cm波數(shù)下紅外光譜圖。

1.2.3.2 掃描電鏡（SEM） 取適量羧甲基修飾前后的紅棗多糖樣品固定于載物盤上，噴金處理后置于儀器內(nèi)，觀察多糖樣品微觀形態(tài)，拍攝不同倍數(shù)電鏡照片，進(jìn)行分析。

1.2.4 紅棗多糖抗氧化活性測定

1.2.4.1 DPPH 自由基清除作用 配制濃度為0.04 mg/mL 的DPPH 溶液和不同濃度（1、2、3、4、5 mg/mL）修飾前后紅棗多糖溶液。試管中依次加入2 mL DPPH 溶液，2 mL 不同濃度的紅棗多糖溶液或者V，搖勻，室溫放置30 min，測定其在517 nm處的吸光度值，V為陽性對(duì)照，蒸餾水為空白對(duì)照，計(jì)算清除率（S）。

式中：A為反應(yīng)液的吸光度值；A為不加DPPH 時(shí)多糖液自身的吸光度值；A為空白對(duì)照DPPH 溶液加蒸餾水。

1.2.4.2 羥基自由基清除作用 分別在試管中加入2 mL 不同濃度（1、2、3、4、5 mg/mL）的紅棗多糖溶液，依次加入2 mL 6 mmol/L FeSO和2 mL 9 mmol/L水楊酸，再加入2 mL 2.4 mmol/L 過氧化氫，搖勻，靜置10 min，離心10 min，測其在510 nm 處的吸光度值，Vc 為陽性對(duì)照，蒸餾水為空白，計(jì)算清除率（S）。

式中：A為樣品液的吸光度；A為不加顯色劑HO樣品本底的顏色；A為空白對(duì)照液的吸光度。

1.2.4.3 Fe的螯合能力 分別取2 mL 不同濃度的（1、2、3、4、5 mg/mL）紅棗多糖液，加入2 mL 蒸餾水，2 mmol/L 的FeCl0.1 mL 和5 mmol/L 的菲啰嗪溶液0.2 mL，25 ℃水浴10 min，測其在562 nm處的吸光度值，EDTA Na2 為陽性對(duì)照，蒸餾水為空白，計(jì)算Fe螯合能力。

式中：A為樣品溶液反應(yīng)后的吸光度值；A為蒸餾水代替FeCl溶液的吸光度值；A為蒸餾水代替反應(yīng)中樣品溶液的吸光度值。

1.2.4.4 總還原力測定 分別在試管中加入0.2 mol/L pH6.6 的磷酸鹽緩沖液2 mL，2 mL 不同濃度（1、2、3、4、5 mg/mL）的紅棗多糖液，2 mL 1%的鐵氰化鉀，混合均勻后于50 ℃水浴鍋中反應(yīng)20 min，取出后加入2 mL 10%的三氯乙酸終止反應(yīng)，然后離心10 min，取2 mL 上清液，加2 mL 蒸餾水，0.4 mL FeCl，混勻靜置10 min，在700 nm 處測定其吸光度值，吸光度值越大表明還原能力越強(qiáng)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)測定三次，采用Design-Expert8 進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，Excel 2021 和SPSS 25 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。使用Origin 85 作圖軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅棗多糖的脫蛋白脫色工藝研究

2.1.1 紅棗多糖中蛋白質(zhì)的脫除 如圖1 所示，隨著脫蛋白次數(shù)的增加，紅棗多糖中蛋白脫除率逐漸增大，游離蛋白含量不斷減少，多糖保存率逐漸減小，多糖含量不斷減少，當(dāng)經(jīng)過6 次蛋白脫除時(shí)，蛋白脫除率為74.5%，多糖保存率為70.8%，當(dāng)進(jìn)行7 次脫蛋白時(shí)，蛋白脫除率為76.4%，而多糖保存率急劇下降為57.5%，綜合蛋白脫除率和多糖保存率，確定脫蛋白最佳次數(shù)為6 次，此時(shí)游離蛋白多數(shù)已經(jīng)脫除，且多糖保存率較高。

圖1 蛋白脫除率和多糖保存率Fig.1 Protein removal rate and polysaccharide retention rate

2.1.2 紅棗多糖的脫色 利用AB-8 大孔樹脂脫色后，紅棗多糖液脫色率可達(dá)87.4%，多糖保存率為72.80%，多糖的損失主要是在脫色過程中，大孔樹脂吸附一定量多糖所致。圖2 是不同濃度脫色前后紅棗多糖溶液，可清晰觀察到多糖液顏色發(fā)生了明顯的變化，未脫色多糖溶液的顏色隨濃度的增加越來越深，呈黃褐色，但是通過脫色處理后，多糖溶液的顏色明顯變淺，而且隨著濃度的增大沒有明顯變化，呈淺黃色，說明多糖中的色素物質(zhì)基本上被清除干凈，不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。

圖2 脫色前后不同濃度多糖溶液Fig.2 Polysaccharide solution with different concentration before and after decolorization

2.2 羧甲基化紅棗多糖制備單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 NaOH 濃度對(duì)羧甲基取代度的影響 圖3 是紅棗多糖羧甲基修飾過程中，NaOH 濃度對(duì)羧甲基取代度的影響趨勢圖?？捎^察到NaOH 濃度從1 mol/L逐漸增加到3 mol/L 時(shí)，羧甲基取代度顯著提高（＜0.05）；當(dāng)NaOH 濃度為3 mol/L 時(shí)，取代度可達(dá)1.024。當(dāng)NaOH 濃度大于3 mol/L 時(shí)，取代度降低，這可能是強(qiáng)堿性條件下，多糖易降解，且當(dāng)一氯乙酸和NaOH 達(dá)到一定濃度時(shí)會(huì)發(fā)生副反應(yīng)，不利于羧甲基修飾，因此確定最佳NaOH 濃度為3 mol/L。

圖3 NaOH 濃度對(duì)羧甲基取代度的影響Fig.3 Effect of sodium hydroxide concentration on degree of carboxymethyl substitution

2.2.2 溫度對(duì)羧甲基取代度的影響 圖4 是羧甲基紅棗多糖制備中，反應(yīng)溫度對(duì)取代度的影響趨勢圖。當(dāng)反應(yīng)溫度從50 ℃增加到70 ℃時(shí)，取代度顯著增大（＜0.05），70 ℃時(shí)，取代度達(dá)到最大值1.047。當(dāng)溫度大于70 ℃時(shí)，取代度不斷下降，這表明在一定的溫度范圍內(nèi)，溫度升高有利于羧甲基化，溫度過高不利于羧甲基修飾，這可能是溫度過高，會(huì)使氯乙酸和多糖發(fā)生降解，阻礙羧甲基化的進(jìn)程，從而降低了羧甲基化取代度，因此確定70 ℃為反應(yīng)最佳溫度。

圖4 溫度對(duì)羧甲基取代度的影響Fig.4 Effect of temperature on degree of carboxymethyl substitution

2.2.3 一氯乙酸添加量對(duì)羧甲基取代度的影響 圖5是紅棗多糖羧甲基修飾過程中，一氯乙酸添加量對(duì)取代度的影響趨勢圖。當(dāng)一氯乙酸添加量為從1%增加到3%時(shí)，羧甲基取代度逐漸增大，當(dāng)一氯乙酸添加量為3%時(shí)，最大取代度可達(dá)1.014。大于3%時(shí)隨添加量的增加取代度急劇降低，這可能是因?yàn)檫^量一氯乙酸的加入，消耗了一定量NaOH，使得反應(yīng)體系pH 降低，不利于反應(yīng)的進(jìn)行，因此確定一氯乙酸添加量為3%。

圖5 一氯乙酸添加量對(duì)羧甲基取代度的影響Fig.5 Effect of monochloroacetic acid addition amount on degree of carboxymethyl substitution

2.3 羧甲基化紅棗多糖制備響應(yīng)面試驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果如表2 所示。對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得出羧甲基化紅棗多糖的取代度預(yù)測響應(yīng)Y 為：Y=1.05-0.014A-6.500E-003B-0.059C-0.023AB+4.750E-003AC+0.14BC-0.37A-0.19B-0.27C。用值和值衡量模型系數(shù)的顯著性，結(jié)果見表3。本試驗(yàn)中，值為142.52 說明模型值較高，值（＜0.0001）較低，表明該模型具有高度顯著性，就純誤差而言，失擬項(xiàng)（=0.1390）不顯著，這表明模型方程適合羧甲基化紅棗多糖的取代度測定。模型決定系數(shù)（=0.9946），表明建立的模型適用。變異系數(shù)（C.V=4.04%）較低，表明試驗(yàn)值的精度和可靠性較高，以值為依據(jù)，檢驗(yàn)各系數(shù)的顯著性，值越小，對(duì)應(yīng)系數(shù)越顯著。顯著性標(biāo)注如表3 所示。BC 和A、B、C均為極顯著（＜0.01），其他因素間相互作用都不顯著（＞0.05），說明BC 間相互作用對(duì)羧甲基化取代度影響較明顯。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface optimization test results

表3 回歸模型方差分析Table 3 Regression model variance analysis

2.3.2 響應(yīng)面分析與驗(yàn)證試驗(yàn) 圖6 是紅棗多糖羧甲基化修飾響應(yīng)面圖，通過3D 圖，觀察曲面的傾斜度確定兩者對(duì)響應(yīng)值的影響程度，傾斜度越高，即坡度越陡，說明兩者交互作用越顯著。另外，從3D 圖的顏色可以做一個(gè)初步判定，隨著變化趨勢的劇烈增加，其顏色也呈加深趨勢。響應(yīng)面等高線圖可以直觀地反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，以便找出最佳工藝參數(shù)以及各參數(shù)之間的相互作用，等高線中的最小橢圓的中心點(diǎn)即是響應(yīng)面的最高點(diǎn)。此外，等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。結(jié)合圖6，得出AB和AC 之間的相互作用對(duì)紅棗多糖的羧甲基化修飾具沒有顯著性影響，BC 相互作用對(duì)紅棗多糖羧甲基化修飾有顯著性影響。

圖6 各因素交互作用的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface diagram of interaction of various factors

根據(jù)響應(yīng)面軟件分析得紅棗多糖羧甲基化修飾預(yù)測最佳工藝為：一氯乙酸添加量3.49%，溫度69.52 ℃，NaOH 濃度3 mol/L，取代度預(yù)測值為1.1519。為了方便操作，最后確定紅棗多糖羧甲基化修飾的最佳條件為：一氯乙酸添加量3.5%，NaOH 濃度為3 mol/L，溫度為70 ℃。在該條件下，進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)，其取代度結(jié)果分別為1.154、1.183、1.135，平均值為1.157，均優(yōu)于其他組合，表明最優(yōu)方法組合合理可用。

2.4 紅棗多糖的結(jié)構(gòu)表征

2.4.1 傅里葉紅外光譜分析 圖7 為羧甲基化修飾前后紅棗多糖在4000～500 cm波長范圍內(nèi)的光譜圖。由圖可知，3371.38 cm和3388.27 cm是O-H的拉伸振動(dòng)引起的，表明紅棗多糖存在分子內(nèi)氫鍵。2921.99 cm和2931.23 cm是C-H 不對(duì)稱伸縮振動(dòng)引起的，1720.41 cm是由于酯或羧基中C=O 的拉伸振動(dòng)引起，表明可能存在糖醛酸或乙酰基。1411.81 cm對(duì)稱C-O 拉伸振動(dòng)引起的，1155.29 cm和1157.06 cm是C-O-H 和C-O-C 結(jié)構(gòu)產(chǎn)生振動(dòng)吸收引起的。1024.14 cm和1025.93 cm為-OH的O-H 變角振動(dòng)，919.99 cm和923.72 cm為-吡喃糖的吸收峰。852.49 cm和869.72 cm為-吡喃糖的吸收峰，由此推測紅棗多糖是-和-構(gòu)型共存的吡喃型甘露糖苷酸性雜多糖。783.05 cm和761.73 cm是吡喃型特征吸收峰。羧甲基修飾后出現(xiàn)了新的吸收峰1592.89 cm和1421.26 cm，1592.89 cm是羧甲基中 COO-的拉伸振動(dòng)，1421.26 cm處的吸收峰為羧甲基化的特征吸收峰。且-OH 特征吸收峰明顯減弱，說明-OH 基團(tuán)被取代，綜上所述，表明紅棗多糖成功引入了COO-基團(tuán)，羧甲基化修飾成功。

圖7 傅里葉紅外光譜圖Fig.7 Fourier infrared spectroscopy

2.4.2 SEM 分析 由圖8 掃描電鏡觀察可得：紅棗多糖的微觀形態(tài)發(fā)生明顯的變化，主要在于顆粒大小、表面光滑程度、松散程度。未修飾的紅棗多糖表面呈蜂窩狀，有許多小孔，顆粒較大，呈塊狀，視覺效果較粗糙。羧甲基修飾過的紅棗多糖表面較光滑，顆粒很小，呈片狀。掃描電鏡圖表明羧甲基修飾可以改變多糖的微觀形態(tài)，這可能是因?yàn)槎嗵墙Y(jié)構(gòu)發(fā)生變化造成的。

圖8 掃描電鏡圖Fig.8 Scanning electron microscopy

2.5 紅棗多糖抗氧化活性測定

2.5.1 羧甲基修飾紅棗多糖對(duì)DPPH 的清除能力的影響 圖9 為羧甲基化修飾紅棗多糖對(duì)DPPH 自由基的清除能力，Vc 為陽性對(duì)照組。如圖所示，隨著濃度的增大，未修飾和羧甲基化修飾的紅棗多糖對(duì)DPPH 自由基都有較強(qiáng)的清除作用，但清除能力均低于Vc，并且清除能力隨著多糖濃度的增大逐漸加強(qiáng)，呈現(xiàn)劑量依賴性。此外，羧甲基化修飾后的紅棗多糖的清除能力顯著高于未修飾多糖（＜0.05）。隨多糖濃度的增加，羧甲基化修飾的紅棗多糖對(duì)DPPH 自由基的清除作用顯著增大。當(dāng)濃度為5 mg/mL 時(shí)幾乎和Vc 持平，達(dá)到了93.83%，而Vc 清除率為95.5%，未修飾的紅棗多糖清除率為53.85%。此結(jié)果表明羧甲基化修飾可以顯著提高紅棗多糖對(duì)DPPH 自由基的清除作用。

圖9 紅棗多糖對(duì)DPPH 的清除作用Fig.9 Scavenging effect of Ziziphus jujuba polysaccharide on DPPH

2.5.2 羧甲基修飾紅棗多糖對(duì)羥基自由基清除率的影響 如圖10 所示，紅棗多糖對(duì)羥基自由基有較強(qiáng)的清除作用，隨著多糖濃度的增大，清除作用逐漸增強(qiáng)，呈劑量依賴性增加，羧甲基化修飾的紅棗多糖對(duì)羥基自由基的清除作用顯著提高（＜0.05）。當(dāng)濃度為5 mg/mL，羧甲基化修飾多糖羥基清除率44.7%，未修飾29.25%，表明羧甲基化修飾可提高紅棗多糖對(duì)羥基自由基的清除作用。其原因可能是在糖基上引入取代基，可以使一些本來沒有活性的化合物具有了活性，而且這些引入多糖取代基的方法都會(huì)大大地提高多糖的活性。

圖10 紅棗多糖對(duì)羥基自由基的清除作用Fig.10 Scavenging effect of Ziziphus jujuba polysaccharide on hydroxyl radical

2.5.3 羧甲基修飾紅棗多糖對(duì)Fe的清除率的影響圖11為羧甲基化修飾前后紅棗多糖對(duì)Fe的螯合作用。低濃度時(shí)，未修飾與羧甲基化修飾的紅棗多糖對(duì)Fe的螯合作用都比較低，其原因可能是低濃度范圍，未修飾和羧甲基多糖均表現(xiàn)出較弱的清除活性。隨著多糖濃度增大羧甲基化修飾的紅棗多糖對(duì)Fe的螯合作用明顯強(qiáng)于未修飾的。同時(shí)，螯合能力也逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)濃度依賴性。表明羧甲基化修飾可以提高紅棗多糖對(duì)Fe的螯合能力。

圖11 紅棗多糖對(duì)Fe2+螯合作用Fig.11 Chelating effect of Ziziphus jujuba polysaccharide on Fe2+

2.5.4 羧甲基修飾紅棗多糖對(duì)總還原力的影響 圖12體現(xiàn)羧甲基化修飾前后紅棗多糖的還原力變化。從圖可表明，紅棗多糖具有一定的還原力，但其還原力遠(yuǎn)低于陽性對(duì)照Vc。隨著濃度的增大，未修飾和羧甲基化修飾的紅棗多糖的還原力都有所增加，且呈劑量依賴性。通過羧甲基化修飾的紅棗多糖的還原力明顯高于未修飾的紅棗多糖，表明羧甲基化修飾可以提高紅棗多糖的還原力，但由于紅棗多糖自身還原能力較弱，修飾前后紅棗多糖的還原力較V而言都較弱。

圖12 紅棗多糖的還原力Fig.12 Reducing power of Ziziphus jujuba polysaccharide

3 結(jié)論

紅棗粗多糖通過除蛋白，脫色得到除雜紅棗多糖，經(jīng)羧甲基化修飾，通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)，確定一氯乙酸的添加量為3.5%，溫度為70 ℃，NaOH 濃度為3 mol/L 時(shí)，修飾程度最佳，其羧甲基取代度可達(dá)1.157。紅外光譜分析顯示，修飾后-OH 吸收峰減弱，且出現(xiàn)了羧甲基化的特征吸收峰1592.89 cm和1421.26 cm，表明紅棗多糖羧甲基化修飾成功。SEM 結(jié)果顯示，羧甲基修飾過的紅棗多糖表面比較光滑，顆粒小，呈片狀，未修飾的多糖呈蜂窩狀，表面較粗糙。DPPH 自由基，羥基自由基和還原力的測定結(jié)果顯示，羧甲基化修飾的紅棗多糖對(duì)DPPH、羥基自由基的清除率和還原力都有較明顯的提高。通過對(duì)紅棗多糖的羧甲基化修飾，可提高紅棗多糖的抗氧化活性，為紅棗多糖的進(jìn)一步發(fā)展提供了理論依據(jù)，將有利于紅棗多糖在食品和醫(yī)藥行業(yè)的廣泛應(yīng)用。