基于透析法的亞硝基血紅蛋白穩(wěn)定性及機(jī)制研究

郭 婧，袁江蘭，康 旭，范 超

（湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北武漢 430068）

我國(guó)畜禽血液資源豐富，尤其是豬血，年產(chǎn)量可達(dá)300 萬(wàn)噸左右，但其加工利用卻非常有限，目前主要通過(guò)干燥制成各種蛋白粉，用作動(dòng)物飼料，還有相當(dāng)一部分血液被當(dāng)作廢棄物直接排放，不僅浪費(fèi)資源，而且污染環(huán)境。因此，畜禽血液深加工具有重要意義。

畜禽血液中血紅蛋白（Hemoglobin，Hb）約占全血總蛋白的80%。將Hb 亞硝基化制成鮮紅色的亞硝基血紅蛋白（Nitrosohemoglobin，HbNO），可以替代亞硝酸鹽用于肉制品發(fā)色，這一直是畜禽血液深加工研究的熱點(diǎn)。一般認(rèn)為，Hb 的亞硝基化是通過(guò)亞硝基（-NO）與Hb 分子中的Fe形成了第6 個(gè)配位鍵而實(shí)現(xiàn)的，從而生成鮮紅色的HbNO。HbNO能賦予肉制品良好的色澤，且具有抗氧化和防腐等作用，因此，期待其在肉品加工領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。然而，HbNO 很不穩(wěn)定，光照、氧氣等均會(huì)使其色澤發(fā)生劣變，所以國(guó)內(nèi)一直未有生產(chǎn)應(yīng)用。目前，關(guān)于HbNO 的研究主要集中在其合成與應(yīng)用方面，對(duì)其穩(wěn)定性及機(jī)制的研究卻鮮有涉及。透析法是定量分析蛋白質(zhì)與小分子相互結(jié)合的經(jīng)典方法，具有操作簡(jiǎn)單、條件易于控制、設(shè)備成本低等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)透析可以將與蛋白質(zhì)結(jié)合的小分子和游離小分子分離。小分子與蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物被保留在透析袋中，而游離的小分子可以在半透膜內(nèi)外自由穿過(guò)，二者結(jié)合作用越弱越易通過(guò)透析而解除結(jié)合，透析法結(jié)合光譜技術(shù)可用于分析蛋白質(zhì)與小分子結(jié)合的穩(wěn)定性及結(jié)合機(jī)制。目前沒(méi)有關(guān)于透析法用于研究亞硝基血紅蛋白的報(bào)道。

本文以豬Hb（PHb）為原料，首先對(duì)PHb 純度、結(jié)構(gòu)和等電點(diǎn)等進(jìn)行表征，然后將PHb 亞硝基化而制備出PHbNO，再以四種光譜學(xué)方法作為PHbNO結(jié)構(gòu)表征的手段，利用透析法研究PHbNO 的穩(wěn)定性及機(jī)制，為PHbNO 的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬血紅蛋白粉 襄陽(yáng)維恩生物科技有限公司；血紅蛋白標(biāo)品（來(lái)源于豬血） 源葉生物科技有限公司；亞硝酸鈉、異抗壞血酸鈉、檸檬酸、檸檬酸三鈉國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；所有試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

SCIENTZ-10DN 冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra Cell 蛋白電泳裝置 美國(guó)伯樂(lè)公司；Nano ZS+MPT-2 納米粒度及電位分析儀 英國(guó)馬爾文公司；UV-2600 紫外可見分光光度計(jì) 日本島津有限公司；F-7000 熒光分光光度計(jì) 日立高新技術(shù)公司；Mettler-Toledo DSC1 差式掃描量熱儀、FE 28 型pH 計(jì) 梅特勒-托利多儀器有限公司；Thermo Scientific Nicolet iN10 傅里葉變換紅外光譜儀 賽默飛世爾科技公司；J-1500 圓二色譜儀 日本JASCO。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PHb 的純化 參考文獻(xiàn)[13]方法進(jìn)行蛋白純化。將豬血紅蛋白粉溶解在超純水（UP）中制備成10%（w/v）的蛋白懸液，25 ℃、350 r/min 磁力攪拌5 h，然后置于4 ℃冰箱過(guò)夜，以使蛋白充分溶解并水化。最后，8000 r/min 離心10 min，收集上清液，并于-80 ℃凍結(jié)后冷凍干燥，凍干粉密封后于4 ℃避光保存。

1.2.2 PHb 結(jié)構(gòu)和性質(zhì)測(cè)定

1.2.2.1 SDS-PAGE 分析 參考文獻(xiàn)[14]方法，將純化的PHb 配制成2 mg/mL（w/v）的溶液，與上樣緩沖液按1:1 混合，煮沸5 min，冷卻至室溫后上樣，上樣量為10 μL。濃縮膠濃度為4%（w/v），分離膠濃度為12%（w/v）。濃縮膠中電壓控制在70 V，進(jìn)入分離膠電壓增加至110 V。以PHb 標(biāo)品為對(duì)照。

1.2.2.2 紫外-可見光譜分析 利用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定蛋白的光譜特征。將樣品配制成1.0 mg/mL（w/v）的溶液，稀釋100 倍后，室溫下掃描250～700 nm 的吸收光譜。

1.2.2.3 熱穩(wěn)定性 利用差示掃描量熱儀（DSC）分析PHb 的熱穩(wěn)定性。取3～5 mg 樣品于坩堝中密封，以10 ℃/min 的速度從30 ℃升溫至180 ℃，密封的空坩堝作對(duì)照。

1.2.2.4 等電點(diǎn)（pI）測(cè)定 利用納米粒度電位儀測(cè)定Z-電位，電荷為0 時(shí)的pH 即為蛋白的pI。將純化的PHb 配制成1.0%（w/v）的溶液，稀釋10 倍后，再將pH 分別調(diào)至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，然后在室溫下測(cè)定Z-電位。

1.2.3 PHbNO 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及機(jī)制

1.2.3.1 PHbNO 的制備 按照文獻(xiàn)[16]中的方法，優(yōu)化反應(yīng)條件后制備PHbNO。優(yōu)化的反應(yīng)條件為：純化的PHb 溶解于UP 水，持續(xù)攪拌過(guò)夜，用1.0 mol/L 檸檬酸調(diào)節(jié)pH 至5.0，然后加入NaNO和異抗壞血酸鈉溶解，控制反應(yīng)體系中PHb 為0.1 mmol/L、NaNO為5.0 mmol/L、異抗壞血酸鈉為10.0 mmol/L，溶解后充入N，25 ℃避光條件下反應(yīng)1 h。反應(yīng)后樣品分為三份，參考文獻(xiàn)[13]的方法分別進(jìn)行不同透析處理：a.不透析，記為未透析PHbNO；b.用截留分子量為7 kDa 的透析袋4 ℃避光透析5 h，期間不換水，記為部分透析PHbNO；c.用截留分子量為7 kDa 的透析袋4 ℃避光透析48 h，期間換水12 次以上，記為徹底透析PHbNO。三份樣品分別于-80 ℃凍結(jié)后凍干，4 ℃避光密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 紫外可見-吸收光譜特征 用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定PHb 和未透析、部分透析、徹底透析PHbNO 的紫外吸收光譜，保持恒溫25 ℃，在350～450 nm 和450～700 nm 范圍內(nèi)掃描的樣品濃度分別為0.01 和0.1 mg/mL。

1.2.3.3 熒光光譜特征 采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光光譜特征。參考文獻(xiàn)[17]的方法，樣品濃度均為2.0 mg/mL，激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，掃描的發(fā)射波長(zhǎng)范圍為300～400 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm，電壓400 V，掃描速度1200 nm/min，檢測(cè)器靈敏度為中等。

1.2.3.4 傅里葉紅外光譜（FTIR）特征 樣品凍干粉以溴化鉀壓片，置于紅外光譜儀中，在500～4500 cm頻率范圍內(nèi)掃描32 次。

1.2.3.5 圓二色譜（CD） 利用J-1500 圓二色譜儀測(cè)定樣品溶液的CD 譜。參考文獻(xiàn)[18]的方法，待測(cè)樣品溶液的濃度均為0.2 mg/mL，測(cè)定溫度為20 ℃，掃描的波長(zhǎng)范圍為240～190 nm，分辨率1.0 nm，掃描速率為100 nm/min，比色皿光徑0.1 cm。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有樣品均做3 個(gè)平行，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 23 的Duncan 檢驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，差異顯著性水平為＜0.05，采用Origin7.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PHb 的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)

2.1.1 PHb 亞基組成和純度 PHb 分子由兩個(gè)亞基和兩個(gè)亞基組成。每個(gè)亞基由一條肽鏈和一個(gè)血紅素分子構(gòu)成，其中肽鏈盤繞、折疊成球形將血紅素分子包在里面。

從圖1 可知，在SDS-PAGE 中，PHb 主要以分子量約14.0 kDa 的單亞基形式存在，經(jīng)image Lab軟件進(jìn)行分析后得到表1，PHb 標(biāo)品含量為46.78%，PHb 含量為50.72%；此外，尚有部分由亞基和亞基組成的二聚體存在，PHb 標(biāo)品含量為9.30%，PHb 含量為9.61%。顯然，純化的PHb 純度高于PHb標(biāo)品。

圖1 PHb 的SDS-PAGEFig.1 SDS-PAGE of PHb

表1 SDS-PAGE 中與血紅蛋白相關(guān)的各條帶相對(duì)含量Table 1 The relative content of each band related to hemoglobin in SDS-PAGE

2.1.2 PHb 的紫外-可見光譜 PHb 的紫外-可見吸收光譜見圖2，包括2 個(gè)強(qiáng)吸收峰，分別為蛋白質(zhì)在280 nm 附近的吸收峰和血紅素分子中卟啉環(huán)在405 nm 附近的特征吸收峰。原料PHb 的紫外-可見特征吸收光譜與PHb 標(biāo)品沒(méi)有明顯差異，表明二者結(jié)構(gòu)基本相同。

圖2 PHb 的紫外-可見光譜Fig.2 UV-Vis spectra of PHb

2.1.3 PHb 的基本性質(zhì) PHb 的熱穩(wěn)定性如圖3A所示。蛋白質(zhì)受熱至一定程度，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的溫度即為變性溫度，在DSC 測(cè)定的熱特性曲線中，蛋白質(zhì)在其變性溫度附近會(huì)形成明顯的吸熱峰。變性溫度與蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性呈正相關(guān)，變性溫度越高，蛋白的熱穩(wěn)定性也越好。純化后的PHb 變性溫度為80 ℃，略低于PHb 標(biāo)品（84.97 ℃），與宋璇在文獻(xiàn)中報(bào)道的PHb 變性溫度為82.62 ℃相近。

蛋白質(zhì)分子所帶凈電荷為零時(shí)的pH 為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）。由圖3B 中可知，PHb 的pI 為6.8 左右，與李曉靜等報(bào)道的等電點(diǎn)范圍6.8～7.2 一致。

圖3 PHb 的基本性質(zhì)Fig.3 Basic properties of PHb

2.2 PHbNO 穩(wěn)定性及機(jī)制分析

2.2.1 透析對(duì)PHbNO 紫外-可見光譜的影響 PHb和PHbNO 在可見光區(qū)有強(qiáng)吸收，且吸收光譜有明顯差異，暗示著其結(jié)構(gòu)特征存在明顯不同，因此可通過(guò)測(cè)定PHb 特征吸收峰的變化檢測(cè)PHbNO 的形成。PHb 在420 nm 附近的強(qiáng)吸收峰稱為Soret 帶，屬于卟啉化合物的特征吸收峰，500～750 nm 的若干個(gè)弱吸收峰稱為Q 帶，與PHb 中Fe 的第6 個(gè)配位鍵有關(guān)，通常Soret 帶的吸光系數(shù)約是Q 帶的10～20 倍。由圖4A 可見，PHb 發(fā)生亞硝基化反應(yīng)后，Soret 帶和Q 帶均發(fā)生明顯變化，表明PHbNO 的形成對(duì)PHb分子中卟啉的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響，并且可能與Fe中第6 個(gè)配位鍵的形成有關(guān)，推測(cè)反應(yīng)位點(diǎn)與卟啉相關(guān)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，NO 可通過(guò)配位鍵與卟啉Fe結(jié)合，最終生成PHbNO，從而改變了PHb 的結(jié)構(gòu)，并使其紫外-可見光譜特征發(fā)生相應(yīng)變化。

圖4 透析對(duì)PHbNO 紫外-可見光譜的影響Fig.4 Effect of dialysis on UV-Vis spectrum of PHbNO

觀察Soret 帶可知，PHb 亞硝基化后，其Soret帶的最大吸收峰由406 nm 處紅移至412 nm 處，并且峰強(qiáng)度明顯降低，這可以通過(guò)比較PHb 和未透析的PHbNO 得知。同時(shí)Q 帶也發(fā)生明顯變化，494 和630 nm 處的兩個(gè)吸收峰基本消失，而540 和575 nm處的兩個(gè)吸收峰明顯增強(qiáng)。對(duì)PHbNO 體系進(jìn)行部分透析和徹底透析后，隨著體系中NaNO濃度的降低，Soret 帶和Q 帶又逐漸與PHb 的特征趨于一致，表明體系中PHbNO 又逐漸變?yōu)镻Hb。肌紅蛋白與NO結(jié)合后的Soret 帶和Q 帶也有相似的變化規(guī)律。由此推測(cè)PHb 的亞硝基化反應(yīng)可能屬于可逆反應(yīng)，PHb 與NO 的配位結(jié)合受體系中NO 濃度的影響，當(dāng)體系中NO 濃度降低時(shí)，亞硝基化反應(yīng)平衡逆向移動(dòng)，當(dāng)NO 濃度為0 時(shí)，PHbNO 也全部逆向反應(yīng)生成PHb。

2.2.2 透析對(duì)PHbNO 熒光光譜的影響 蛋白質(zhì)具有內(nèi)源熒光，經(jīng)一定波長(zhǎng)的紫外光激發(fā)后可發(fā)射出熒光，其熒光發(fā)射光譜特征與該蛋白結(jié)構(gòu)相關(guān)，熒光光譜的變化可反映出蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化或蛋白質(zhì)分子中芳香族氨基酸殘基周圍微環(huán)境的變化。圖5 表明，PHb 在280 nm 激發(fā)時(shí)，可在338 nm 處產(chǎn)生一個(gè)很強(qiáng)的熒光發(fā)射峰，由色氨酸和酪氨酸殘基共同產(chǎn)生。顯然，PHb 發(fā)生亞硝基化后，在280 nm 的紫外光激發(fā)后所發(fā)射的熒光強(qiáng)度大幅減弱，可能的原因是，PHb 與NO 發(fā)生配位反應(yīng)后，引起PHb 分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，且發(fā)色團(tuán)周圍微環(huán)境也發(fā)生相應(yīng)變化，導(dǎo)致PHb 熒光量子產(chǎn)量降低或轉(zhuǎn)移。隨著透析處理的進(jìn)行，熒光強(qiáng)度逐漸增加，表明PHbNO 逐步轉(zhuǎn)變?yōu)镻Hb，PHb 結(jié)構(gòu)和色氨酸和酪氨酸周圍微環(huán)境又逐步得到恢復(fù)，又進(jìn)一步表明PHb 與NO 的結(jié)合為可逆反應(yīng)。

圖5 透析對(duì)PHbNO 熒光光譜的影響Fig.5 Effect of dialysis on fluorescence spectra of PHbNO

2.2.3 透析對(duì)PHbNO 紅外光譜的影響 由圖6 可知，徹底透析的PHbNO 與PHb，二者的紅外吸收特征光譜基本相同。AmideⅠ帶和AmideⅡ帶分別為1600～1700 cm和1500～1600 cm范圍內(nèi)的吸收光譜，是蛋白質(zhì)的特征吸收，這兩個(gè)譜峰的偏移，特別是AmideⅠ帶的偏移，表明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化。表2 分析結(jié)果表明，徹底透析的PHbNO 與PHb 的AmideⅠ帶和AmideⅡ帶相同，表明二者蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相同。而未透析PHbNO 和部分透析PHbNO 的AmideⅠ帶均發(fā)生明顯偏移，且偏移程度隨著透析處理而逐漸減弱，直至徹底透析后又與PHb 一致。

圖6 不同透析處理PHbNO 的傅里葉紅外光譜Fig.6 Fourier infrared spectra of PHbNO after different dialysis

表2 AmideⅠ、AmideⅡ帶分析Table 2 Analysis of Amide I and Amide II bands

圖6表明未透析PHbNO 在1054、1096、1147、1270、1380 cm處有明顯吸收，其中，1380 cm處為典型的游離NO 的特征吸收峰，而1054、1096、1147、1270 cm左右的峰則是配位NO 的特征峰。顯然，透析處理過(guò)程中NO 的這些特征峰逐漸消失，至徹底透析時(shí)，特別是配位NO 的四個(gè)峰全部消失，光譜特征與PHb 一致，表明PHbNO 分子中配位結(jié)合的NO 經(jīng)過(guò)徹底透析后已經(jīng)全部被除去，進(jìn)一步表明PHb 的亞硝基化為可逆反應(yīng)，需要一定濃度的NaNO才能維持可逆平衡，保證一定濃度PHbNO的存在。

2.2.4 透析對(duì)PHbNO 的CD 譜的影響 圖7 表明，PHbNO 和PHb 二級(jí)結(jié)構(gòu)存在明顯差異，而隨著透析處理，這種差異又逐漸減小，直至徹底透析后與PHb 基本相同。表3 中對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析表明，徹底透析的PHbNO 與PHb 僅-螺旋存在顯著差異（＜0.05），其它三種結(jié)構(gòu)無(wú)顯著差異（＞0.05）。未透析和部分透析的PHbNO 與PHb 相比較，-折疊均顯著增加（＜0.05），-螺旋顯著減少（＜0.05），轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)消失，無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)增加，且透析程度越高，-折疊含量越低，-螺旋含量越高，至徹底透析時(shí)，各二級(jí)結(jié)構(gòu)含量又恢復(fù)至與PHb 基本一致。PHb 亞硝基化后二級(jí)結(jié)構(gòu)的組成和含量變化顯著（＜0.05），表明硝基化反應(yīng)后，PHb 高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化。-螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，蛋白伸展，而無(wú)規(guī)卷曲增多，則表明加入NaNO以后Hb 的結(jié)構(gòu)變松散，可能是由于PHb 亞硝基化反應(yīng)后，通過(guò)配位鍵結(jié)合在PHb 分子上的亞硝基存在強(qiáng)烈的反位效應(yīng)，使PHb 分子上與血紅素Fe軸向配位的His 部分脫離，F(xiàn)e 原子軌道能量改變，引起相鄰氨基酸相互作用的變化，從而引起PHb 立體結(jié)構(gòu)的改變。PHbNO 徹底透析后二級(jí)結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)，表明在透析過(guò)程中隨著NaNO的除去，配位平衡被打破，NO 逐漸從PHb 分子上脫離，從而使PHbNO 轉(zhuǎn)變?yōu)镻Hb。再次印證了PHb與NO 的結(jié)合是可逆的，與體系中NO 的濃度正相關(guān)，因此，PHbNO 的存在需要體系中存在一定濃度的NO。

圖7 PHbNO 的圓二色譜Fig.7 Circular dichromatogram of PHbNO

表3 PHbNO 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Table 3 Analysis on secondary structure of PHbNO

2.2.5 PHbNO 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性機(jī)制 天然PHb 的每個(gè)血紅素中含有1 個(gè)Fe，F(xiàn)e位于血紅素卟啉環(huán)的中心。PHb 血紅素的結(jié)構(gòu)直接與PHb 的呈色相關(guān)。血紅素的卟啉Fe可形成6 個(gè)配位鍵，其中，4 個(gè)配位鍵由卟啉中4 個(gè)吡咯環(huán)氮原子與Fe構(gòu)成，第5 個(gè)配位鍵由珠蛋白第93 位組氨酸殘基中吲哚側(cè)鏈上的氮原子提供孤對(duì)電子而形成，而第6 可配位軌道處于開放狀態(tài)，能與很多配體結(jié)合，對(duì)PHb 呈色具有重要作用。當(dāng)PHb 發(fā)生亞硝基化反應(yīng)時(shí)，NO 與PHb 分子中血紅素Fe的第6 個(gè)空軌道進(jìn)行配位鍵合，引起相鄰Fe-His 鍵的變化，從而引起結(jié)構(gòu)變化，因此呈色也發(fā)生相應(yīng)變化。

根據(jù)高鐵肌紅蛋白活性中心與NO 的配位反應(yīng)機(jī)制和對(duì)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果的綜合分析，推測(cè)PHb 與NO 的配位反應(yīng)屬于可逆反應(yīng)。NO 與血紅素活性中心Fe發(fā)生配位反應(yīng)后，PHb 結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的變化。而透析除去或部分除去反應(yīng)物NaNO，使化學(xué)平衡發(fā)生逆向移動(dòng)，從而使已經(jīng)生成的產(chǎn)物PHbNO濃度逐漸降低，直至徹底透析時(shí)，PHbNO 濃度也趨近于0。據(jù)此推斷PHbNO 的穩(wěn)定性機(jī)制如圖8。

圖8 PHbNO 的穩(wěn)定性機(jī)制Fig.8 Stability mechanism of PHbNO

NaNO在酸性條件下釋放出NO，NO 以其N 原子進(jìn)攻卟啉環(huán)中的Fe，O 原子受水合形式的影響，與HO 中H 結(jié)合成氫鍵，使水分子的O 與Fe 的配位減弱，最終脫去1 分子的HO，NO 取代HO 生成PHbNO。透析過(guò)程中，NO 的濃度減小，處于溶液狀態(tài)下PHbNO 絡(luò)合物Fe-N 配位鍵在HO 的進(jìn)攻下，NO 又慢慢地脫離，蛋白重新生成PHb。

3 結(jié)論

本研究利用透析法，通過(guò)對(duì)不同透析程度PHbNO 的結(jié)構(gòu)分析，確定了PHb 亞硝基化反應(yīng)的基本類型和產(chǎn)物PHbNO 的不穩(wěn)定性及機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：PHb 發(fā)生亞硝基化反應(yīng)后，Soret 帶和Q 帶均發(fā)生明顯變化，在280 nm 的紫外光激發(fā)后所發(fā)射的熒光強(qiáng)度大幅減弱，紅外光譜和CD 光譜表明其二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，然而透析后PHbNO 結(jié)構(gòu)與PHb 結(jié)構(gòu)基本一致。顯然，PHb 亞硝基化反應(yīng)為可逆反應(yīng)，其反應(yīng)物和產(chǎn)物之間存在化學(xué)平衡，產(chǎn)物PHbNO 的穩(wěn)定性依賴于反應(yīng)物NaNO的存在，因此在制備和生產(chǎn)PHbNO 作為肉制品發(fā)色劑時(shí)，還需同時(shí)存在一定量的NaNO。本文僅利用光譜學(xué)方法對(duì)PHbNO 的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及機(jī)制進(jìn)行了初步研究，并結(jié)合肌紅蛋白亞硝基化機(jī)制推測(cè)出NO 和PHb 的結(jié)合結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性機(jī)制，對(duì)于PHb 與NO 結(jié)合的精確結(jié)構(gòu)還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究為PHbNO 的合成方法及其在肉制品中的應(yīng)用提供了參考。