基于GC-IMS 和SPME-GC-MS 分析檸檬汁對太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）酶解液風味的改善作用

南富心，趙那娜，馬昱陽，劉 荔，楊心怡，曾名湧

（中國海洋大學食品科學與工程學院，青島市海洋食品保鮮技術(shù)工程研究中心，山東青島 266003）

牡蠣味道鮮美，營養(yǎng)豐富，是我國主要養(yǎng)殖經(jīng)濟貝類之一。太平洋牡蠣（），又稱乳山牡蠣、長牡蠣，是黃渤海地區(qū)的代表性養(yǎng)殖品種，具有環(huán)境適應能力強、生長快、味道鮮美、營養(yǎng)豐富等特點。長期以來，我國牡蠣的加工技術(shù)滯后于行業(yè)發(fā)展，精加工技術(shù)落后，通過生物酶解技術(shù)利用牡蠣高蛋白特性以獲取具有不同功能活性的牡蠣生物活性肽成為研究熱點。但是，由于酶解過程中牡蠣的脂質(zhì)氧化和蛋白質(zhì)降解，導致牡蠣酶解液的腥苦味加重，風味變差，已成為制約其加工利用的瓶頸問題。目前，已報道的水產(chǎn)品酶解液脫腥方法有包埋法、吸附法、發(fā)酵法、聯(lián)合脫腥法等，但這些方法會導致營養(yǎng)物質(zhì)的部分損失，或存在操作復雜、成本較高等缺點。

檸檬（L.），蕓香科柑橘屬植物。富含多酚、檸檬精油、類黃酮、檸檬酸、維生素C 和維生素E，具有很強的抗氧化能力。此外，檸檬還具有令人愉快風味，常用于制作果汁及調(diào)味。目前，將檸檬用于水產(chǎn)品酶解液的風味改善研究較少，鄭世杰等采用凍干檸檬皮粉對木瓜蛋白酶水解后的四角蛤蜊水解液進行脫腥處理，利用檸檬皮的氣味掩蔽四角蛤蜊酶解液中的部分不良風味。但用檸檬汁參與酶解過程對牡蠣酶解液進行異味改善尚未有人研究。

為改善牡蠣酶解液的不良風味，探究檸檬汁是否在共酶解作用下對腥味物質(zhì)具有脫除及掩蓋、產(chǎn)生愉快風味的能力，本研究利用感官評價、氣相色譜-離子遷移譜（GC-IMS）、固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（SPME-GC-MS）等技術(shù)對檸檬汁處理前后牡蠣酶解液的整體感官輪廓、風味物質(zhì)指紋圖譜、揮發(fā)性化合物進行分析，明確經(jīng)脫腥處理前后牡蠣酶解液特征風味成分的差異，探討檸檬汁對牡蠣酶解液風味的改善作用。該方法簡便、快捷、安全，可為改善牡蠣酶解液風味及行業(yè)加工利用提供一定的實驗依據(jù)和有益參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

新鮮帶殼太平洋牡蠣（）軟體組織平均重（15.0±2.5）g 青島團島市場，購于1 月；檸檬 青島團島市場，產(chǎn)地四川安岳；動物蛋白酶（由外切酶、內(nèi)切酶、風味蛋白酶復合而成的中性蛋白酶，酶活10U/g） 廣西東恒華道酶制劑公司；本實驗所用化學試劑均為分析純 北京索萊寶科技有限公司。

GL-21M 高速冷凍離心機 湘儀離心機儀器有限公司；QP2010-SE 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司；VT32-20 頂空進樣瓶 日本島津公司；UV-2550 紫外可見分光光度計 島津儀器（蘇州）有限公司；57329 U DVB/CAR/PDMS 萃取頭 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；Flavour Spec 氣相離子遷移譜聯(lián)用儀 德國G.A.S 儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 牡蠣勻漿液的制備：新鮮太平洋牡蠣去殼，洗凈。為改善牡蠣風味，降低牡蠣咸腥味，反復用4 ℃的冰水混合物浸泡清洗牡蠣進行脫鹽處理，每次浸泡30 min，每隔15 min 測定鹽濃度直至參數(shù)不變。牡蠣蒸餾水洗凈、瀝干，打漿按牡蠣與蒸餾水質(zhì)量之比為1:2 添加蒸餾水。

牡蠣酶解液的制備：按5000 U/g（粗蛋白）在牡蠣勻漿液中加入動物蛋白酶，pH 維持自然條件（pH 約為6.5～7.0），50 ℃條件下酶解4 h，經(jīng)100 ℃滅酶處理10 min，冷卻至室溫后備用。

檸檬汁處理牡蠣酶解液的制備：將檸檬洗凈切開，擠壓取汁，濾去果肉，迅速裝入瓶中密封后冷藏保鮮備用。酶解前加入50%質(zhì)量分數(shù)檸檬汁（w 檸檬汁/w 牡蠣凈重），用飽和碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)pH 至6.5，共同參與水解反應，酶解條件與未添加檸檬汁的牡蠣酶解液相同。

1.2.2 抗氧化能力的測定 參考Wu 等的方法。將0.2 mmol/L DPPH 的95%乙醇溶液和檸檬汁或不同濃度的Trolox 1:1 混合，室溫下避光放置30 min，在517 nm 處測定吸光度。DPPH 自由基清除率計算如下式。用Trolox 制作標準曲線，檸檬汁的自由基清除活性表示為mol/L Trolox。

式中，A為樣品組（樣品+DPPH 溶液）的吸光度，A為空白組（樣品+95%乙醇）吸光度，A為對照組（去離子水+DPPH 溶液）的吸光度。

1.2.3 水解度的測定 采用鄰苯二甲醛法測定水解度。方法如下：7.62 g 硼砂和200 mg 十二烷基硫酸鈉（SDS）溶解于150 mL 去離子水中，160 mg 鄰苯二甲醛試劑（OPA）溶解于4 mL 無水乙醇后全部加入到溶有硼砂和SDS 的溶液中，再加入176 mg 二硫蘇糖醇（DTT），用去離子水定容到200 mL。用絲氨酸作標準品，繪制標準曲線。

牡蠣肉勻漿處理液的制備方法為：2 mL 牡蠣肉勻漿和4 mL 鹽酸（6 mol/L HCl）于120 ℃反應24～36 h。樣品根據(jù)濃度進行適當稀釋后備用。取3 mL OPA 溶液于不同離心管中，分別加入400 μL 蒸餾水、絲氨酸標準溶液、牡蠣肉勻漿處理液、待測樣品（不同條件下制備得到的牡蠣酶解液），分別渦旋充分混合5 s 后靜置等待反應2 min，迅速在340 nm 處測定吸光度。

根據(jù)公式計算水解度：

式中，A為牡蠣酶解液中游離氨基的含量，mg/mL；A為空白；A為牡蠣肉勻漿處理液（完全酸水解液）中游離氨基的含量，mg/mL。

1.2.4 硫代巴比妥酸反應物質(zhì)（TBARS）測定 參考蘇明月等的方法，在5 g 不同酶解時間下的牡蠣酶解液和經(jīng)檸檬汁處理牡蠣酶解液中加入25 mL 7.5 g/100 mL 的三氯乙酸（含0.1% EDTA），均質(zhì)混勻，50 ℃振蕩提取30 min，過濾。取濾液5 mL，加5 mL 0.02 mol/L 硫代巴比妥酸 （TBA）溶液，90 ℃反應30 min，冷卻至室溫。用1,1,3,3-四乙氧基丙烷作為標準品，繪制標準曲線在532 nm 波長處測定吸光度。

1.2.5 感官評定 將樣品放于100 mL 錐形瓶中，在密封條件下平衡30 min。選擇12 位經(jīng)過系統(tǒng)感官評定課程學習和培訓的感官評定員，年齡22～26 歲，經(jīng)嗅聞、討論后確定使用與牡蠣風味相關(guān)的描述詞，并分別對牡蠣及其酶解液進行評價。本實驗采用國際標準ISO 6564-1985《感官分析方法學—風味剖面檢驗》中的獨立方法對樣品進行感官評價，選擇貝肉香、青草味、水果香、蛤蜊味、魚腥味作為描述詞，將每種氣味的分值設置為0～5 分，分別代表（以貝肉香為例）0-無任何貝肉香、1-剛好可識別貝肉香、2-貝肉香弱、3-貝肉香中等、4-貝肉香強、5-貝肉香很強來表示其程度。

1.2.6 GC-IMS 測定條件 量取8 mL 樣品置于20 mL頂空進樣瓶中，進樣體積500 μL，進樣針溫度60 ℃。采用極性柱（MXT-WAX 15 m×0.53 mm×1 μm），柱溫50 ℃，IMS 溫度45 ℃，EI 流速設置為150 mL/min，載氣為氮氣。使用Library Search（Version 1.0.8）工作站，比較RI 和GC-IMS 庫分析定性每種化合物，利用LAV（Version 2.21 版本，G.A.S 公司出品）工作站完成實驗數(shù)據(jù)識別、整理及繪圖工作。

1.2.7 SPME-GC-MS 分析條件 固相微萃取條件：在20 mL 的頂空專用進樣瓶中裝入8 mL 待測樣品，旋緊瓶蓋后平穩(wěn)放置在振蕩器上，設置溫度60 ℃、萃取時間30 min，結(jié)束后立即將萃取頭插入QP 2010-SE 的進樣口，解析溫度250 ℃，解析時間4 min。

氣相色譜條件：HP-INNO Wax 色譜柱：30 m×0.25 mm×0.25 μm，載氣為高純氦氣（99.999%），氦氣流速為1.0 mL/min，不分流進樣，進樣口溫度250 ℃。起始柱溫40 ℃保持2 min，再以8 ℃/min 速度升溫至250 ℃保持10 min。

質(zhì)譜條件：溶劑切除時間1 min，離子阱溫度150 ℃，傳輸線溫度250 ℃，選用Scan 采集方式并設置掃描范圍為45～450 amu，掃描速率0.220 s/scan。EI 電子能量70 eV。

數(shù)據(jù)處理：采用島津GC-MSsolution（Version 4.4.1）工作站的NIST17.L Libraries 譜庫自動檢索各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)，選取匹配度大于80%的鑒定結(jié)果。用峰面積歸一化法確定物質(zhì)的相對含量。

1.2.8 關(guān)鍵風味成分分析 某一種揮發(fā)性化合物對整體風味的貢獻大小受其濃度和感覺閾值影響。感覺閾值越低，在同等濃度下該風味物質(zhì)對整體風味影響越大。經(jīng)推導，三者關(guān)系的計算公式如下：

其中C與T分別代表某一種風味物質(zhì)的相對濃度和對應的感覺閾值，C與T分別代表對總體風味貢獻最大的組分的相對濃度和對應的感覺閾值。各組分均滿足以下關(guān)系：0＜ROAV≤100，ROAV≥1 的風味物質(zhì)為關(guān)鍵風味成分，0.1≤ROAV＜1 的風味物質(zhì)為重要修飾性風味成分。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)平行測定三次，由Excel 和SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，＜0.05 表示差異顯著，分析結(jié)果由平均值±標準差，利用Origin 2018 對分析結(jié)果進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸檬汁抗氧化能力測定結(jié)果

檸檬汁在常溫條件下DPPH 自由基清除率為94.08%±1.12%，自由基清除活性為（54.12±0.71）mol/L Trolox，該結(jié)果高于翟培等測定的扁實檸檬汁的自由基清除率92.78%；檸檬汁在50 ℃條件密封加熱下自由基清除率為92.58%±0.84%，自由基清除活性為（53.24±0.49）mol/L Trolox，在加熱后檸檬汁的自由基清除率有所下降，但仍保持較高的自由基清除能力，這可能是由于多酚類、類黃酮及檸檬酸等抗氧化成分的含量不會因溫度升高而降低，因此所制備的檸檬汁仍具有較強的抗氧化能力。

2.2 檸檬汁處理前后牡蠣酶解液理化性質(zhì)的變化

2.2.1 水解度（DH）的變化 牡蠣酶解液的水解度隨著酶解時間的增加呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢（圖1），并在4 h 呈現(xiàn)峰值。酶解時間超過4 h 時水解度呈下降趨勢，可能原因在于隨酶解時間增加，更多的游離氨基酸被釋放出來，而其中的疏水性氨基酸會發(fā)生聚集，而后生成沉淀析出而致使水解度下降。由圖可知，經(jīng)檸檬汁處理后的牡蠣酶解液與未處理的牡蠣酶解液相比水解度無明顯差異。可能是由于經(jīng)pH 調(diào)整后的檸檬汁未對酶活產(chǎn)生影響，因此不改變牡蠣酶解液的水解度。

圖1 不同處理牡蠣樣品的水解度隨時間的變化情況Fig.1 The changes of degree of hydrolysis at different time in different treated oyster samples

2.2.2 TBARS 值的變化 氧自由基作用于不飽和脂肪酸，生成脂肪氧化產(chǎn)物，脂質(zhì)氧化程度可由脂肪氧化指標TBARS 反映。根據(jù)圖2 可知，添加檸檬汁后牡蠣酶解液的TBARS 值在酶解過程中1～4 h 內(nèi)無顯著變化（＞0.05），而無添加檸檬汁酶解過程中TBARS值變化顯著（＜0.05），其原因為檸檬汁的抗氧化活性抑制了牡蠣酶解過程中的脂質(zhì)氧化反應。

圖2 添加檸檬汁對牡蠣酶解液TBARS 值的影響Fig.2 The effects of adding lemon juice on TBARS value of oyster hydrolysates

2.3 感官描述分析

由圖3 可知，牡蠣勻漿液呈現(xiàn)出明顯的青草味，其次是魚腥味、水果香和貝肉香。經(jīng)酶解后魚腥味和蛤蜊味極顯著增強（＜0.01），這可能與酶解過程中發(fā)生的脂質(zhì)氧化反應相關(guān)；青草味極顯著下降（＜0.01），水果香顯著下降（0.01＜＜0.05），貝肉香基本維持不變。說明酶解后整體風味變差。該結(jié)果與張梅超的感官評定結(jié)果基本一致，但本研究中太平洋牡蠣在酶解后水果香顯著下降，可能由于所用的酶不同導致。經(jīng)過檸檬汁處理后牡蠣酶解液的魚腥味和蛤蜊味顯著降低（＜0.05），青草味顯著下降（＜0.05），水果味顯著提高（＜0.05），貝肉香與未脫腥前相比基本無變化，整體風味明顯改善。

圖3 不同處理牡蠣樣品氣味的感官評價雷達圖Fig.3 Sensory evaluation radar map of odor of different treated oyster samples

2.4 檸檬汁處理前后牡蠣酶解液揮發(fā)性風味成分的變化分析

2.4.1 GC-IMS 風味成分譜圖分析 將GC-IMS 分析的不同處理牡蠣樣品揮發(fā)性化合物（VOC）的數(shù)據(jù)以三維譜圖形式可視化（圖4），觀察圖4 可知，由VOC 三維譜圖很難將牡蠣勻漿和牡蠣酶解液的揮發(fā)性成分進行區(qū)分，但經(jīng)檸檬汁處理后的牡蠣酶解液和前二者出峰保留時間及峰強度均有明顯區(qū)別，說明經(jīng)檸檬汁處理后的VOC 種類和含量發(fā)生明顯改變，可能歸因于檸檬汁的抗氧化作用抑制了脂質(zhì)氧化反應，在減少或消除部分揮發(fā)性風味成分的同時引入了新的揮發(fā)性風味成分。

圖4 不同處理牡蠣樣品揮發(fā)性化合物的GC-IMS 三維譜圖Fig.4 GC-IMS three-dimensional spectra of volatile flavor compounds of different treated oyster samples

將不同處理牡蠣樣品VOC 三維譜圖投射生成二維地形圖（圖5），譜圖中每個亮點表示一種揮發(fā)性化合物，但某些具有高質(zhì)子親和力的分析物可能會有1～2 個或多個斑點（指示單體、二聚體或三聚體），具體取決于其濃度及性質(zhì)。亮點越多代表該處理牡蠣樣品中揮發(fā)性化合物種類越多，亮點顏色則代表某種揮發(fā)性化合物的信號強弱，紅色代表信號強，白色代表信號弱。牡蠣勻漿液及脫腥前后的牡蠣酶解液通過GC-IMS 技術(shù)可以得到較好地識別和分離，不同處理的牡蠣樣品表現(xiàn)出特征性的GC-IMS譜圖，尤其是檸檬汁脫腥處理后的牡蠣酶解液亮點區(qū)域發(fā)生明顯改變，部分紅色亮點區(qū)域增多，部分白色亮點區(qū)域消失。這可能歸因于檸檬汁中富含的多酚、類黃酮、檸檬酸、維生素E 等成分所具有的較強抗氧化能力，在酶解過程中與醛、酮、醇、烷烴等化合物發(fā)生作用，同時檸檬汁引入了部分檸檬獨有的風味物質(zhì)，改變了揮發(fā)性化合物的數(shù)量和種類。

圖5 不同處理牡蠣樣品揮發(fā)性化合物的GC-IMS 二維譜圖Fig.5 GC-IMS two-dimensional spectra of volatile flavor compounds of different treated oyster samples

2.4.2 GC-IMS 測定的揮發(fā)性化合物定性分析 經(jīng)過對比特征揮發(fā)性化合物的保留時間和遷移時間，使用Library Search 軟件，對不同處理牡蠣樣品揮發(fā)性風味成分進行定性分析，由于IMS 庫現(xiàn)有容量有限且有拖尾現(xiàn)象，僅對40 種化合物成功完成定性，包括12 種醛、12 種醇、5 種酮、3 種酸、4 種酯、2 種呋喃、2 種其他化合物（見表1）。其中，醛類和醇類物質(zhì)的種類最多，其次是酮類物質(zhì)。庚醛、壬醛、辛醛、（E）-2-辛烯醛、1-辛烯-3-醇等具有青草味、魚腥味和蛤蜊味，是水產(chǎn)品中常見的腥味和蛤蜊味來源，對魚腥味具有加和作用。明確定性的揮發(fā)性物質(zhì)C 鏈介于C～C，已鑒定出的風味成分主要包括具有魚腥味、青草味或花果香氣的醛類、醇類、酮類、酯類、酸類及呋喃類成分。

表1 基于GC-IMS 鑒定不同處理牡蠣樣品揮發(fā)性化合物Table 1 Volatile flavor compounds identified of oyster samples with different treatment methods detected by GC-IMS

2.4.3 特征揮發(fā)性成分指紋圖譜分析 利用GCIMS 分析牡蠣勻漿液和經(jīng)檸檬汁處理前后牡蠣酶解液揮發(fā)性風味物質(zhì)變化情況的指紋圖譜如圖6 所示。

圖6 不同處理牡蠣樣品揮發(fā)性化合物指紋譜圖Fig.6 Gallrey plot of volatile flavor compounds in oyster samples with different treatment methods

a 區(qū)中（E,E）-2,4-辛二烯醛、庚醛、壬醛、（E）-2-辛烯醛、辛醛、1-辛烯-3 醇均為具有土腥味、蛤蜊味等不良風味的揮發(fā)性風味化合物，且由于閾值較低會對整體風味產(chǎn)生顯著影響。（E）-2-辛烯-1-醇，具有泥土味，在白鏈魚糜等水產(chǎn)品中是重要的特征風味成分。牡蠣酶解液經(jīng)檸檬汁處理后，上述風味物質(zhì)被檢出的含量明顯下降，證實其具有風味改善效果。b 區(qū)包含戊酸（刺激性氣味）、丁酸（刺激性氣味）、丁酸內(nèi)酯、戊醛（辛辣氣息，稀釋后呈果香味）、2-苯乙醛、甲硫基丙醛（醬味、洋蔥味、紅燒肉味），是牡蠣酶解液中較其他兩種試樣更為突出的揮發(fā)性風味物質(zhì)，在風味改善后含量降低或未檢出。c 區(qū)是經(jīng)檸檬汁處理后牡蠣酶解液中含量較牡蠣勻漿及牡蠣酶解液含量增加的揮發(fā)性風味化合物，包含蒎烯、苯甲醇、氧化芳樟醇、十二醛、2-庚酮、2-甲氧基苯酚、乙酸丁酯。蒎烯具有松木味；氧化芳樟醇又稱2-甲基-2-乙烯基-5-四氫呋喃，具有強烈的甜香、草本香氣和鮮花香氣，工業(yè)常用于增強水果和茶類等香精的香氣和口感；十二醛具有強烈脂肪香氣，并有類似松葉油和橙油的強烈香氣；2-庚酮具有一定的果香味；2-甲氧基苯酚又稱為愈創(chuàng)木酚，是一種天然有機物，具有特殊的香味，常用作香料，乙酸丁酯為有果香氣味的風味物質(zhì)，可為整體氣味貢獻愉快的果香氣味。綜上，經(jīng)檸檬汁處理后的牡蠣酶解液具有更多愉快氣味的揮發(fā)性風味化合物，主要呈現(xiàn)花香、果香、甜香等風味特征。而呈魚腥味、蛤蜊味等不愉快氣味特征的揮發(fā)性風味成分含量明顯降低。由于GCIMS 與SPME-GC-MS 檢測原理不同，所檢測到的醛類、醇類、烯烴、芳香族化合物存在區(qū)分，因此，該結(jié)果可與本研究中SPME-GC-MS 技術(shù)鑒定結(jié)果互為補充。

2.4.4 基于GC-IMS 的主成分分析 將GC-IMS 所檢出的牡蠣勻漿、牡蠣酶解液和經(jīng)檸檬汁處理牡蠣酶解液中揮發(fā)性成分數(shù)據(jù)進行主成分分析，結(jié)果見圖7。PC1（61%）和PC2（28%）疊加貢獻率可達89%，說明這兩部分代表了樣品絕大部分信息，PCA結(jié)果具有可信性。不同處理牡蠣樣品風味物質(zhì)主成分得分圖具有明顯差距，說明牡蠣勻漿、牡蠣酶解液、檸檬汁處理后牡蠣酶解液揮發(fā)性成分之間存在較大差異。該結(jié)果與指紋圖譜分析及感官描述分析規(guī)律一致，表明本研究采用GC-IMS 對不同處理牡蠣樣品的揮發(fā)性風味物質(zhì)分析結(jié)果具有可行性。

圖7 不同處理牡蠣樣品揮發(fā)性化合物主成分分析圖Fig.7 Principal component analysis of volatile flavor compounds in oyster samples with different treatment methods

2.5 檸檬汁處理前后牡蠣酶解液SPME-GC-MS 分析結(jié)果

2.5.1 揮發(fā)性成分風味分析 采用SPME-GC-MS技術(shù)，經(jīng)標準譜庫檢索匹配，以面積歸一化法計算相對百分含量進行分析，檸檬汁處理前后的牡蠣脫腥酶解液揮發(fā)性風味成分及特征見表2。由表2 及圖8可知，牡蠣酶解液中共檢測出56 種揮發(fā)性風味化合物，其中，醛類16 種，相對含量37.46%；醇類16 種，相對含量32.69%；酮類9 種，相對含量10.61%；烯烴類4 種，相對含量8.37%；其他化合物（烷烴類、炔烴類、呋喃類、酸類、酯類）11 種，相對含量10.87%。檸檬汁處理后的牡蠣酶解液中共檢測出66 種揮發(fā)性風味化合物，其中醛類增加4 種，相對含量下降12.13%；醇類減少5 種，相對含量下降16.18%；烯烴類增加4 種，相對含量上升34.47%；酮類增加2 種，相對含量下降3.34%；其他化合物16 種，相對含量之和為8.05%。

表2 檸檬汁處理前后牡蠣酶解液的揮發(fā)性風味成分分析Table 2 Analysis of volatile flavor compounds in oyster hydrolysate and oyster hydrolysate with lemon juice

圖8 檸檬汁處理前后牡蠣酶解液的揮發(fā)性風味成分統(tǒng)計Fig.8 Relative amount of different types of volatile flavor compounds in oyster hydrolysis solution and oyster hydrolysis solution with lemon juice

醛類物質(zhì)是在水產(chǎn)品風味中起主導作用的一類物質(zhì)。醛類閾值較低，且部分醛類物質(zhì)可與其他組分產(chǎn)生明顯的風味重疊效果，因此，痕量存在時即可對風味產(chǎn)生顯著貢獻。檸檬汁處理后牡蠣酶解液中己醛、庚醛、辛醛、（E）-2-辛烯醛、（E,E）-2,4-庚二烯醛相對含量從1.12%、2.49%、4.36%、3.70%、7.24%分別下降至0.60%、0.67%、1.15%、0.83%、0.75%。這些直鏈飽和醛、烯醛和二烯醛是由不飽和脂肪酸氧化產(chǎn)生的，是牡蠣酶解液中魚腥味的主要來源。（E,E）-2,4-葵二烯醛具有強烈的雞香和雞油味，是亞油酸氧化產(chǎn)生的，經(jīng)檸檬汁處理脫腥后相對含量從0.26%下降為0.12%，這可能是由于檸檬汁中富含類黃酮、多酚和V等抗氧化成分在檸檬汁參與共酶解過程中抑制了牡蠣不飽和脂肪酸的氧化，降低了上述不飽和脂肪酸及亞油酸氧化產(chǎn)物的生成，降低了牡蠣酶解液的魚腥味。此外，檸檬汁脫腥后增加了具有愉快氣味的醛類物質(zhì)，如（E）-2-己烯醛（清香、脂肪香）、（Z）-2-庚烯醛（蔬菜香、類亞麻油香）、癸醛（甜香、蠟香、花香、橘香）、苯甲醛（杏仁味）、（E）-壬烯醛（脂肪及黃瓜味）、紫丁香醛C（花香味）、肉豆蔻醛（脂肪香、蠟香、牛奶香、奶油香）相對含量從0.89%、0.00%、0.00%、2.43%、1.13%、0.00%、0.00%分別增加為3.32%、0.39%、0.16%、4.36%、2.35%、4.13%、0.09%，為脫腥后的牡蠣酶解液貢獻了果蔬香、脂香、花香等愉快氣味。

檸檬汁脫腥前后醇類物質(zhì)種類及相對含量發(fā)生了較大改變，但由于飽和的長鏈醇一般閾值很高，故對整體氣味影響很小，但部分不飽和醇類物質(zhì)會對香氣產(chǎn)生顯著影響。檸檬汁脫腥后1-辛烯-3-醇（閾值1 μg/kg）相對含量由10.34%下降為1.65%，1-戊烯-3-醇（閾值358.1 μg/kg）相對含量由3.81%下降為0.30%。其中，1-辛烯-3-醇具有魚腥味、菇類氣味，由于閾值較低常被認為是水產(chǎn)品中土腥味的主要來源。推斷該兩種成分的下降是由于檸檬汁的抗氧化作用抑制了牡蠣酶解過程中脂肪的氧化反應，減少了牡蠣酶解液中的不良風味。酮類物質(zhì)相對含量的改變可能與部分氨基酸的降解和美拉德反應有關(guān)，貝類中發(fā)現(xiàn)的甲基酮（C～C）一般可為整體氣味貢獻芳香味、水果香，檸檬汁脫腥后新增了3-辛酮（樹脂清香、相對含量1.85%）和檸檬的特征香氣成分2-十一酮（柑橘類香氣、相對含量2.46%）。烯烴類物質(zhì)是檸檬中一類重要的揮發(fā)性風味成分，檸檬汁脫腥后月桂烯（令人愉快的甜香脂味）、D-檸檬烯（甜香，柑橘香，檸檬香氣）、蒈烯（類似檸檬的宜人香氣）相對含量從0.00%、0.00%、2.29%分別上升為21.37%、10.61%、4.91%，為整體風味貢獻了令人愉快的水果香氣、甜香脂味。Allegrone 等利用SPME-GCMS 技術(shù)比較了四種不同品種的新鮮檸檬汁揮發(fā)性物質(zhì)含量，主要成分均為單萜，檸檬烯占54%～68.8%，說明經(jīng)檸檬脫腥后的牡蠣酶解液增加的烯烴類芳香物質(zhì)主要來自于檸檬汁所具有的單萜烯烴類揮發(fā)性化合物，可對不良風味起到掩蔽作用。

續(xù)表 2

酯類物質(zhì)是由醇和羧酸通過酯化反應生成，通常與美拉德反應有關(guān)，有部分可能由于加熱滅酶而產(chǎn)生，一般來說香氣良好。檸檬汁脫腥后產(chǎn)生了兩種新的酯類物質(zhì)，相對含量較低，對整體氣味貢獻不大。酸類物質(zhì)和烷烴類物質(zhì)一般閾值較高且相對含量有限，對風味貢獻程度不大。呋喃類成分通常有較低的香氣閾值，會對整體氣味產(chǎn)生一定影響，檸檬汁脫腥后增加了兩種呋喃類物質(zhì)，即2,3-二氫呋喃和2-戊基呋喃（土豆和蔬菜香氣）；2-乙基呋喃（豆香、面包香、麥芽香）僅在牡蠣酶解液中檢出。

2.5.2 關(guān)鍵揮發(fā)性風味化合物分析 結(jié)合感覺閾值對表2 牡蠣酶解液及檸檬汁脫腥處理牡蠣酶解液的揮發(fā)性風味成分進行分析對比，確定每種揮發(fā)性風味成分的氣味活度值（OAV）及最大氣味活度值（OAV）物質(zhì)，根據(jù)公式計算其他風味物質(zhì)ROAV 值，將關(guān)鍵風味物質(zhì)及修飾性風味物質(zhì)列于表3。牡蠣酶解液中關(guān)鍵風味物質(zhì)有（E,Z）-2,6-壬二烯醛（紫羅蘭香氣、黃瓜似香氣）、（E）-壬烯醛（脂肪及黃瓜味）、辛醛（魚腥味）和1-辛烯-3-醇（魚腥味、菇類氣味），ROVA 值分別為100、3.29、2.03 和1.85。修飾性風味成分中有具有魚腥味、蛤蜊味的（E）-2-辛烯醛、庚醛、（E,E）-2,4-庚二烯醛，ROAV 值分別為0.29、0.19、0.11，兩種具有花果香氣味的壬醛、苯乙醛的ROAV 值分別為0.25、0.19。牡蠣酶解液的主要氣味特征以青草味、魚腥味和蛤蜊味為主，該結(jié)果與感官描述分析結(jié)論一致。

表3 檸檬汁處理前后牡蠣酶解液的關(guān)鍵揮發(fā)性風味成分分析Table 3 Analysis of key volatile flavor compounds in oyster hydrolysate and oyster hydrolysate with lemon juice

檸檬汁脫腥處理后，關(guān)鍵風味成分中辛醛（魚腥味、蛤蜊味）的ROAV 值下降為1.76，1-辛烯-3-醇不再作為關(guān)鍵風味成分出現(xiàn)，（E,Z）-2,6-壬二烯醛仍為ROAV 值最大的成分，（E）-壬烯醛ROAV 值上升為22.42，關(guān)鍵風味成分新增了具有甜脂香氣的月桂烯和呈甜香、蠟香、花香和橘香的癸醛，ROAV 值分別為1.17 和1.22。修飾性風味成分中增加了6 種具有愉快花香、果香、蔬菜香特點的揮發(fā)性風味化合物，包括D-檸檬烯（甜香、柑橘香、檸檬香氣）、（Z）-2-庚烯醛（蔬菜香、類亞麻油香）、十一酮（柑橘類香氣）、2-戊基呋喃（土豆和蔬菜香氣）、1 -庚醇（強烈芳香氣味）、2-壬酮（花果香、油脂香氣）；壬醛（花香、蠟香、脂香、橘香）、苯乙醛（低濃度呈果香）ROAV 值上升，可能是由于引入了檸檬所含具有愉快風味特征的揮發(fā)性風味成分；魚腥味、蛤蜊味的庚醛和（E）-2-辛烯醛ROAV 值下降。說明檸檬汁的添加對牡蠣酶解液的風味具有良好改善作用。但對比張梅超采用姜汁-酵母發(fā)酵及黃可欣采用酵母-殼聚糖等聯(lián)合脫腥方法，檸檬汁對1-辛烯-3 醇、壬醛、庚醛的脫除能力有限，可能是由于檸檬汁不能脫除牡蠣生長過程中富集在體內(nèi)的腥味成分。

3 結(jié)論

在太平洋牡蠣肉酶解過程中添加檸檬汁可抑制不飽和脂肪酸的氧化，降低TBARS 值，但不會影響酶解液的理化性質(zhì)，該方法操作簡單、便捷。本文結(jié)合GC-IMS 和SPME-GC-MS 技術(shù)對檸檬汁脫腥前后牡蠣酶解液的揮發(fā)性風味化合物及關(guān)鍵風味物質(zhì)變化進行了詳細分析。添加檸檬汁實現(xiàn)牡蠣酶解液風味改善的原因有二，一方面可通過抑制酶解過程中不飽和脂肪酸氧化，減少直鏈飽和醛、烯醛和二烯醛的生成，從而降低牡蠣酶解液的魚腥味；另一方面，引入檸檬自身具有的花香、檸檬香和甜脂香特征的烯烴類和酮類風味物質(zhì)，豐富牡蠣酶解液的整體氣味，對魚腥味等不良氣味起到掩蔽作用。但是，本研究仍存在以下不足：本方法對于在牡蠣體內(nèi)富集的來自外界環(huán)境的土腥味成分和微生物代謝相關(guān)的腥臭味成分的脫除能力有限（如辛醛、庚醛等），需聯(lián)合其他方法進一步脫除。此外，關(guān)于檸檬汁與牡蠣酶解液中風味物質(zhì)及脂肪氧化過程的相互作用機理還有待進一步探究。