基于液質(zhì)聯(lián)用和分子對接技術(shù)對薄蒴草抗炎活性成分的篩選

吳孟雅，張楠茜，張凱月，呂經(jīng)緯，蘭 夢，張 輝，孫佳明

（長春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，吉林長春 130117）

薄蒴草（Fisch. et Mey.）為石竹科薄蒴草屬唯一植物，生長于我國西藏、青海、甘肅、陜西、內(nèi)蒙古、新疆等地，北緯26°～34°的亞洲其他溫帶地區(qū)分布亦較為廣泛。薄蒴草為一年生草本植物，因其遮光、吸水、吸肥的特點，在新疆哈密地區(qū)豌豆、油菜農(nóng)地里被作為雜草處理，目前對其食用、藥用研究仍處于起步階段，也尚未見有對薄蒴草活性及成分的相關(guān)報道。

《中華本草》記載，薄蒴草花期可全草入藥，中藥名為娘娘菜，味甘，性微寒，具有清熱利肺，散瘀托毒之功效，常用于治療肺熱咳嗽和癰疽疔瘡。因肺熱引起咳嗽的病人多有細(xì)菌或支原體感染所致的炎癥反應(yīng)，結(jié)合報道從生源相近的漆姑草全草中分離得到四個黃酮衍生物，并發(fā)現(xiàn)腹腔注射10 mg/kg 的漆姑草黃酮苷對大鼠有明顯的抗炎作用，推測薄蒴草亦可能具有抗炎活性。近年來研究發(fā)現(xiàn)食源性黃酮類物質(zhì)具有一定的抗炎活性并在調(diào)節(jié)人體健康中起著積極作用，在炎癥性疾病的防治中具有廣闊的應(yīng)用前景。因此，從薄蒴草中尋找安全有效的天然黃酮類抗炎物質(zhì)對于其野生資源的開發(fā)利用意義重大。

因激活的炎癥反應(yīng)能誘導(dǎo)多種促炎介質(zhì)如一氧化氮（NO）、腫瘤壞死因子-（TNF-）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）和前列腺素E（PGE）的過量分泌，故本文通過考察薄蒴草不同極性萃取部位對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7 產(chǎn)生NO、TNF-、IL-6 的影響以篩選其抗炎活性部位。目前，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)和分子對接技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于植物活性成分的全面分析，本文應(yīng)用HPLC-MS 對抗炎活性部位的化學(xué)成分進(jìn)行分析，結(jié)合分子對接技術(shù)以小分子化學(xué)成分與激活的炎癥反應(yīng)中主要炎癥因子TNF-、IL-6、IL-1、PGE、核轉(zhuǎn)錄因子-B（NF-B）進(jìn)行對接，最終根據(jù)結(jié)合能篩選出薄蒴草的抗炎活性因子，為其進(jìn)一步的開發(fā)應(yīng)用提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

薄蒴草 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)提供，長春中醫(yī)藥大學(xué)張輝教授鑒定為傘形科薄蒴草屬薄蒴草（Fisch. et Mey.）的干燥全草；小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞株RAW 264.7 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心；胎牛血清 美國賽默飛世爾科技公司；胰蛋白酶（2500 Kat） 美國阿姆雷斯科公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）、DMEM 培養(yǎng)基、雙抗（100 μg/mL 的青霉素、100 μg/mL 的鏈霉素） 美國?？寺」?；脂多糖（LPS） 美國西格瑪奧德里奇公司；二甲基亞砜、地塞米松 北京索萊寶科技有限公司；NO 檢測試劑盒 美國蘭德公司；TNF-、IL-6 酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒 美國普洛麥格公司；甲醇和乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

RRLC-QTOF/MS 高分辨快速液相四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國沃特斯公司；BSA124SCW 電子天平 德國賽多利斯公司；Milli-Q 超純水儀 美國貝德福德公司；KS-5200DB 型清洗器 昆山潔力美超聲儀器有限公司；BIO Memory-86 ℃超低溫冰箱 法國淶鉑銳公司；YZ-875 超凈工作臺蘇州凈化設(shè)備廠；Microfuge.22RCentrifuge 型高速低溫離心機 美國貝克曼庫爾特公司；多規(guī)格培養(yǎng)皿美國康寧公司；HERAEUS HERA cell 150 二氧化碳培養(yǎng)箱 日本三洋公司；THZ-C 旋轉(zhuǎn)式恒溫振蕩器 蘇州培英實驗設(shè)備有限公司；Mode 1680 型酶標(biāo)儀 日本寶生物工程株式會社。

1.2 實驗方法

1.2.1 薄蒴草不同極性部位制備 取薄蒴草300 g，粉碎，置圓底燒瓶中，10 倍量70%乙醇回流提取3 次，每次1 h。合并提取液，回收乙醇，減壓濃縮至無醇味。濃縮液依次用等倍量的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取3 次，減壓回收溶劑，干燥，得到薄蒴草石油醚部位（SYM）8.85 g、二氯甲烷部位（ELJW）0.30 g、乙酸乙酯部位（YSYZ）0.90 g、水飽和正丁醇部位（ZDC）2.82 g 和萃后水液（SY）22.14 g，備用。

1.2.2 薄蒴草抗炎活性部位篩選 本實驗通過研究薄蒴草不同極性萃取部位對LPS 誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO、TNF-和IL-6 的影響進(jìn)行薄蒴草抗炎活性部位的篩選。首先，RAW 264.7 在37 ℃、5%CO的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)于DMEM 培養(yǎng)基中。將RAW 264.7 細(xì)胞（1×10個/mL）接種在96 孔培養(yǎng)板中，在37 ℃、5% CO完全濕潤的環(huán)境中孵育24 h。除空白對照組外其他組別用1 μg/mL LPS 刺激細(xì)胞，孵育24 h。以加入100 μL 含有不同濃度（25、50、75 μg/mL）的薄蒴草不同極性部位的培養(yǎng)基為實驗組，以加入100 μL 地塞米松（100 μmol/L）為陽性對照組，空白對照組和模型對照組加入相同體積的培養(yǎng)基，每組設(shè)置三復(fù)孔，在培養(yǎng)箱中反應(yīng)24 h。最后使用NO 檢測試劑盒（硝酸還原酶法）測定NO 水平，使用TNF-、IL-6 酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒測定TNF-和IL-6 的濃度。

1.2.3 薄蒴草抗炎活性部位HPLC-MS 分析 采用HPLC-MS 鑒定薄蒴草抗炎活性部位中的化學(xué)成分，樣品使用甲醇溶解，濃度為1 μg/mL，設(shè)置相應(yīng)參數(shù)，進(jìn)樣方式采用自動進(jìn)樣。

色譜質(zhì)譜條件如下，固定相：Agilent Eclipse Plus-C色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相A 為乙腈，B 為1‰甲酸水溶液。采用二元線性梯度洗脫，洗脫條件為0～10 min：35%～60% A、65%～40% B，10～40 min：60%～85% A、40%～15% B。流速：0.6 mL/min，進(jìn)樣量：20 μL，柱溫：30 ℃。質(zhì)譜條件：采用電噴霧負(fù)離子模式；質(zhì)量掃描范圍：m/z 100～2200；干燥氣流速：10.0 L/min；氣體溫度：350 ℃；霧化氣壓力：255 kPa；毛細(xì)管電壓：3.5 kV，錐孔電壓：65 V，裂解電壓：150 V。檢測樣本前，校正質(zhì)量軸。

1.2.4 分子對接 檢索Pubchem 數(shù)據(jù)庫（https://www.pubchem.org/），下載抗炎活性部位中化學(xué)成分的sdf 2D 結(jié)構(gòu)的分子式，通過Chem 3D 軟件轉(zhuǎn)換為pdb格式，使用Autodock 確認(rèn)可旋轉(zhuǎn)的鍵并保存為pdbqt格式，以備后續(xù)對接使用。

通過RSCB PDB 數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/）下載重要蛋白受體的pdb 格式文件，經(jīng)Pymol 對其進(jìn)行去水、加氫等操作，使用Autodock 保存為pdbqt格式。通過查詢文獻(xiàn)確定重要蛋白受體的結(jié)合位點坐標(biāo)及尺寸并按照相關(guān)格式保存為txt 格式。其中各靶點的box 大小均為26×26×26，盒子中心坐標(biāo)分別為TNF-（2az5，-17.53，67.5，17.19）、IL-6（4cni，82.27，-33.6，-11.52）、IL-1（5r8q，48.11，5.14，75.31）、PGE（5k0i，-1.01，14.38，6.9）、NF-B（6sh6，18.2，-20.47，0.89）?？寡谆钚圆课恢谢瘜W(xué)成分所有可旋轉(zhuǎn)鍵均設(shè)為柔性，重要蛋白受體設(shè)置為鋼性，搜尋精度exhaustiveness 設(shè)為64，格點間距1?，其他參數(shù)默認(rèn)，運行Autodock Vina 采用拉馬克遺傳算法對接運算100 次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 薄蒴草抗炎活性部位篩選

薄蒴草不同極性萃取部位對LPS 誘導(dǎo)的RAW 264.7 細(xì)胞產(chǎn)生NO、TNF-和IL-6 的影響如圖1所示。與空白組相比，LPS 刺激后NO、TNF-和IL-6 釋放量顯著增加（＜0.05）。與模型組相比，薄蒴草不同極性萃取部位在不同的試驗濃度下，對NO、TNF-、IL-6 的釋放均有不同程度地顯著抑制（＜0.01，＜0.05）。相比之下，乙酸乙酯部位強于其他各組，與模型組相比在最高實驗濃度75 μg/mL 下對NO、TNF-、IL-6 的產(chǎn)生均有極顯著抑制作用（＜0.01），抑制率分別為63.53%、34.23%、34.58%，且隨著濃度的增加，NO、TNF-、IL-6 釋放量總體呈下降的趨勢。這表明在試驗濃度下，乙酸乙酯部位對LPS 誘導(dǎo)的RAW 264.7 細(xì)胞炎癥狀態(tài)具有緩解作用，且呈一定的劑量依賴性。實驗組NO、TNF-、IL-6 釋放量與陽性藥物組無顯著差異（＞0.05），該結(jié)果表明薄蒴草不同極性部位在25～75 μg/mL 的濃度下具有良好的抗炎效果。

Fig.1 The effect of Lepyrodiclis holosteoides extractions on LPS-induced production of NO, TNF-α and IL-6 in RAW 264.7 cells

2.2 薄蒴草抗炎活性部位HPLC-MS 分析

取“1.2.1”項中薄蒴草抗炎活性部位樣品0.1 mg溶于10.0 mL 甲醇，過0.45 μm 有機膜，經(jīng)HPLC-ESIMS/MS 分析，得質(zhì)譜總離子流圖（圖2）。

圖2 薄蒴草乙酸乙酯部位中化學(xué)成分的總離子流圖Fig.2 TIC chromatogram of compounds in the ethyl acetate extract of Lepyrodiclis holosteoides

依據(jù)各色譜峰的分子離子峰及主要碎片峰進(jìn)行解析，其中峰10 在負(fù)離子模式下，質(zhì)譜給出準(zhǔn)分子離子峰為269.0430[M-H]，推斷其分子式為CHO，以m/z 269.0430 作為母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜分析。所得二級質(zhì)譜圖中有明顯的碎片離子m/z 227、185、150、133。與文獻(xiàn)報道的芹菜素母離子裂解形成特征碎片離子一致，并與文獻(xiàn)[12]對比，確定此化合物為芹菜素?；谝陨辖馕鲞^程和裂解規(guī)律，結(jié)合文獻(xiàn)[12-18]對比，從薄蒴草抗炎活性部位指認(rèn)了8 個黃酮類成分蘆丁、牡荊素、山奈酚、鼠李秦素、槲皮素、芹菜素、芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-木糖苷、槲皮苷和3 個香豆素類成分傘形花內(nèi)酯、7-甲氧基香豆素、5,7-二羥基香豆素，結(jié)果見表1。

表1 薄蒴草乙酸乙酯部位中化學(xué)成分的HPLC-DAD-ESI-MS2 分析Table 1 HPLC-DAD-ESI-MS2 analysis of compounds in the ethyl acetate extract of Lepyrodiclis holosteoides

2.3 分子對接

將質(zhì)譜鑒定出的結(jié)構(gòu)明確的11 個成分與5 個靶點，通過Autodock Vina 軟件進(jìn)行分子對接，通過多構(gòu)象的對接結(jié)果篩選出每個靶點結(jié)合能最低的構(gòu)象，使用Origin Lab 將對接結(jié)果繪制成熱圖（圖3）。結(jié)果顯示，11 個成分均可以與TNF-（2az5）、IL-6（4cni）、IL-1（5r8q）、PGE（5k0i）、NF-B（6sh6）較好地結(jié)合，且對接結(jié)果中均有優(yōu)于陽性藥地塞米松所對應(yīng)的成分，即11 個成分具有潛在的抗炎活性。結(jié)合能結(jié)果（表2）表明5 個靶點TNF-、IL-6、IL-1、PGE、NF-B 的最佳構(gòu)象的對接成分分別是槲皮苷、山奈酚、蘆丁、槲皮苷、牡荊素，均是黃酮類成分。它們系通過2～3 個氫鍵與對應(yīng)靶點活性中心的氨基酸殘基相互作用而獲得了較低的自由結(jié)合能。TNF-、IL-6、IL-1、PGE、NF-B 與對應(yīng)成分結(jié)合能最低的構(gòu)象用Pymol 程序進(jìn)行可視化分析，結(jié)果見圖4。

圖4 槲皮苷、山奈酚、蘆丁、槲皮苷、牡荊素分別與TNF-α、IL-6、IL-1β、PGE2、NF-κB 的分子對接模式Fig.4 Molecular docking pattern of quercetin, kaempferol, rutin, quercetin, vitexin with TNF-α, IL-6, IL-1β, PGE2, NF-κB main protease

表2 活性成分及陽性藥與TNF-α、IL-6、IL-1β、PGE2、NF-κB 的結(jié)合能（kcal/mol）Table 2 Binding energies of bioactive compounds and positive drug with TNF-α, IL-6, IL-1β, PGE2, NF-κB (kcal/mol)

圖3 對接結(jié)果Total-score 熱圖Fig.3 Total-score heat map of docking results

3 討論與結(jié)論

巨噬細(xì)胞在自然免疫中起著關(guān)鍵作用，活化的巨噬細(xì)胞可以引發(fā)和促進(jìn)多種炎癥反應(yīng)。炎癥發(fā)生時，巨噬細(xì)胞分泌大量NO，激活NF-B 信號通路，誘導(dǎo)高濃度促炎細(xì)胞因子NO、TNF-和IL-6 的分泌。中和和抑制LPS 誘導(dǎo)的炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子已經(jīng)成為預(yù)防和治療炎癥損傷的主要思想和方法之一。薄蒴草抗炎活性部位能夠較好地抑制NO、TNF-和IL-6 等炎癥因子的釋放，說明薄蒴草具有良好的抗炎活性。經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用分析，從薄蒴草抗炎活性部位中分析出了8 個黃酮類成分和3 個香豆素類成分。黃酮類成分有蘆丁、牡荊素、山奈酚、鼠李秦素、槲皮素、芹菜素、芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-木糖苷、槲皮苷等，香豆素類有傘形花內(nèi)酯、7-甲氧基香豆素、5,7-二羥基香豆素等，其中含量較高的為蘆丁和傘形花內(nèi)酯。分子對接結(jié)果顯示槲皮苷、山奈酚、蘆丁、槲皮苷、牡荊素與TNF-、IL-6、IL-1、PGE、NF-B 等5 個重要抗炎靶點結(jié)合較好，提示黃酮類成分為薄蒴草的潛在抗炎活性物質(zhì)。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，蘆丁是一種廣泛存在于自然界多種植物中的天然黃酮類化合物，含量較為豐富，具有良好的抗炎作用。楊杰發(fā)現(xiàn)蘆丁能夠通過介導(dǎo)TLR4-MYD88-TRAF6-NF-B 炎癥信號通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，發(fā)揮抗炎作用。LI 等發(fā)現(xiàn)牡荊素可下調(diào)炎癥因子如TNF-、IL-1的表達(dá)，并改變高脂飲食小鼠腸道微生物群的組成，通過調(diào)節(jié)特定細(xì)菌的豐度來調(diào)節(jié)炎癥。陳丹發(fā)現(xiàn)山奈酚能夠有效降低CFA 造模引起的IL-6、TNF-、IL-等炎癥因子的表達(dá)，減少炎癥因子聚集，改善小鼠足底造模部位炎癥情況。趙妍發(fā)現(xiàn)山奈酚能夠通過抑制肺組織促炎因子NF-B、IL-1、TNF-的表達(dá)而發(fā)揮LPS 致小鼠急性肺損傷的保護(hù)效應(yīng)。YANG等發(fā)現(xiàn)鼠李秦素能通過抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)對創(chuàng)傷性腦損傷小鼠起到保護(hù)作用。司麗君等發(fā)現(xiàn)槲皮素具有良好的抗炎活性，能促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，抑制T、B 細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的分泌。芹菜素是一種天然黃酮類化合物，廣泛分布于各種蔬菜、水果、豆科植物、茶葉等食源性植物中。大量關(guān)于芹菜素的研究表明，這種特殊的天然化合物具有潛在的抗氧化、抗炎、抗癌、抗病毒、提高自身免疫等多種生物活性。GAN 等發(fā)現(xiàn)傘形花內(nèi)酯給藥能有效逆轉(zhuǎn)心肌梗死大鼠中TNF-、IL-6 和IL-1等炎癥因子濃度的升高。唐春麗等發(fā)現(xiàn)從青花椒根皮中分離得到的7-甲氧基香豆素具有較強的抗NO 生成活性。

綜上所述，薄蒴草抗炎活性部位中多個黃酮類成分能夠抑制NO、IL-6 和TNF-等炎癥因子釋放以發(fā)揮其抗炎活性。因此，薄蒴草的主要抗炎功能因子為黃酮類成分，這為其在抗炎相關(guān)食品中的進(jìn)一步應(yīng)用和開發(fā)提供了參考。