96 個(gè)大白菜品種根腫病抗性鑒定及位點(diǎn)檢測(cè)

魏小春，原玉香，趙艷艷，楊雙娟，王志勇，蘇賀楠，李軍黨，李 林，牛劉靜，張曉偉

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所 鄭州 450002； 2.鄭州大學(xué)農(nóng)學(xué)院 鄭州 450001）

大白菜原產(chǎn)于中國(guó)北方，是我國(guó)重要的露地蔬菜，素有菜中之王的美稱。根腫病是由鞭毛菌亞門蕓薹根腫菌（Woron）侵染引起的土傳病害，在許多國(guó)家都有發(fā)生。根腫菌通過(guò)感染十字花科植物的根部，使之形成腫瘤或腐爛，最終導(dǎo)致整株植物枯萎甚至死亡。

隨著大白菜根腫病逐年加重，化學(xué)、生物及農(nóng)業(yè)措施在防治根腫病中的效果呈下降趨勢(shì)。從生態(tài)環(huán)境方面考慮，培育抗病品種將是解決根腫病的有效方法。目前，在大白菜和歐洲蕪菁上已定位了32 個(gè)抗根腫病位點(diǎn)：、、、、、、、、等。研 究 較 多 的 是、、、、、位點(diǎn)。其中，、和CRb抗病基因已成功克隆且都為TIR-NB-LRR 類抗病基因。抗病基因的克隆和抗病位點(diǎn)的鑒定為培育更好的大白菜抗病品種提供了依據(jù)。河南省新野縣大白菜種植面積較大，其面臨根腫病的困擾日益嚴(yán)重，目前主要的根腫病菌株是4號(hào)生理小種新野新菌和新野老菌。在本研究中，筆者利用新野老菌及新野新菌病原菌對(duì)96個(gè)大白菜材料進(jìn)行接菌鑒定，同時(shí)，利用已報(bào)道的、、、、、等6 個(gè)標(biāo)記對(duì)大白菜品種進(jìn)行抗性位點(diǎn)檢測(cè)，明確不同位點(diǎn)與根腫病抗性的關(guān)系，進(jìn)而為選育抗根腫病大白菜資源提供分子標(biāo)記基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

2020 年9—11 月在河南省新野縣河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所葉類蔬菜研究室根腫病原圃開(kāi)展試驗(yàn)，根腫病菌株分為新野老菌4 號(hào)生理小種和新野新菌4 號(hào)生理小種，96 份大白菜材料由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所葉類蔬菜生物育種課題收集保存（表1）。

表1 供試的96 個(gè)大白菜品種

續(xù)表1

1.2 方法

試驗(yàn)材料的種植及鑒定均在河南省農(nóng)科院園藝所新野縣根腫菌病原圃進(jìn)行，其中AKIMEKI 為抗病對(duì)照，Chiifu 和ECD05 為感病對(duì)照，每份大白菜品種種植36 棵。筆者采用苗期穴盤人工接種鑒定方法，設(shè)置了3 次重復(fù)，制備1×10個(gè)·mL的根懸浮液，并使用灌根法在播種當(dāng)天及播種后第3天進(jìn)行接菌處理。30 d 后，開(kāi)始對(duì)每株材料根部發(fā)病程度進(jìn)行分級(jí)調(diào)查記錄發(fā)病情況，并利用、、、、、等6 個(gè)抗根腫病位點(diǎn)標(biāo)記進(jìn)行基因型鑒定。

1.3 根腫病抗病性鑒定及病情分級(jí)

試驗(yàn)材料接菌處理30 d 后調(diào)查發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)，評(píng)價(jià)品種的抗性。大白菜根腫病的鑒定標(biāo)準(zhǔn)如下（表2）。

表2 大白菜根腫病發(fā)病級(jí)別鑒定標(biāo)準(zhǔn)

病情指數(shù)（DI）和病株率的計(jì)算公式如下：

病情指數(shù)=［Σ（各級(jí)病株數(shù)×相應(yīng)級(jí)別）/（調(diào)查總株數(shù)×發(fā)病最高級(jí)別代表值）］×100。

病株率=（病株數(shù)/調(diào)查株數(shù)）×100%。

病情指數(shù)的劃分標(biāo)準(zhǔn)為：高抗≤30.0；30.0＜抗病≤40.0；40.0＜低抗/低感≤50.0；50.0＜感病≤80.0；高感＞80.0。

1.4 根腫病抗病基因檢測(cè)

使用改良后的CTAB 法提取大白菜基因組DNA，PCR 反應(yīng)總體積為20 μL，根腫病抗病位點(diǎn)、、、、、引物、PCR 體系及反應(yīng)條件見(jiàn)表3。

表3 各個(gè)引物PCR 反應(yīng)程序要求

2 結(jié)果與分析

2.1 大白菜品種抗病性鑒定

根據(jù)苗期接菌發(fā)病情況，將96 份大白菜劃分為3 種不同的抗性類型：抗新野老菌和新野新菌類型，抗新野老菌不抗新野新菌類型，不抗新野老菌和新野新菌類型。其中抗新野老菌不抗新菌品種的比例高達(dá)61.46%，分別為秋利皇、金錦、CR-啟航等59 個(gè)品種；抗新野老菌和新野新菌品種比例為33.33%，分別為山地王2 號(hào)、燦光CR-65、冬福春寶等32 個(gè)品種；不抗新野老菌和新野新菌品種比例為5.21%，分別為吉紅娃娃、德高榮耀、玲瓏二號(hào)等5 個(gè)品種（表4）。

2.2 大白菜品種抗病基因型鑒定

利用、、、、、等6 個(gè)根腫病抗病位點(diǎn)分子標(biāo)記對(duì)96 個(gè)大白菜品種進(jìn)行抗病基因型鑒定，瓊脂糖凝膠檢測(cè)結(jié)果如下（表4）：：57 個(gè)品種檢測(cè)到抗性位點(diǎn)，占全部材料的59.38%；：60 個(gè)品種檢測(cè)到抗性位點(diǎn)，占全部材料的62.50%；：20 個(gè)品種檢測(cè)到抗性位點(diǎn)，占全部材料的20.83%；：14 個(gè)品種檢測(cè)到抗性位點(diǎn)，占全部材料的14.58%；：50 個(gè)品種檢測(cè)到抗性位點(diǎn)，占全部材料的52.08%；：4 個(gè)品種檢測(cè)到抗性位點(diǎn)，占全部材料的4.17%。部分瓊脂糖電泳結(jié)果見(jiàn)圖1 所示。

圖1 24 個(gè)大白菜品種基因位點(diǎn)的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

不同大白菜品種的抗病位點(diǎn)存在較大差異，供試的96 個(gè)品種中CR 相春、春美二號(hào)、天香65 未檢測(cè)到抗病位點(diǎn)；Chiifu、寶根王（北京）、勝根CR1、根白金、西由鐵根605 檢測(cè)到抗病位點(diǎn)；CR 根寶、天籟、文鼎春寶、膠研CR65 檢測(cè)到抗病位點(diǎn)；春美一號(hào)、金童四季、寶根王（韓國(guó)）、申榮八號(hào)、CR-578、韓峰、春錦檢測(cè)到抗病位點(diǎn)；山地王2號(hào)B 型，CR 冬圣檢測(cè)到抗病位點(diǎn)，這類只檢測(cè)到單一抗病位點(diǎn)或者未檢測(cè)到抗病位點(diǎn)的材料約占全部材料的21.88%。AKIMEKI、CR 白菜12-101、CR-元春等57 個(gè)品種同時(shí)含有，抗病位點(diǎn)，約占全部材料的59.38%。同時(shí)這57 個(gè)品種的一部分又檢測(cè)到抗病位點(diǎn)（如希望白菜F），抗病位點(diǎn)（如農(nóng)科一號(hào)），抗病位點(diǎn)（如金錦）；另有18.74%的品種同時(shí)包含、抗病位點(diǎn)（如西由鐵根CR108）或者、抗病位點(diǎn)（如西由鐵根705）。96 個(gè)大白菜品種大多能檢測(cè)到2 至4 個(gè)抗病位點(diǎn)，其中CR 春福含有的抗病位點(diǎn)最多，包含5 個(gè)，分別是、、、、（表4）。筆者推測(cè)含有較多抗病位點(diǎn)的品種在理論上會(huì)對(duì)多個(gè)根腫病生理小種表現(xiàn)抗性，對(duì)單一生理小種的抗性也會(huì)更強(qiáng)。

表4 96 個(gè)大白菜品種分子標(biāo)記鑒定及病情指數(shù)分析

續(xù)表4

3 討論與結(jié)論

大白菜抗病與感病性狀與所含抗病基因具有一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系，目前，在大白菜和歐洲蕪菁上已定位32 個(gè)抗根腫病位點(diǎn)：、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、Rcr9、、、、、、、、、、、CRb。雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾十個(gè)抗病位點(diǎn)，但是目前研究較深入的就只有、、、、和這6 個(gè)抗病位點(diǎn)。其中，、、、這4 個(gè)抗性位點(diǎn)對(duì)4 號(hào)生理小種具有抗性。

本次試驗(yàn)中農(nóng)科一號(hào)、山地王1 號(hào)、春美一號(hào)、春美二號(hào)、山地王2 號(hào)、山地王2 號(hào)B 型、燦光CR-65（原名星光白菜）、寶根王、BDA202、余慶、春盛CRR、冬福春寶、金童四季、改良金童春秋、BCC-515、寒玉90、申榮8 號(hào)、CR 春泰、CR 春福、勝根CR1、根白金、CR 皇春3 號(hào)、早春の大將、屠龍CR、CR 春美609、韓峰、懷春、天籟、春錦、奇山抗根56、小黃龍等31 個(gè)品種對(duì)新野老菌和新菌均表現(xiàn)出抗性，這些材料大多含有和抗病位點(diǎn)，個(gè)別品種含有、、或抗病位點(diǎn)。可以看出和基因?qū)τ谄贩N抵抗新野老菌和新菌很重要。而含有抗病位點(diǎn)的大白菜品種如Chiifu、德高榮耀、吉紅娃娃、玲瓏二號(hào)對(duì)新野老菌和新菌卻表現(xiàn)出感病癥狀，筆者推測(cè)基因可能不是主要的抗病基因。前人研究發(fā)現(xiàn)，由于田間存在多致病型生理小種，且隨著生理小種菌源的變異，很多具有抗性位點(diǎn)的抗病大白菜品種的抗性也在迅速丟失。在本次試驗(yàn)中秋利皇、金錦、CR-啟航等59 個(gè)品種只抗新野老菌而不抗新菌，發(fā)生抗性丟失的現(xiàn)象，且所占比例高達(dá)61.46%。對(duì)品種進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)只含有位點(diǎn)的山地王2 號(hào)B 型卻對(duì)新野老菌和新菌都表現(xiàn)出抗性，說(shuō)明在該材料中可能含有新的抗病基因。

分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果可以從理論上揭示品種抗病的原因。筆者通過(guò)對(duì)96 個(gè)大白菜品種進(jìn)行苗期抗性鑒定和抗性位點(diǎn)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)大白菜品種中含有較多抗性位點(diǎn)的品種，如AKIMEKI、冬福春寶、改良金童春秋等對(duì)新野老菌和新菌都表現(xiàn)出抗病，筆者推測(cè)含有較多抗病位點(diǎn)的品種在理論上會(huì)對(duì)多個(gè)根腫病生理小種表現(xiàn)抗性，對(duì)單一生理小種的抗性也會(huì)更強(qiáng)。下一步，筆者將進(jìn)一步利用已報(bào)道的根腫病抗病位點(diǎn)，依據(jù)現(xiàn)有的種質(zhì)資源，進(jìn)一步鑒定出具有多根腫病抗性位點(diǎn)的品種，篩選出具有高抗病性，對(duì)生理小種抗性持久的育種材料。

筆者通過(guò)對(duì)96 個(gè)大白菜品種進(jìn)行根腫病抗性鑒定和抗根腫病位點(diǎn)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)含有，和抗病位點(diǎn)的材料對(duì)新野老菌和新菌均表現(xiàn)出抗性，但只含有和抗病位點(diǎn)的大白菜品種對(duì)新野老菌或新菌卻表現(xiàn)出感病癥狀，筆者推測(cè)和或許不是主要的抗病位點(diǎn)。另外筆者發(fā)現(xiàn)只含有位點(diǎn)的山地王2 號(hào)B 型卻對(duì)新野老菌和新菌表現(xiàn)出抗性，說(shuō)明其可能含有新的抗病基因。研究結(jié)果為大白菜抗根腫病種質(zhì)資源鑒定以及大白菜抗根腫病育種奠定了材料基礎(chǔ)。