基于可視化環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測中藥材蜈蚣真?zhèn)危?/h1>

2022-08-26 08:57:04胡超逸張景景范蔭蔭劉義飛胡志剛

世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化訂閱 2022年4期 收藏

關(guān)鍵詞：偽品蜈蚣條形碼

胡超逸，鄧 犇，張景景，范蔭蔭，管 瑤，張 凱，劉義飛，胡志剛 ＊＊，森 林＊＊

（1. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 武漢 430065；2. 湖北金貴中藥飲片有限公司 武漢 430065）

動(dòng)物藥是中醫(yī)藥體系的重要組成部分，蜈蚣作為一味藥用動(dòng)物，其干燥全體是臨床常用的傳統(tǒng)動(dòng)物藥材之一；特別是近些年，大量研究顯示蜈蚣和其毒液在抑制腫瘤、治療銀屑病等方面展示的巨大潛力[1-3]，使得藥用蜈蚣的使用數(shù)量逐漸增加。唇足綱在全球共有3000多種蜈蚣，在我國蜈蚣屬亦有十余種蜈蚣分布[4]，但少棘巨蜈蚣（Scolopendra subspinipes mutilansL.Koch）是《中國藥典》1963 至2020 版所收錄蜈蚣藥材（scolopendra）的唯一基源[5-6]。少棘巨蜈蚣作為一種唇足綱的藥用動(dòng)物資源，特殊的生活習(xí)性和對(duì)環(huán)境的嚴(yán)苛要求，使得在土地利用情況發(fā)生變化的環(huán)境下，野生資源逐漸減少。同時(shí)人工養(yǎng)殖難度較大，這些因素使得蜈蚣資源逐漸衰竭，蜈蚣藥材價(jià)格逐年增高。作者在亳州、安國、荷花池、玉林等國內(nèi)多家主要藥材市場發(fā)現(xiàn)[7]：為牟取蜈蚣藥材價(jià)格上漲所帶來的利益，多家商鋪銷售有與少棘巨蜈蚣的外觀性狀相似，但體型相對(duì)較長的偽品，該類偽品較長的體型恰好符合“長條蜈蚣價(jià)格較高”的市場規(guī)律和采購者的偏好，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該偽品為同屬物種多棘巨蜈蚣（S.subspinipes multidensNewport）。同時(shí)在湖北宜昌、襄陽以及浙江舟山等主要產(chǎn)地發(fā)現(xiàn)，多年來一直存在著部分養(yǎng)殖戶堅(jiān)持人工馴化養(yǎng)殖的嘗試，其中所面臨一個(gè)重要問題是農(nóng)民在選擇種苗時(shí)常誤選多棘巨蜈蚣進(jìn)行飼養(yǎng)。雖然多棘巨蜈蚣與少棘巨蜈蚣藥材外觀性狀較為相似（圖1a，圖1b），但少棘巨蜈蚣是《中國藥典》2020 版收載的唯一基原，且沒有關(guān)于兩者在臨床上可以代替使用的報(bào)道，因此若能夠有效的對(duì)蜈蚣進(jìn)行快速鑒別，必定能夠從源頭推動(dòng)其資源的可持續(xù)利用和更多臨床價(jià)值的挖掘。

蜈蚣作為傳統(tǒng)動(dòng)物藥材，與植物藥的有效成分研究相對(duì)成熟的現(xiàn)狀相比，其有效成分多為大分子，給采用化學(xué)手段鑒定帶來了一定困難。而傳統(tǒng)的性狀和顯微鑒定需要多年經(jīng)驗(yàn)積累且主觀性較強(qiáng)[8-10]，另外因蜈蚣藥材養(yǎng)殖年限的不同給傳統(tǒng)鑒定方式再次增加了困難[11]。分子鑒定的出現(xiàn)有力的解決了動(dòng)物樣品因成分、性狀等問題造成的干擾，尤其是陳士林等人提出的中藥材DNA 條形碼技術(shù)是一種通用易推廣的中藥材鑒定新技術(shù)[12-13]，該技術(shù)不受藥用動(dòng)植物的生長因素、不同的發(fā)育階段或樣品器官組織差異的影響[14]，其中所推薦采用的動(dòng)物COI 條形碼序列對(duì)動(dòng)物藥材的真?zhèn)物@示出了非常高的鑒定效率，可以有效區(qū)分少棘與多棘巨蜈蚣（圖1c，圖1d 分別為少棘和多棘巨蜈蚣COI序列條形碼），是目前鑒別蜈蚣藥材真?zhèn)蔚闹匾椒?。但為了能夠更加快速地指?dǎo)市場流通和產(chǎn)地種源鑒定，有必要開發(fā)出一套更為快速簡便的鑒定方式，能夠直接應(yīng)用于蜈蚣藥材的現(xiàn)場鑒定。環(huán)介導(dǎo) 等 溫 擴(kuò) 增 技 術(shù) （loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種能夠在恒溫條件下進(jìn)行反應(yīng)的核酸擴(kuò)增技術(shù)[15]，與常規(guī)PCR 擴(kuò)增反應(yīng)相比，LAMP 擴(kuò)增有其難以替代的優(yōu)勢(shì)，如：反應(yīng)不需要PCR儀等儀器設(shè)備，只需一臺(tái)能夠提供恒溫環(huán)境的水浴鍋等常見加熱裝置；反應(yīng)時(shí)間較快，通常只需幾十分鐘就能夠完成整個(gè)反應(yīng)[16-17]。利用這一優(yōu)勢(shì)，在反應(yīng)體系中加入羥基萘酚藍(lán)（hydroxynaphthol blue, HNB）等指示染料，利用該染料能夠與反應(yīng)副產(chǎn)物結(jié)合變色的特點(diǎn)，在反應(yīng)過程中和反應(yīng)結(jié)束后，直接通過肉眼判斷反應(yīng)是否發(fā)生[18]。憑借這些優(yōu)勢(shì)LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)技術(shù)已被廣泛引入動(dòng)、植物、病毒等輕工和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的快速鑒別[19-22]。

本研究借鑒DNA 條形碼對(duì)蜈蚣藥材的鑒別結(jié)果和LAMP 擴(kuò)增技術(shù)對(duì)其他動(dòng)物藥材成功鑒別經(jīng)驗(yàn)，針對(duì)少棘巨蜈蚣的COI序列，設(shè)計(jì)了其專屬特異性引物，進(jìn)一步構(gòu)建其LAMP檢測體系。利用該鑒定體系對(duì)其反應(yīng)時(shí)長、最低能夠檢測到的DNA 濃度進(jìn)行了判斷，同時(shí)對(duì)混偽品進(jìn)行檢測，驗(yàn)證該體系的特異性，并在此基礎(chǔ)上對(duì)該方法日后用于現(xiàn)場檢測的可行性和可能存在的問題進(jìn)行了探討。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

在對(duì)各主流藥材市場調(diào)研過程中，搜集到大量蜈蚣藥材樣本，從中抽取3 批少棘巨蜈蚣（Scolopendra subspinipes mutilansL. Koch）和 3 批 多 棘 巨 蜈 蚣（Scolopendra subspinipes multidensNewport）干燥體，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)胡志剛教授鑒定，憑證樣品存于湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院。并使用DNA 條形碼技術(shù)對(duì)樣品基原再次驗(yàn)證（圖1c，圖1d 分別為少棘和多棘巨蜈蚣COI 條形碼），按照中藥材DNA 條形碼標(biāo)準(zhǔn)操作指導(dǎo)原則[23]所推薦的COI 序列對(duì)6 份蜈蚣干燥樣品進(jìn)行檢測，將所獲得的6 條樣品序列在全球藥典基因組數(shù)據(jù)庫[24]（www.gpgenome.com）中進(jìn)行比對(duì)，樣品信息和DNA條形碼比對(duì)結(jié)果如表1所示。

表1 蜈蚣藥材樣品信息表及COI序列比對(duì)結(jié)果

圖1 少棘巨蜈蚣S.subspinipes mutilans及其混偽品多棘巨蜈蚣S.subspinipes multidens性狀圖與COI條形碼

1.2 試劑和儀器

動(dòng)物組織DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司，中國北京）；BstDNA 聚合酶、MgCl2、dNTPs、羥基萘酚藍(lán)（HNB）指示劑均購自哈爾濱新海基因生物科技有限公司；DNA Marker DL2000（北京擎科生物公司）；引物由上海生工生物有限公司合成。

電熱恒溫水槽（上海一恒科技有限公司），瓊脂糖凝膠電泳儀（北京市六一儀器），聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀（基因有限公司），凝膠成像儀（JS-680B，Peiqing Science & technology） ，NanoDrop 2000（Thermo Scientific Co.,美國）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 DNA提取和稀釋定量

取表1中蜈蚣藥材和混偽品的足部等干燥體組織各約30 mg，使用天根動(dòng)物DNA提取試劑盒，按說明書要求提取樣品DNA，經(jīng)NanoDrop 檢測DNA 濃度，作模板DNA儲(chǔ)存使用；利用無菌水對(duì)少棘巨蜈蚣模板DNA以10倍梯度進(jìn)行稀釋定量，冷藏于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 引物設(shè)計(jì)

得到少棘巨蜈蚣總DNA 后，使用通用引物對(duì)兩種蜈蚣COI系列進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)測序、生物信息學(xué)分析比較其差異信息，通過LAMP Designer V1.15軟件設(shè)計(jì)并篩選了一套特異性檢測引物組，引物序列特征見表2。

表2 少棘巨蜈蚣COI基因的LAMP引物

2.3 LAMP反應(yīng)體系

LAMP 反應(yīng)體系25 μL：包括DNA 模板1.5 μL，Bst DNA 聚合酶10 U、上游內(nèi)引物FIP 1.6 μM、下游內(nèi)引物BIP 1.6 μM、上游外引物F3 0.2 μM、下游外引物B3 0.2 μM、環(huán)引物L(fēng)oopF 0.4 μM、環(huán)引物L(fēng)oopB 0.4 μM、100 mM MgCl21.5 μL、10 mM dNTPs 3.5 μL 和羥基萘酚藍(lán)指示劑0.15 mM，余量為dd H2O。

2.4 少棘巨蜈蚣藥材特異性檢測

為了檢測LAMP 引物對(duì)蜈蚣藥材鑒定的特異性，分別在最佳反應(yīng)條件下對(duì)6 份樣品構(gòu)建LAMP 反應(yīng)體系，若反應(yīng)結(jié)果為陽性，反應(yīng)體系將由紫羅蘭色變?yōu)樘焖{(lán)色。同時(shí)采用電泳方式對(duì)反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，陽性反應(yīng)體系的電泳結(jié)果呈現(xiàn)典型的梯子形條帶，以此可直接觀察擴(kuò)增是否發(fā)生完成。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 LAMP反應(yīng)條件

按照2.3 要求，平行制備多個(gè)含有少棘巨蜈蚣模板DNA 的反應(yīng)體系，在65℃恒溫水浴鍋中加熱，依次間隔15 min 觀察其顏色變化。如圖2 所示，與起始顏色相比，反應(yīng)發(fā)生15 min 后，含有少棘巨蜈蚣DNA 模板的反應(yīng)體系由0 min 的紫羅蘭色發(fā)生了非常微弱的顏色變化，電泳檢測結(jié)果顯示了微弱的梯子形條帶，但尚不能較好的判斷反應(yīng)結(jié)果；繼續(xù)加熱15 min 后，可見反應(yīng)體系已由紫羅蘭色變?yōu)樘焖{(lán)色，電泳結(jié)果顯示條帶清晰呈梯子形。繼續(xù)加熱，至45 和60 min 時(shí)，體系顏色仍為天藍(lán)色，電泳條帶清晰，說明30 min 的反應(yīng)時(shí)長，足以產(chǎn)生穩(wěn)定的結(jié)果用于判斷反應(yīng)是否發(fā)生。

圖2 60℃恒溫條件下LAMP反應(yīng)結(jié)果

3.2 反應(yīng)靈敏度

圖3 少棘巨蜈蚣DNA模板依次稀釋后反應(yīng)結(jié)果。

將少棘巨蜈蚣 DNA 模板按照 1、10-1、10-2、10-3、10-4倍數(shù)依次進(jìn)行梯度稀釋，經(jīng)NanoDrop 測得起始DNA 模板濃度為59.84 ng·μL-1，觀察不同濃度 DNA 在相同反應(yīng)體系下的差異。30 min后，稀釋至10-3或10-4倍的反應(yīng)體系顏色仍存在一定變化，電泳結(jié)果可以看到較為微弱的條帶，此時(shí)DNA 模板濃度為5.984 pg·μL-1，說明在保證30 min的快速反應(yīng)條件下，仍可確保該方法對(duì)低濃度少棘巨蜈蚣DNA的檢測。

3.3 蜈蚣藥材及其混偽品的檢測

分別對(duì)1.1 中篩選的6 個(gè)批次的蜈蚣DNA 進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，以dd H2O為陰性對(duì)照，在60℃恒溫水域條件下使其反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后，如圖4 中顯示，含有少棘巨蜈蚣DNA 的三個(gè)反應(yīng)體系（SJ-1，SJ-2，SJ-3）變?yōu)樗{(lán)色，而含有多棘巨蜈蚣DNA 的體系（DJ-1，DJ-2，DJ-3）與陰性對(duì)照一致，保持紫色不變；電泳結(jié)果顯示少棘巨蜈蚣的擴(kuò)增體系存在梯子形條帶，而多棘巨蜈蚣無明顯變化。顯示了該引物對(duì)少棘巨蜈蚣具有較強(qiáng)的特異性，能夠快速將少棘巨蜈蚣藥材所含DNA與其偽品多棘巨蜈蚣進(jìn)行區(qū)分。

圖4 少棘巨蜈蚣及其混偽品LAMP反應(yīng)結(jié)果

4 討論

前期市場和產(chǎn)地調(diào)研發(fā)現(xiàn)，多地存在將多棘巨蜈蚣混作少棘巨蜈蚣高價(jià)出售的情況，出現(xiàn)這一現(xiàn)象的主要原因在于少棘巨蜈蚣資源縮減、多棘巨蜈蚣與其外觀相似、且蜈蚣藥材價(jià)格與體長相關(guān)。因此在推進(jìn)蜈蚣資源可持續(xù)利用的過程中，一種快速有效的鑒別方式，是保證人工養(yǎng)殖正確引種和市場健康流通的基礎(chǔ)。在DNA 條形碼等分子鑒定手段應(yīng)用于蜈蚣藥材檢測之前，主要鑒別方式依賴于性狀鑒別，少棘與多棘巨蜈蚣的性狀差異主要體現(xiàn)在[25]：前者體長多在150 mm 以內(nèi)，頭板和第一背板為桔紅色，其余背板為墨綠色；而后者體長可達(dá)200 mm，頭板和第一背板為紅褐色，其余背板為棕褐色（圖1a、圖1b）。但人工養(yǎng)殖條件下食物充足等因素使部分3齡以上少棘巨蜈蚣體長達(dá)到150 mm 以上，且顏色判斷主觀性較強(qiáng)，給蜈蚣的性狀鑒別增加了一定難度[26]。同時(shí)蜈蚣作為動(dòng)物藥材，在干燥、保存過程中，其蛋白成分存在不同程度的酶解情況，給SDS-PAGE 等蛋白鑒定方式也造成了一定的干擾[6]。分子鑒定無疑在蜈蚣等動(dòng)物藥材鑒定過程中體現(xiàn)了巨大優(yōu)勢(shì)，除DNA條形碼通用鑒別方式以外[27]，先后有多項(xiàng)關(guān)于蜈蚣基源鑒別的特異性PCR研究[28-30]，雖特異性引物存在差異，但所用目的片段多為線粒體DNA 上的COI 序列，體現(xiàn)了COI 序列在蜈蚣分子鑒定上的高效性。在此基礎(chǔ)上，本研究設(shè)計(jì)了一套用于檢測少棘巨蜈蚣的LAMP 引物，與普通PCR 一對(duì)引物相比，LAMP 引物包含了一對(duì)外引物（F3、B3）,一對(duì)內(nèi)引物（FIP，BIP）和一對(duì)環(huán)引物（LoopF、LoopB），在以往大量研究中[31-33]證實(shí)了LAMP 引物更高的特異性和擴(kuò)增效率。參照其他物種LAMP 反應(yīng)體系設(shè)計(jì)[34-35]和蜈蚣藥材自身特點(diǎn)，本研究進(jìn)一步設(shè)計(jì)了一套包含模板 DNA、引物組、HNB 顯色劑、BstDNA 聚合酶以及反應(yīng)所需的堿基、緩沖液等少棘巨蜈蚣LAMP檢測體系，并證實(shí)了該體系能夠在30 min、65℃恒溫條件下對(duì)低至皮克級(jí)別的少棘巨蜈蚣DNA 模板進(jìn)行檢測的能力。同時(shí)與DNA 條形碼標(biāo)準(zhǔn)操作和其他特異性PCR 相比，該反應(yīng)體系省去了測序、數(shù)據(jù)分析過程，因?yàn)榧尤肓肆u基萘酚藍(lán)（HNB）顯色劑，該顯色劑可直接與擴(kuò)增反應(yīng)的副產(chǎn)物焦磷酸根離子結(jié)合產(chǎn)生顏色變化[36]，因此可通過肉眼觀察結(jié)果直接判斷藥材真?zhèn)?，且反?yīng)時(shí)間較短，無需PCR 儀等儀器設(shè)備，能夠更加快速的指導(dǎo)現(xiàn)場檢測。

隨著LAMP反應(yīng)的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)，多年來，已有多種藥用動(dòng)植物L(fēng)AMP 鑒別研究案例，如Qing Huang[37]等將LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)用于藥用動(dòng)物廣地龍的鑒別，Meng Shiou Lee[38]等將LAMP 技術(shù)應(yīng)用于燕窩及其制品的檢測，Ming Li[39]等開發(fā)的針對(duì)藥用植物的白花蛇舌草的LAMP 鑒別方法。都體現(xiàn)了LAMP 檢測方法在藥用動(dòng)植物快速鑒別的優(yōu)勢(shì)和可行性，該研究對(duì)于少棘巨蜈蚣的快速檢測同樣對(duì)于今后其他藥用動(dòng)植物的快速檢測具有參考意義。而在中藥材LAMP檢測體系構(gòu)建過程中，關(guān)鍵之處在于目標(biāo)片段的篩選和特異性引物設(shè)計(jì)，本研究所采用的COI 序列在少棘巨蜈蚣種間保守性較好，在前期的蜈蚣DNA 條形碼研究一文中顯示，多批次少棘巨蜈蚣樣本的COI 序列之間不存在種內(nèi)變異位點(diǎn)[27]；而與同屬多棘蜈蚣之間存在大量變異區(qū)域（圖1c、圖1d），符合LAMP 引物設(shè)計(jì)要求。結(jié)果顯示了該引物組對(duì)少棘巨蜈蚣的高特異性，能夠成功的將現(xiàn)今市場上存在的偽品多棘巨蜈蚣進(jìn)行區(qū)分。以往研究顯示，LAMP 技術(shù)因反應(yīng)靈敏度高，容易形成氣溶膠污染，因此可能會(huì)出現(xiàn)假陽性的情況[40]。同時(shí)，本研究在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，蜈蚣作為肉食性動(dòng)物，為避免腹中食物造成干擾，在取樣時(shí)，盡量選擇頭部、足部等部位，同時(shí)盡量將DNA 提取和試劑配制分開操作。較高的靈敏度對(duì)于今后在藥材市場現(xiàn)場推廣蜈蚣藥材的LAMP檢測造成了一定的干擾。為克服這些問題，可在反應(yīng)管中加入低熔點(diǎn)的固體石蠟來阻止污染[41]。同時(shí)，在DNA 條形碼等常規(guī)PCR 實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，蜈蚣藥材具有較厚的保護(hù)組織，給DNA 提取增加了一定難度，在提取過程中往往需要延長水浴時(shí)間以確保足夠的DNA 能夠釋放。但在LAMP 反應(yīng)過程中，可以檢測到低濃度的少棘巨蜈蚣DNA，在減少測序、數(shù)據(jù)處理所耗時(shí)間的同時(shí)，也能夠縮短DNA提取過程中所需要的時(shí)間。

該研究基于多地調(diào)研現(xiàn)狀，為解決多棘巨蜈蚣混入少棘巨蜈蚣并以較高價(jià)格銷售的現(xiàn)狀，將LAMP 檢測技術(shù)引入少棘巨蜈蚣真?zhèn)舞b定，結(jié)合下一步的試劑盒開發(fā)和轉(zhuǎn)化應(yīng)用，期望能夠?qū)崿F(xiàn)在得到樣品DNA后，能在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)樣品的準(zhǔn)確鑒別，將對(duì)于當(dāng)下蜈蚣藥材的引種養(yǎng)殖和市場流通所出現(xiàn)的偽品流通情況進(jìn)行有力監(jiān)測。另外多年來，墨江蜈蚣、黑頭蜈蚣等其他蜈蚣屬物種的活體和藥材流通區(qū)域都極其有限，其資源相對(duì)縮減，未曾在各主流藥材市場發(fā)現(xiàn)其藥材商品，但近年存在有進(jìn)口蜈蚣流入藥材市場報(bào)道[42]，今后將基于本研究所設(shè)計(jì)的檢測體系，進(jìn)一步搜集進(jìn)口蜈蚣樣品，擴(kuò)大完善該檢測體系的適用性。

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