霍山石斛類黃酮-3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶（DhUF3GT）基因克隆與原核表達(dá)分析＊

瞿彩麗，劉雨馨，李永華，汪文杰，余 坤，龔 玲

（湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 武漢 430065）

霍山石斛（Dendrobium huoshanenseC. Z. Tang et S.J.Cheng）被贊譽(yù)為“九大仙草”之首，是藥用石斛中的珍品，具有滋補(bǔ)肝腎、補(bǔ)氣養(yǎng)陰、益津明目等功效[1]。由于霍山石斛對生長環(huán)境嚴(yán)苛，加之掠奪性采挖，野生資源幾乎難覓蹤跡[2]。自上個世紀(jì)六七十年代，地處于大別山腹地中心的湖北省英山縣就已經(jīng)開展了霍山石斛的仿野生人工培育，優(yōu)良種質(zhì)選育及人工種植技術(shù)相對成熟[3]，在一定程度上緩解了霍山石斛資源匱乏等問題。然而，目前霍山石斛人工栽培的產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法滿足日益擴(kuò)大的市場需求。這嚴(yán)重制約了霍山石斛深度的開發(fā)利用及產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。因此，在加大霍山石斛人工種植技術(shù)研究的同時，有必要加快對霍山石斛關(guān)鍵活性成分的生物合成機(jī)制研究。

霍山石斛作為藥用石斛中的珍品，富含新西蘭牡荊苷、夏佛塔苷、槲皮素、柚皮素、芹菜素等類黃酮物質(zhì)[4-5]，除能清除體內(nèi)的氧自由基外，還有較強(qiáng)的抗氧化、降血糖、抗腫瘤、抗炎等藥理活性[6-7]?，F(xiàn)代藥理研究已證明，植物中大多數(shù)類黃酮化合物主要以類黃酮-O-糖苷或C-糖苷形式發(fā)揮廣泛的藥理作用[8-9]。如芹菜素7-O-葡萄糖苷能抗痙攣、抗炎[10]；矢車菊素-3-O-葡萄糖苷能增強(qiáng)人肝癌HepG2 細(xì)胞的抗腫瘤活性[11]；山奈酚3-O-葡萄糖苷對HIV-1表現(xiàn)出強(qiáng)抑制性[12]；柚皮素7-O-葡萄糖苷具有抗癌、抗糖尿病等藥理作用[13]。

類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶(Flavonoid glycosyltransferase，UFGT)是類黃酮化合物生物合成下游途徑中的最后一個合成酶，主要負(fù)責(zé)類黃酮糖基化修飾過程，能將具有活性的糖供體轉(zhuǎn)移到黃酮醇、花色素、黃酮、異黃酮和黃烷醇等苷元上，形成種類多樣的類黃酮糖苷類物質(zhì)[14]（圖1）。因此，它被認(rèn)為是類黃酮生物合成途徑中的關(guān)鍵酶。近年來，研究者們從許多色澤鮮艷的植物葉片、莖、花朵中提取到豐富的花青苷及其合成酶UFGT[15-16]，也認(rèn)識到通過挖掘高效、專一的類黃酮UFGT 合成高質(zhì)優(yōu)產(chǎn)的類黃酮糖苷是類黃酮糖苷藥源的重要途徑。研究者通過隨機(jī)突變?nèi)藚⒃碥誖h2 生物合成的關(guān)鍵酶編碼基因UGTPg 45，獲得了催化活性最高的糖基轉(zhuǎn)移酶UGTPg 45-HV突變蛋白，使人參皂苷Rh2 的產(chǎn)量有效提高10 倍以上[17]。Wang 等發(fā)現(xiàn)野黃芩中的類黃酮3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶Sb3GT1 能催化17種黃酮醇轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的3-O-糖苷，轉(zhuǎn)化率高達(dá)到98%以上[18]。這為黃芩活性成分的體外生物合成提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。盡管，研究者們前期做了大量關(guān)于霍山石斛多糖生物合成機(jī)制調(diào)控研究[19]，但有關(guān)霍山石斛類黃酮糖基化反應(yīng)的關(guān)鍵——類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶UFGT 的研究卻鮮少報(bào)道。

因此，本研究根據(jù)課題組前期霍山石斛轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，篩選了霍山石斛類黃酮-3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶（DhUF3GT）基因，采用RT-PCR 技術(shù)克隆其基因序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析及其原核蛋白表達(dá)研究，以期為霍山石斛類黃酮-3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶的功能以及類黃酮化合物生物合成途徑的闡明奠定基礎(chǔ)。這也為將來利用生物工程等手段培育高含量黃酮成分的霍山石斛品種和促進(jìn)霍山石斛產(chǎn)業(yè)可持續(xù)開發(fā)提供重要的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料為課題組前期組織培養(yǎng)的霍山石斛新鮮葉片，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院余坤教授鑒定，為蘭科石斛屬植物霍山石斛Dendrobium huoshanenseC.Z. Tang et S. J. Cheng。用無菌清水將葉片洗凈后消毒，濾紙吸干水分，作為提取霍山石斛RNA 的材料。

1.2 試劑

本實(shí)驗(yàn)所用試劑見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)試劑列表

2 方法

2.1 霍山石斛總RNA 的提取及cDNA 的合成

采用高多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒提取霍山石斛葉片總RNA，并在1%瓊脂糖凝膠電泳下檢測總 RNA 的完整性。ND2000（Denovix DS-11＋，S-03512）檢測霍山石斛總RNA 的質(zhì)量，選擇A260/A280為 1.8～2.0 的總 RNA 按照 PrimeScript TM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄體系進(jìn)行cDNA的合成。

2.2 霍山石斛DhUF3GT 基因序列的克隆

根據(jù)課題組前期霍山石斛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得的DhUF3GT基因序列，運(yùn)用在線軟件NCBI ORF Finder設(shè)計(jì)特異性引物：GT-Z:CGGACAGGCAGTGGTAGGAAGAG；GT-F: TAAGAGAGAGTTCAGAGGGGGCT。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增。cDNA 擴(kuò)增在TaKaRa PrimeSTAR?Max DNA polymerase 作用下進(jìn)行，反應(yīng)條件為 98℃、3 min；98℃、10 s；55℃、15 s；72℃，30 s。2～4 步反應(yīng) 30 個循環(huán)；72℃延伸 10 min；4℃永久。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切膠回收目的條帶，并與pTOPO-Blunt ⅡVector 載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，選擇單克隆菌落并進(jìn)行菌液PCR 驗(yàn)證，將陽性克隆菌液送至上海生工生物有限公司進(jìn)行測序。

2.3 霍山石斛DhUF3GT基因生物信息學(xué)分析

霍山石斛DhUF3GT基因序列采用NCBI在線軟件BLAST進(jìn)行相似性搜索；采用DANMAN軟件尋找開放閱讀框（ORF），并對其氨基酸序列進(jìn)行蛋白同源性分析；采用ExPASy、SOPMA 分析蛋白的理化性質(zhì)；采用SignalP 4.1 Server 預(yù)測信號肽；采用 STRING 軟件，以擬南芥蛋白數(shù)據(jù)庫作為參考分析DhUF3GT 蛋白與其他蛋白的互作關(guān)系；蛋白的磷酸化和糖基化位點(diǎn)采用NetPhos 3.1 Server和Net NGlyc 1.0 Server進(jìn)行預(yù)測；蛋白親/疏水性采用ExPasy-ProtScale 分析；采用PSORT、SOPMA 和Swiss-Mode Workspace 分別進(jìn)行蛋白的亞細(xì)胞定位和二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測；采用PyMOL 軟件對三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化處理；采用TMHMM Server v.2.0 進(jìn)行蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測；使用MEGA6.0 軟件，應(yīng)用Neighbor-joining（N-J）的方法建立NJ tree。

2.4 霍山石斛DhUF3GT基因的原核表達(dá)分析

根據(jù)測序后的結(jié)果設(shè)計(jì)特異性引物：正引物GAGCTCATGCCATCCACCGCCGCCTTCGCC；反 引 物GTCGACTCAAGTCTCCCCGGACTCGTTCAAC（下劃線分別為SacⅠ、SalⅠ酶切位點(diǎn)），進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物與pTOPO-Blunt ⅡVector 的載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒DhUF3GT-pTOPO，并提取陽性克隆重組質(zhì)粒DNA。

理論計(jì)算所用原料為貴州赫章鮞狀赤鐵礦，化學(xué)成分如表1所示：鮞狀赤鐵礦原礦中的鐵主要以赤鐵礦的形式存在，少部分以褐鐵礦形式存在，脈石成分主要為高嶺石。

采用SacⅠ、SalⅠ限制性內(nèi)切酶分別對DhUF3 GT-pTOPO 和表達(dá)載體pET28（a）進(jìn)行雙酶切，切膠回收目的基因片段與原核表達(dá)載體pET28（a），通過T4連接酶進(jìn)行連接，菌落PCR 驗(yàn)證。重組表達(dá)質(zhì)粒DhUF3GT-pET28（a）經(jīng)快速質(zhì)粒 DNA 提取試劑盒提取后，轉(zhuǎn)化至Rosetta 表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞中，IPTG 16℃誘導(dǎo)表達(dá)，通過12%SDS-PAGE電泳分析。

3 結(jié)果

3.1 霍山石斛總RNA提取結(jié)果

霍山石斛總RNA 提取后經(jīng)凝膠電泳分析，結(jié)果如圖 2，在約 1500 bp 和 1000 bp 處可見 28S 和 18S 兩條清晰條帶。總 RNA 的 A260/A280 為 1.986（1.8 至 2.0 之間），證明其質(zhì)量和完整性均較好，無DNA 污染，且濃度為58.012 mg·μL-1。

圖2 霍山石斛總RNA凝膠電泳圖

3.2 霍山石斛DhUF3GT基因序列的克隆

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選的DhUF3GT基因設(shè)計(jì)專一性引物，以霍山石斛葉片RNA 逆轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到了霍山石斛DhUF3GT基因的片段。如圖3顯示，該凝膠電泳結(jié)果在約1300 bp處有一明顯條帶。將該片段條帶切膠回收后進(jìn)行克隆測序，最終測序結(jié)果為1289 bp，與前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致，表明該擴(kuò)增片段是預(yù)期目的基因。

圖3 霍山石斛DhUF3GT基因的凝膠電泳圖

3.3 霍山石斛DhUF3GT基因生物信息學(xué)分析

3.3.1 序列分析

將DhUF3GT基因序列采用DNAMAN 在線軟件進(jìn)行ORF 框查詢，發(fā)現(xiàn)該序列的開放閱讀框?yàn)?239 bp，編碼了412 個氨基酸（圖4）。在NCBI 中注冊，GenBank 中的登錄號為OM460827。通過BLAST 搜索比對得到與該序列相似性最高的是同為蘭科草本植物的鐵皮石斛（Dendrobium catenatum）的糖基轉(zhuǎn)移酶基因。

圖4 霍山石斛DhUF3GT基因的cDNA序列

3.3.2 霍山石斛DhUF3GT基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析

利用在線軟件Protparam 對霍山石斛DhUF3GT基因編碼的氨基酸進(jìn)行序列分析，結(jié)果顯示DhUF3GT蛋白總平均疏水性為-0.001，具有親水性和不穩(wěn)定性，為親水性蛋白。理論相對分子質(zhì)量為45.668 kD；分子式為 C2060H3216N552O584S19；等電點(diǎn) PI 為 5.98；不穩(wěn)定指數(shù)為48.17；脂肪族指數(shù)為92.82。序列所包含的412個氨基酸中，丙氨酸Ala 和亮氨酸Leu 含量最高，分別占比9.7%，其次是谷氨酸Glu 和半胱氨酸Cys 分別占8.0%和1.0%，其中負(fù)極性殘基（Asp+Glu）45個，正極性殘基（Arg+Lys）37個。

使用NCBI Concserved Domain 在線軟件分析發(fā)現(xiàn)DhUF3GT基因編碼的蛋白有3 個活性位點(diǎn)（色氨酸Trp-22，天冬酰胺Asp-23，組氨酸His-44），為糖基轉(zhuǎn)移酶GTB 超家族成員（Glycosyltransferase_GTB-type super family）（圖5a）。

使用在線軟件，導(dǎo)入擬南芥蛋白數(shù)據(jù)庫分析DhUF3GT 蛋白與其他蛋白的互作關(guān)系，得出DhUF3GT 與AT5G64540互作性最高，得分為0.903，其次是與AT1G14710（屬富羥脯氨酸糖蛋白家族的氧化還原酶蛋白）和AT1G55270（屬半乳糖氧化還原酶家族的半乳糖氧化酶）互作性較高，另外還與AT1G6020 0、AT2G29210、TIL 有相互作用。綜上證明，DhUF3GT蛋白可能與其他氧化還原酶蛋白共同完成了類黃酮苷類物質(zhì)的合成（圖5b）。

圖5 霍山石斛DhUF3GT基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析

3.3.3 霍山石斛DhUF3GT 蛋白的磷酸化/糖基化位點(diǎn)、信號肽、親/疏水性、跨膜區(qū)預(yù)測

經(jīng) NetPhos 3.1 Server 和 Net NGlyc 1.0 Server 軟件分別預(yù)測，結(jié)果顯示DhUF3GT 蛋白有20 個Ser磷酸化位點(diǎn)、9 個 Thr 磷酸化位點(diǎn)及 2 個 Tyr 磷酸化位點(diǎn)（圖6a），以及兩個糖基化位點(diǎn)（96、407）（圖 6b）。經(jīng)SignalP 4.1 Server 分析，DhUF3GT 蛋白為胞內(nèi)蛋白（圖6c），無信號肽。利用ExPasy-ProtScale 分析該蛋白的親/疏水曲線，發(fā)現(xiàn)疏水性最強(qiáng)出現(xiàn)在第223 個氨基酸處，最高值為2.333；第147 個氨基酸的親水性最強(qiáng)，得分為-2.856（圖6d），且整個蛋白質(zhì)鏈的大部分估計(jì)值小于0，故可以得到霍山石斛DhUF3GT 蛋白為親水性蛋白。TMHMM Server v.2.0 軟件分析顯示，該蛋白沒有跨膜區(qū)。PSORT 的亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)DhUF3GT 蛋白在葉綠體基質(zhì)、類囊體膜和類囊體間隙，估值分別為0.938、0.775 和 0.750，因此推測 DhUF3GT 蛋白可能存在于葉綠體中。

圖6 霍山石斛DhUF3GT蛋白

3.3.4 霍山石斛DhUF3GT 蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

采用SOPMA 和Swiss-Mode Workspace 在線軟件估測DhUF3GT 蛋白的二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示該蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋結(jié)構(gòu)占41.99%，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)占5.83%，延伸鏈占14.81%，無規(guī)則卷曲占37.38%。研究可得出DhUF3GT 蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要屬于α-螺旋（圖7），三級結(jié)構(gòu)經(jīng)PyMOL 軟件可視化處理，結(jié)果如圖8。

圖7 霍山石斛DhUF3GT蛋白的二級結(jié)構(gòu)

圖8 霍山石斛DhUF3GT蛋白三級結(jié)構(gòu)及保守結(jié)構(gòu)域

3.3.5 霍山石斛DhUF3GT基因編碼氨基酸的同源性及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

DhUF3GT基因編碼氨基酸的多重比較發(fā)現(xiàn)（圖9），霍山石斛DhUF3GT基因編碼蛋白與鐵皮石斛（Dendrobium catenatum）、石斛蘭雜交種（Dendrobiumhybrid cultivar）、小蘭嶼蝴蝶蘭（Phalaenopsis equestris）、海棗（Phoenix dactylifera）、油棕（Elaeis guineensis）及小麥（Triticum aestivum）中的糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白共同指數(shù)分別為 98.79%、89.76%、79.23%、48.95%、47.32%、48.06%，且都在C 末端含有1個高度保守的PSPG 結(jié)構(gòu)域（圖9）。選取這6 個物種的糖基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列采用 MEGA6.0 構(gòu)建 NJ 樹，發(fā)現(xiàn)霍山石斛 DhUF3GT 蛋白與同科植物鐵皮石斛的親緣關(guān)系最高（圖10）。

圖9 霍山石斛DhUF3GT氨基酸序列與其他植物的多重比對

圖10 霍山石斛DhUF3GT氨基酸序列NJ樹

3.4 霍山石斛DhUF3GT基因原核表達(dá)

3.4.1 重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及驗(yàn)證

將構(gòu)建的DhUF3GT-pET28（a）重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，結(jié)果顯示（圖11）：雙酶切后在約5000 bp 和1300 bp 處有明顯條帶，且1300 bp 處條帶與霍山石斛DhUF3GT條帶位置一致，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖11 重組質(zhì)粒DhUF3GT-pET28aD及雙酶切驗(yàn)證

3.4.2 SDS-PAGE蛋白電泳檢測

蛋白誘導(dǎo)后經(jīng)電泳檢測結(jié)果顯示（圖12），與pET28（a）空載體表達(dá)總蛋白相比，誘導(dǎo)后的總蛋白、上清及沉淀都在45 KDa處有明顯條帶，證明該蛋白成功表達(dá)。且上清蛋白條帶較沉淀中蛋白深，說明原核表達(dá)蛋白主要存在于上清中。綜上證明，霍山石斛DhUF3GT蛋白在原核細(xì)胞中成功表達(dá)，且表達(dá)趨于折疊正確的活性蛋白形式。

圖12 蛋白SDS-PAGE凝膠電泳圖

4 討論

目前，整個霍山石斛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展呈“頭重腳輕”的趨勢，即藥材炮制技術(shù)（楓斗）工藝成熟、歷史悠久，但中成藥、新型飲片、保健食品等深加工產(chǎn)品數(shù)量稀少，技術(shù)創(chuàng)新非常薄弱[20-21]。與同屬的鐵皮石斛、紫皮石斛、金釵石斛相比，霍山石斛在本草考證、功能主治、化學(xué)成分和藥理研究等深入宣傳推廣上差異化不顯著，其獨(dú)特的文化內(nèi)涵也尚未充分挖掘[22]。歸根究底，霍山石斛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展受到上游基礎(chǔ)研究不充分的嚴(yán)重制約，如①藥效學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機(jī)制研究薄弱；②有別于其他品種的獨(dú)特化學(xué)成分和藥理活性未深入研究[23]，專一的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)缺乏?；羯绞慄S酮合成途徑和調(diào)控機(jī)制研究尚未充分解析，這嚴(yán)重影響了下游產(chǎn)業(yè)的深度研發(fā)與創(chuàng)新。

植物類黃酮的生物合成以丙二酰輔酶A 和香豆酰CoA 為底物，在一系列酶的作用下形成黃酮、黃酮烷、黃酮醇、花青素等苷元和黃酮苷（圖1）。隨著生物信息學(xué)的飛速發(fā)展，大量類黃酮-3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（3GT）基因在擬南芥、矮牽牛、金花茶、丹參等重要模式植物和園藝作物中被發(fā)現(xiàn)[24-27]。如在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中，山柰酚、槲皮素、異鼠李素等在UGT78D1 作用下，生成3-O-鼠李糖苷[24]；矮牽牛中的黃酮醇、花色素在PGT8 催化下能分別生成黃酮醇3-O-葡萄糖苷、花色素3-O-葡萄糖苷[28]。金花茶中CnUFGT14和CnUFGT15基因參與黃酮醇、花青素的修飾反應(yīng)[26]；丹參的SmUF3GT基因調(diào)控了花青素苷的合成[29]。由此可見，3GT基因?yàn)轭慄S酮糖苷修飾合成的關(guān)鍵基因。

本研究從霍山石斛中成功克隆出類黃酮-3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶(DhUF3GT)基因序列，經(jīng)在線生信工具分析發(fā)現(xiàn)該基因片段包含一個長度為1239 bp 的開放閱讀框，能編碼412 個氨基酸。DhUF3GT 蛋白屬于親水性

穩(wěn)定蛋白，理論相對分子質(zhì)量為45.668 KD，等電點(diǎn)（PI）為5.98。氨基酸同源性分析顯示，霍山石斛與其他植物糖基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列相似性較高，與同科植物鐵皮石斛相似性可達(dá)98.79%，且DhUF3GT 蛋白在C 端具有UGT 的特征保守結(jié)構(gòu)域“PSPG Box”。這證明了本次克隆得到的序列準(zhǔn)確，屬于糖基轉(zhuǎn)移酶UGT家族基因一員。

有研究表明，PSPG 序列中特定位點(diǎn)的氨基酸決定了該糖基轉(zhuǎn)移酶糖基供體的選擇。在霍山石斛DhUF3GT 蛋白的PSPG 保守序列中，第22 位為色氨酸、第23 位為天冬酰胺和第44 位為組氨酸，表明其可能利用葡萄糖和半乳糖來合成花青素苷等類黃酮物質(zhì)。由此推測，霍山石斛DhUF3GT與其他同家族的糖基轉(zhuǎn)移酶有著相似的葡萄糖基和半乳糖基的糖基化修飾活性[23]。

據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，植物的糖基轉(zhuǎn)移酶一般定位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)，主導(dǎo)了植物次生代謝產(chǎn)物的合成[25]?；羯绞鶧hUF3GT基因經(jīng)PSORT 的亞細(xì)胞定位分析，該基因主要分布在葉綠體中。由于類黃酮轉(zhuǎn)移酶選擇糖基供體或受體時具有特異性，導(dǎo)致亞細(xì)胞定位部位有所不同，該研究結(jié)果還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

霍山石斛與鐵皮石斛具有較高的親緣關(guān)系，兩者均含有豐富的類黃酮化合物[30]。近年來，隨著鐵皮石斛基因組圖譜的成功繪制，Ren 等[31]成功挖掘及鑒定出一個新穎的黃酮碳苷糖基轉(zhuǎn)移酶基因，能體外合成牡荊素、異牡荊素等化合物。Yu 等[32]發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛UDP-葡萄糖黃酮-3-O-葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因（DoUFGT1、DoUFGT2）(MH663506、MH663505) 在紅皮品系中的表達(dá)水平顯著高于綠皮品系。與此同時，紅皮品系中的飛燕草素3,5-O-二葡萄糖苷（Delphinidin 3,5-O-diglucoside）和花青素3-O-葡萄糖苷（Cyanidin 3-O-glucoside）含量要明顯高于綠皮品系。而總黃酮含量和抗氧化性也明顯高于綠皮莖。這些研究充分證明類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶(UFGT)在石斛屬植物黃酮合成中發(fā)揮了重要作用。

類似的研究，F(xiàn)eng 等[33]發(fā)現(xiàn)花青素類物質(zhì)在紅色玫瑰花瓣中顯著積累，而白色突變體花瓣中的黃酮醇含量卻顯著高于紅色花瓣。經(jīng)轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，9 個UFGT基因在白色玫瑰中顯著上調(diào)，而另外6 個UFGT基因卻顯著下調(diào)。這表明類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶(UFGT)能平衡類黃酮物質(zhì)的合成。

本研究初步探索了霍山石斛類黃酮-3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶（DhUF3GT）原核表達(dá)條件。該蛋白能在原核細(xì)胞中成功表達(dá)，且表達(dá)趨于折疊正確的活性蛋白形式。鑒于霍山石斛和鐵皮石斛親緣關(guān)系最近，初步可推測參與類黃酮糖基化反應(yīng)的該蛋白在結(jié)構(gòu)表征和功能上與鐵皮石斛具有高度的同源性。下一步實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步篩選特異性好、催化活性較高的UF3GT，為構(gòu)建霍山石斛類黃酮苷的生物合成路徑打下基礎(chǔ)。

5 總結(jié)

本研究成功克隆出霍山石斛類黃酮-3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶（DhUF3GT）基因序列，并獲得其序列特征及原核表達(dá)蛋白。這為霍山石斛DhUF3GT基因功能的進(jìn)一步研究和類黃酮化合物生物合成機(jī)制的闡述奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。同時，本研究為今后采用生物技術(shù)提高霍山石斛藥材黃酮成分含量，擴(kuò)大霍山石斛產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了重要的理論依據(jù)。