黃連NRAMP3基因的克隆與生物信息學分析＊

王文斌 ，劉義飛 ，劉 迪 ，胡志剛 ＊＊，汪 波

（1. 湖北中醫(yī)藥大學藥學院 武漢 430065；2. 湖北省藥品監(jiān)督檢驗研究院 武漢 430075）

中藥黃連（Coptidis Rhizoma）來源于毛茛科植物黃連Coptis chinensisFranch.、三角葉黃連Coptis deltoideaC.Y.Cheng et Hsiao 或云連Coptis teetaWall.的干燥根莖[1]，是我國傳統(tǒng)中藥材，生長于海拔500-2000 m間的山地林中或山谷陰處，主要分布在我國湖北、重慶、四川、陜西南部、貴州、湖南等地，其中湖北利川和重慶石柱是我國黃連的主產區(qū)，約占黃連總產量的80%以上。植物可以從土壤中吸收各種養(yǎng)分和必需元素來維持生長和發(fā)育。然而，一些有毒物質（如鎘）也會積累，這可能會對植物的生長發(fā)育、生理和生化特性產生不利影響。鎘作為有毒的重金屬之一，可以降低植物體內酶的活性及光合強度，造成代謝紊亂，改變細胞膜透性，阻礙根系生長，抑制其對水分和養(yǎng)分的吸收[2]，最終影響作物的產量和品質。此外，還會導致植物細胞內活性氧的產生與清除系統(tǒng)的平衡遭到破壞，甚至導致植物死亡[3-4]。在一項研究中表明，114 批次的黃連樣本中，僅有20份樣本鎘含量在黃連鎘限量值的正常范圍內，超標率為82.45%，鎘超標情況嚴重[5]。因此，鎘污染可能對黃連造成很大的損害，甚至危害消費者的健康。隨著現(xiàn)代工業(yè)、城市活動和交通的快速發(fā)展，黃連中的鎘污染已經成為影響其出口的重要因素。因此，研究黃連對鎘的吸收和運輸機理對其抗鎘和減鎘具有重要意義。

為了將重金屬的毒性降到最低，植物形成了一個完整的機制來控制金屬的吸收、運輸和積累分布。在重金屬脅迫下，一些植物會在根部積累金屬離子，限制根到地上部的運輸，從而減輕地上部分的毒害。植物細胞通過金屬螯合蛋白來螯合金屬離子，并通過金屬膜轉運蛋白將金屬離子運輸到液泡或從細胞中運送出去，從而表現(xiàn)出對這些重金屬的抵抗能力。自然耐藥相關巨噬細胞蛋白（NRAMP）是一類內膜轉運蛋白，通常有10-12 個跨膜結構域（transmembrane domain,TMD），1-2個糖基化位點和1個轉運蛋白特征的結構域[6-7]。NRAMP最先在小鼠身上發(fā)現(xiàn)[8]，并已被確認為細菌、真菌、昆蟲、植物和哺乳動物中的一種二價金屬轉運蛋白[9-10]。

植物中的NRAMP 蛋白參與多種二價陽離子的運輸，如 Fe2+、Mn2+、Cu2+、Pb2+和 Cd2+[11,12]。NRAMP 蛋白在擬南芥[13-15]、水稻[16-18]、東南景天[19-20]、大豆[12]、可可豆[21]和甘藍型油菜[22]中的作用已被分析。擬南芥中有6 個NRAMP 蛋白家族成員，通過系統(tǒng)發(fā)育分析，將其分為兩個亞家族，AtNRAMP1 和 AtNRAMP6 屬于第 I 組，AtNRAMP2、AtNRAMP3、AtNRAMP4、AtNRAMP5 蛋白屬 于 第 II 組[23]，并 且 AtNRAMP1、AtNRAMP3、AtNRAMP4 可以轉運 Fe，Mn 和 Cd[15,24]，而 AtNRAMP6只轉運Cd[25]。OsNramp1 可能參與鎘在植物根木質部的吸收，從而影響鎘向地上部的轉運[18]，而OsNramp5蛋白在水稻吸收錳和鎘過程中起著至關重要的作用[16-17,26-27]。東南景天SaNRAMP1 定位于質膜可以運輸 Zn、Mn 和 Cd[19]，SaNRAMP6 直接參與鎘的吸收，可以提高鎘的吸收速率和積累量[20]?？煽芍蠺cNRAMP3和TcNRAMP5 可以轉運生長必需的二價金屬陽離子（Fe、Mn）和 Cd2+，敲除TcNRAMP5 有望獲得低 Cd 品種可可[21]。多種植物的NRAMP 蛋白在Cd轉運中的作用已有研究。然而，NRAMP 蛋白家族的功能和鎘在黃連中的運輸機制仍不明確。

本研究在黃連參考基因組[28]數據庫中鑒定了黃連CcNRAMP3基因，通過TA 克隆該蛋白的編碼基因，并通過生物信息學分析黃連NRAMP3 蛋白的理化性質、亞細胞定位、跨膜結構域、系統(tǒng)進化關系等，對基因功能以及編碼蛋白的性質作出初步的判斷和預測，為研究黃連體內重金屬鎘轉運機制以及CcNRAMP3基因的功能作用提供參考依據。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料

黃連植株采自湖北省神農架林區(qū)，經肖凌博士鑒定為毛茛科植物味連（Coptis chinensis），移栽培養(yǎng)在湖北省藥品監(jiān)督檢驗研究院分子生物實驗室光照培養(yǎng)箱中，設置光照培養(yǎng)箱溫度為19±2℃；濕度為60%；光強1000-1500 Lx；光照時間14 h/天。實驗材料系霍格蘭營養(yǎng)液培養(yǎng)3 周長勢良好的黃連葉片，洗凈后液氮冷凍，置于-80℃冰箱備用。

1.2 試劑與儀器

HLingene 瓊脂糖凝膠回收/PCR 產物純化試劑盒購于上?；萘枭锛夹g有限公司。植物總RNA 提取試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司。pEASY?-Blunt 克隆載體和Trans1-T1 大腸桿菌感受態(tài)細胞購自北京全式金生物科技有限公司。IPTG 溶液（50 mg·mL-1）、X-Gal 溶液（20 mg·mL-1）、Amp 溶液（100 mg·mL-1）購自索萊寶生物科技有限公司。高效率PCR 酶KOD Dash 購于東洋紡（上海）生物科技有限公司。引物合成及測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。100×改良型霍格蘭營養(yǎng)液和Thermo First cDNA Synthesis Kit 反轉錄試劑盒購于武漢萊博金服科技有限公司

T100 型PCR 擴增儀（美國Bio-Rad）；冷凍高速離心機（Thermo Fisher Scientific）；Nano drop-2000 超微量分光光度計（Thermo Fisher Scientific）；DYY-10C 電泳儀（北京六一）；Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）；LWB-26 雙列六孔電熱恒溫水浴鍋（上海龍躍）；光照培養(yǎng)箱（上海博訊）。

2 方法

2.1 獲取目的基因

以擬南芥、水稻的NRAMP基因序列為參考序列，比對黃連基因組，通過blast 比對尋找黃連NRAMP家族基因（e 值≤e-10），并且將它們在Pfam 蛋白質家族數據庫（http://pfam.xfam.org/search）中進行檢驗以確保其包含NRAMP保守結構域（PF01566），得到黃連NRAMP3基因。

2.2 黃連葉片RNA的提取與cDNA的合成

黃連葉片用清水沖洗洗凈，濾紙吸干，并用液氮研磨成粉末，使用天根植物總RNA 提取試劑盒提取總RNA。使用瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計檢測提取的RNA 質量和濃度。然后以提取的總RNA 為模板，采用RNA 反轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA，50℃水浴20 min，85℃水浴10 min，滅活逆轉錄酶，儲存在-20℃冰箱中備用。

2.3 引物擴增與黃連NRAMP3基因的克隆

依據已測得的黃連基因組數據，查找該基因上下游1500 bp 長度，分別設計擴增引物（表1：上游引物3L-F 與3L-R；下游引物3R-F 與3R-R）將目的序列片段擴增，以確定黃連NRAMP3基因編碼序列。根據獲得的黃連NRAMP3基因序列，設計特異性擴增引物NRAMP3-F/R。以反轉錄得到的黃連葉片cDNA 為模板進行PCR 擴增，獲得NRAMP3的完整編碼序列。PCR 反應體系為：1μL KOD Dash，5μL 10 × Buffer for KOD Dash，5μL 2 mM dNTPs，3μL cDNA，34μL ddH2O，1μL NRAMP3-F Primer（10μmol·L-1），1μL NRAMP3-R Primer（10μmol·L-1），共 50μL。PCR 反應程序為：95℃ 5 min；95℃ 30 s，57℃ 30 s，74℃ 1 min30 s，反應進行32個循環(huán)；74℃ 10 min。

PCR 產物經切膠回收后，純化產物與pEASY-Blunt 克隆載體連接并轉化至Trans1-T1 感受態(tài)細胞，隨機挑選陽性克隆經菌液PCR 擴增后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序驗證，引物信息表見表1。

表1 引物信息表

2.4 黃連NRAMP3基因的生物信息學分析

對黃連NRAMP3基因測序完成后，利用TBtools 軟件（版本號為v1.0971）[22]查找黃連NRAMP3 基因的開放閱讀框并翻譯成氨基酸序列，在NCBI 數據庫中對氨基酸序列進行Blast 比對；利用GSDS 在線工具預測NRAMP3的基因結構；利用ExPASy 在線軟件分析NRAMP3編碼氨基酸序列的組成和理化性質；利用ProtScale 在線工具進行蛋白疏水性分析；利用ProtComp 在線軟件對NRAMP3的氨基酸序列進行亞細胞定位；利用SignalP 進行蛋白信號肽預測；利用TMHMM 通過隱馬爾可夫模型來預測蛋白跨膜區(qū)域判斷其是否為跨膜蛋白；利用SPOMA分析NRAMP3的蛋白質二級結構并進行預測，以了解局部空間結構；利用SWISS-MODEL 預測CcNRAMP3蛋白的三級結構；使用MEGA 6.05 軟件對CcNRAMP3序列進行多重比對分析，采用Neighbor-Joining 法構建蛋白質系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap 統(tǒng)計檢驗次數為500，其他參數設置為默認參數。

2.5 黃連NRAMP3基因表達分析

取3年生黃連的須根、根莖、葉柄、葉片材料，依據RNA 提取試劑盒的操作步驟，提取總RNA，Thermo First cDNA Synthesis Kit 反轉錄試劑盒進行基因的定量表達分析。以黃連actin作為內參基因，檢測NRAMP3基因在黃連各組織部分的表達情況（引物見表1）。使用PikoReal 實時定量PCR 儀。每個樣品設置3 次重復。數據采用2--△△CT法方法進行處理。

3 結果

3.1 黃連NRAMP3基因的克隆

根據黃連基因組中找到的黃連NRAMP3基因組序列上下游1500bp 設計的引物將NRAMP3序列進行擴增，以確定NRAMP基因序列的首尾端正確序列，并以此為依據設計引物進行DNA擴增，確定該基因的序列全長2771 bp。通過GSDS 網站在線分析基因結構，發(fā)現(xiàn)黃連NRAMP3具有4 個外顯子和3 個內含子（圖1）。

圖1 黃連NRAMP3的基因結構分析

依據天根植物RNA 提取試劑盒說明書要求，選取新鮮潔凈黃連葉片提取總RNA，將凝膠電泳條帶清晰、吸光度與濃度均滿足實驗要求的RNA 作為模板RNA。用反轉錄試劑盒將RNA 樣品合成cDNA 第一條鏈。以黃連葉片cDNA 為模板，利用設計的引物擴增了約1500 bp 的條帶，與預期結果長度一致（圖2）。將該片段切膠回收后與pEASY-Blunt 載體連接，轉化至大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆的進行菌液PCR，最后將序列提交至GenBank，基因登錄號為KAF9619594.1。

圖2 黃連CcNRAMP3基因電泳圖

用CodonCode Aligner 軟件拼接測序結果的峰圖，得到1617 bp 的cDNA 序列，經TBtools 軟件分析發(fā)現(xiàn)其為一個完整的開放閱讀框，共編碼538 個氨基酸。將該氨基酸序列進行blast 比對，結果表明，與GenBank 已報道的其他植物的NRAMP3蛋白序列具有較高的相似性，將該基因命名為CcNRAMP3。利用Pfam 分析氨基酸序列的保守結構域，發(fā)現(xiàn)CcNRAMP3蛋白的第98-461位氨基酸殘基是典型的NRAMP結構域（PF01566）。

3.2 CcNRAMP3 基因編碼蛋白的序列分析

3.2.1 理化特性分析

利用ExPASy數據庫的ProtParam工具（https://web.expasy.org/protparam/）分析黃連NRAMP3基因轉化的蛋白序列，發(fā)現(xiàn)CcNRAMP3蛋白包含538個氨基酸，分子量為58.93 kD，等電點為5.46，帶負電荷的殘基（Asp+Glu）為44，帶正電荷的殘基（Arg+Lys）為37，含有20 種氨基酸，異亮氨酸含量最高，占比12.6%，半胱氨酸含量最低，占比1.1%，分子式為C2714H4267N667O753S20。蛋白質不穩(wěn)定系數為38.29，屬于穩(wěn)定蛋白質。

使用EXPASY的Protscale在線工具預測NRAMP3蛋白的親水性和疏水性（圖3），發(fā)現(xiàn)在第8個氨基酸位置，最低峰值是-3.278，在第511 個氨基酸位置，最高峰值是3.178，平均親水性為0.496，這表明該蛋白是疏水性蛋白。

圖3 CcNRAMP3蛋白的親疏水性預測結果

3.2.2CcNRAMP3蛋白信號肽、亞細胞定位、跨膜結構域預測

SignalP-5.0 Server軟件分析結果顯示，含有Sec信號肽（Sec/SPI）的可能性為0.0017，不含有信號肽（Other）的可能性為0.9983，預測CcNRAMP3蛋白不含信號肽序列，不屬于分泌型蛋白。使用ProtComp 9.0對CcNRAMP3的亞細胞定位進行預測，預測結果表明CcNRAMP3蛋白質定位于液泡膜上。利用TMHMM Server v. 2.0 預測CcNRAMP3蛋白的跨膜結構域（transmembrane domain，TMD），對應的氨基酸殘基區(qū)域分別為 78-98、113-135、156-178、188-210、217-234、258-280、301-323、356-378、398-415、430-449、461-483、493-515。結果表明，CcNRAMP3蛋白含有12個跨膜區(qū)域，具有膜蛋白的重要特征（圖4）。

圖4 黃連NRAMP3蛋白跨膜結構域分析

3.2.3CcNRAMP3蛋白二級結構預測

經 PRABI 網站的 SOPMA 程序對CcNRAMP3蛋白二級結構進行分析，預測發(fā)現(xiàn)CcNRAMP3蛋白主要由α 螺旋（Alpha helix，Hh）、延伸鏈（Extended strand，Ee）、β 轉角（Beta turn，Tt）和無規(guī)則卷曲（Random coi，Cc）四部分結構組成（圖5），Alpha helix 有304 個氨基酸，占比56.51%、Extended strand 有 64 個氨基酸，占比11.90%、Beta turn 有19 個氨基酸，占比3.53%、Random coi 有151 個氨基酸，占比28.07%。α-螺旋與無規(guī)則卷曲是多肽鏈的主要結構元件。Alpha helix、Extended strand 和Random coil 貫穿于整個氨基酸鏈，Beta turn只有一點點，散布在Helix附近。

圖5 黃連NRAMP3蛋白二級結構圖

3.2.4 三維建模

對CcNRAMP3蛋白的三級結構預測分析顯示，CcNRAMP3蛋白與葡萄球菌錳轉運突變體MntH 的晶體結構（二價金屬陽離子轉運體MntH）具有37%的序列相似性，以該蛋白（SMTL ID：5m8a.1.A）為模板，通過同源建模構建CcNRAMP3蛋白的三級結構，用于建模的氨基酸殘基范圍為70-519位，占編碼氨基酸總數的83%，蛋白三級結構如圖6。

圖6 黃連NRAMP3蛋白的三級結構

3.3 多序列比對分析

為研究黃連CcNRAMP3蛋白在物種中的進化位置和親緣關系，利用MEGA 6.05 對水稻（Oryza sativa）、擬 南 芥（Arabidopsis thaliana）、玉 米（Zea mays）、芝 麻（Sesamum indicum）、煙 草（Nicotiana tabacum）、蓮（Nelumbo nucifera）等植物的NRAMP3蛋白序列進行進化樹分析比較。進化關系表明（圖7），黃 連CcNRAMP3與 博 落 回McNRAMP3（Macleaya cordata, accession no. OVA01006.1）、蓮（Nelumbonucifera, accession no. XP_010271562.1）親緣關系最近 ，與 煙 草（Nicotiana tabacum）、芝 麻（Sesamum indicum）、中 華 獼 猴 桃（Actinidia chinensisvar.chinensis）、棗（Ziziphus jujuba）、梅（Prunus mume）等聚為一個大類。

圖7 黃連NRAMP3蛋白的多序列比對分析

3.4 NRAMP3基因表達情況

利用天根植物RNA 提取試劑盒提取水培黃連的須根、根及根莖、葉柄、葉片，采用qPCR 方法分析CcNRAMPs家族在不同組織中的表達水平。結果表明，在未受鎘脅迫時，CcNRAMP3基因在根、莖、葉中都有表達，但是不同器官中的表達具有特異性，在黃連地上部分含量比地下部分含量高。在黃連遭受鎘脅迫時，在須根表達量顯著增加后逐漸下降，葉柄與根莖中的表達量下降一度被抑制，而葉片部位的表達量有較大變化。依據結果初步判斷CcNRAMP3基因可能參與Cd脅迫響應，并且與黃連積累Cd的特性相關，并且該基因在根部對Cd脅迫的響應最為敏感。

4 討論

黃連藥用歷史悠久，藥用始載于《神農本草經》，一名“王連”。稱其“味苦，寒，無毒。治熱氣，目痛，眥傷，腸澼，腹痛，下利，泣出，明目，婦人陰中腫痛。”此后成為歷代醫(yī)家常用的苦寒降火，清熱燥濕要藥。但隨著工業(yè)發(fā)展，其生長環(huán)境遭到嚴重破壞，尤其是在種植過程中重金屬污染、化肥、農藥和生長調節(jié)劑濫用等，野生黃連的資源越來越少。黃連藥用部位為根莖，而其須根和根莖卻為鎘富集的主要部位，鎘富集程度明顯大于莖和葉[29]，無公害種植黃連的要求顯得尤為重要[30]。由于鎘不是植物生長所必需的金屬元素，在植物中不認為其有專用的轉運通路或蛋白[3]，故明確黃連中鎘及其螯合物相關轉運蛋白的性質，對了解黃連體內鎘的積累機制，尤其是黃連響應鎘脅迫的分子機制方面有著重要的意義，有助于揭示黃連體內鎘調節(jié)網絡，也可以為黃連抗鎘育種提供基因資源。

NRAMP家族基因在進化過程中高度保守，廣泛分布于哺乳動物、酵母和高等植物中，并參與了Zn、Fe、Mn、Cd 等二價金屬。OsNRAMP1定位于質膜，被認為參與了細胞對 Cd 的吸收；OsNRAMP5將 Fe、Mn 和 Cd從外源溶液轉運到根細胞[31]。 有趣的是，與OsNRAMP5相近的同源物種大麥（Hordeum vulgare）轉運蛋白HvNRAMP5也定位在質膜上，但只運輸Cd 和Mn 離子，而不轉運Fe[31]，兩者具有不同的吸收系統(tǒng)。AtNRAMP3定位于液泡膜上，可以將存儲在液泡中的金屬離子釋放到液泡膜附近的細胞質中[33]。小金海棠MxNRAMP1定位于質膜，MxNRAMP3定位于液泡膜[34]，表達在酵母中可以轉運鎘，而不能轉運其他金屬。

圖8 黃連NRAMP3在鎘脅迫下的表達情況

本研究采用TA 克隆從黃連中克隆出了CcNRAMP3的編碼基因，對CcNRAMP3跨膜結構域的預測結果表明，CcNRAMP3蛋白含有12 個可能的跨膜區(qū)域。通過對黃連CcNRAMP3基因編碼的蛋白序列進行分析發(fā)現(xiàn)，在第98-461 氨基酸殘基處含有一個NRAMP蛋白結構域，并在第209-212氨基酸殘基處存在一個N-糖基化位點。亞細胞定位預測結果表明，CcNRAMP3蛋白定位于液泡膜上。以上結果說明，黃連CcNRAMP3具有NRAMP蛋白家族的重要特征，是一個典型的NRAMP蛋白家族成員。序列相似性比對和系統(tǒng)進化樹分析表明，黃連CcNRAMP3蛋白與博落回、蓮、煙草等植物的NRAMP3蛋白親緣關系最近，序列相似性高，表明CcNRAMP3可能與這些蛋白具有相似功能，可以轉運諸如鎘等常見金屬離子。與擬南芥NRAMP家族基因的AtNRAMP3和AtNRAMP4在蛋白水平上具有較高的相似性。AtNRAMP3與AtNRAMP4蛋白均定位在液泡膜上[14]，這與CcNRAMP3一致。AtNRAMP3主 要 轉 運 Fe、Mn 和 Cd 等 元 素 ，而AtNRAMP4除了轉運Fe、Mn和Cd以外還能轉運Zn，這表明黃連CcNRAMP3基因可能也具有Cd2+的吸收、轉運功能。

為了研究CcNRAMP3基因在黃連內的分布及受Cd 脅迫后的表達情況，本實驗利用qPCR 技術分析CcNRAMP3基因的時空表達模式。結果表明，CcNRAMP3基因在黃連各組織均有表達，且在葉片表達量最高。在受到Cd脅迫時，CcNRAMP3基因在須根中首先大量表達而后逐漸下降，這與植物吸收金屬的吸收轉運機制相似。整體上講在須根中的表達情況是急劇升高而后逐漸降低的過程，這可能是黃連應對Cd 脅迫的一種調控方式，降低CcNRAMP3表達量，從而降低對Cd的吸收，抑或黃連吸收鎘的量超過了自身耐受閾值，其自身防御系統(tǒng)被激發(fā)（植株死亡）而導致NRAMP基因的表達量下降。結合CcNRAMP3定位在液泡上，以上推測其與重金屬Cd2+轉運相關。

隨著工業(yè)的發(fā)展，重金屬污染對生物造成了嚴重威脅，根據其生物有效性濃度和受體暴露敏感性，重金屬具有潛在的毒性。大量研究表明植物必需金屬與非必需金屬存在競爭吸收，如Zn2+/Cd2+。在這些金屬中，那些類似于離子價態(tài)營養(yǎng)素的元素（如Hg、Pb和Cd）被認為構成了更大的威脅，因為它們可以通過現(xiàn)有的金屬吸收通道被植物吸收和利用，如何有效地減輕重金屬污染的問題已經引起了全世界的關注。本研究首次克隆出了CcNRAMP3基因，通過生物信息學分析及序列比對分析，確定該基因的理化性質及結構，結合其在黃連植物體內表達情況及在鎘脅迫下的表達情況，認為該基因可能與黃連Cd 轉運吸收有關，同時為后續(xù)抗性植物的篩選奠定了基礎。未來可考慮應用基因工程技術將抗性基因或決定鎘超富集的基因導入理想植物體內，進行基因重組和表達，或者通過抑制轉運Cd的基因，從而抑制黃連吸附重金屬的效率，從而降低黃連植株中的鎘含量，真正意義上促進中藥材的無公害種植。