基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究不同海拔生境神農(nóng)香菊的基因表達(dá)差異＊

周春苗，蔣莉萍，董剛強(qiáng)，劉義飛，陳士林，張景景＊＊

（1. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 武漢 430065；2. 安利（中國(guó)）植物研發(fā)中心 無錫 214115；3. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 北京 100700）

神農(nóng)香菊（Chrysanthemum indicumvar.aromaticum）為菊科菊屬野菊的變種，是1982年武漢植物研究所劉啟宏等人首次發(fā)現(xiàn)并命名的一種新資源植物[1]。與原變種野菊相比，其植株矮小，葉片較厚，頭狀花序較小，但全株具有濃郁的香氣[2]，民間常用于清熱解毒、清咽利喉、散風(fēng)降壓等[3]?，F(xiàn)代研究表明，神農(nóng)香菊的揮發(fā)油中富含α-側(cè)柏酮、β-側(cè)柏酮及龍腦等萜烯類化合物，含量較野菊和其他栽培藥菊高[4]。此外，神農(nóng)香菊還被用來提取精油和浸膏，廣泛用于食品、香精香料和化工等領(lǐng)域，是觀賞菊和藥用菊優(yōu)良芳香品種改良的重要種質(zhì)資源，開發(fā)利用價(jià)值極高，應(yīng)用前景廣泛。

神農(nóng)香菊的自然分布范圍極其狹窄，僅在神農(nóng)架林區(qū)南部靠近巴東、興山兩縣的大神農(nóng)架、小神農(nóng)架、神農(nóng)頂?shù)鹊赜幸吧尤?，其中在海?,600 -2,700 m的范圍內(nèi)種群密度最大，但資源總體蘊(yùn)含量有限[5-6]，無法滿足大量開發(fā)利用的需求。自1984年起，研究者開展了大量的神農(nóng)香菊引種移栽試驗(yàn)，但神農(nóng)香菊在引種擴(kuò)繁的過程中其花期、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期及香氣成分等均因生境改變而存在明顯差異，從而影響其開發(fā)應(yīng)用價(jià)值[7-8]。神農(nóng)香菊引種栽培到低海拔區(qū)域，會(huì)出現(xiàn)香氣發(fā)生改變的情況，說明海拔相關(guān)的生態(tài)因子對(duì)其特征代謝產(chǎn)物的形成影響較大。因此，開展神農(nóng)香菊主要香氣特征物質(zhì)由于海拔變化而發(fā)生改變的內(nèi)在分子調(diào)控機(jī)制則成為其資源深度開發(fā)應(yīng)用的當(dāng)務(wù)之急。

目前關(guān)于神農(nóng)香菊分子水平的研究較少，僅有萜類合成途徑相關(guān)的少數(shù)基因、轉(zhuǎn)錄因子的克隆及功能分析的報(bào)道[9-13]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)是一門在整體水平研究基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平，并以此調(diào)查其結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)方法。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序因具有高通量和高準(zhǔn)確性，且測(cè)序的成本較低，時(shí)間短等特點(diǎn)[14-15]，被廣泛應(yīng)用于研究植物生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律、逆境生理、脅迫響應(yīng)機(jī)制及代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并可基于比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)并聯(lián)合代謝組學(xué)、蛋白組學(xué)等多組學(xué)技術(shù)挖掘關(guān)鍵基因，為開展更深入的研究提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)[16-18]。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在研究高山植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性方面也有重要意義，例如，基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，揭示了高海拔植物鐘花報(bào)春具有通過轉(zhuǎn)錄組變異快速適應(yīng)氣候變化的能力[19]。有研究者在結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)分析的基礎(chǔ)上，研究了不同海拔高山杜鵑花屬物種不同顏色花的基因表達(dá)模式、進(jìn)化適應(yīng)和代謝物沿海拔梯度的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因與碳水化合物、脂肪酸、氨基酸和類黃酮的生物合成有關(guān)，這表明它們?cè)诙霹N花屬物種的海拔適應(yīng)性中具有重要作用[20]。對(duì)不同溫度生長(zhǎng)下的藏邊大黃的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示差異表達(dá)基因主要屬于信號(hào)通路，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，次級(jí)代謝物，植物激素以及與細(xì)胞保護(hù)相關(guān)的基因，這表明它們?cè)谫x予藏邊大黃在其生態(tài)位中的適應(yīng)性優(yōu)勢(shì)方面的重要性[21]。

作為高海拔野生分布的非模式植物神農(nóng)香菊，現(xiàn)尚未開展全基因組測(cè)序，通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析與挖掘，能夠篩選參與生長(zhǎng)發(fā)育及代謝的功能基因，并鑒定差異表達(dá)基因，解析相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這對(duì)其高山環(huán)境的適應(yīng)性策略、香氣品質(zhì)形成機(jī)制的研究及資源保護(hù)利用具有重要意義。本研究對(duì)種植在不同海拔高度的神農(nóng)香菊樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，調(diào)查不同海拔種植區(qū)的神農(nóng)香菊在適應(yīng)環(huán)境過程中基因表達(dá)差異，分析相關(guān)的代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控關(guān)鍵基因，闡述神農(nóng)香菊對(duì)不同海拔種植區(qū)的環(huán)境適應(yīng)機(jī)制，以期為神農(nóng)香菊由高海拔向低海拔的引種擴(kuò)繁和資源保護(hù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

用于生態(tài)因子分析的神農(nóng)香菊包括天門埡（2,095 m）和神農(nóng)頂（2,880 m）兩個(gè)原生境地方，以及黃龍堰（1,720 m）和宋洛（816 m）兩個(gè)種植移栽點(diǎn)。用于轉(zhuǎn)錄組分析的神農(nóng)香菊樣品取自種植點(diǎn)高海拔的黃龍堰和低海拔的宋洛。兩個(gè)種植點(diǎn)的神農(nóng)香菊原始材料具有相同的遺傳背景。于盛花期采集神農(nóng)香菊花（F）、葉（L）、莖（S）樣品，高海拔區(qū)域標(biāo)記為H，低海拔區(qū)域標(biāo)記為L(zhǎng)，每個(gè)組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。用液氮速凍后放于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 生態(tài)因子提取

利用 WheatA（http://www.wheata.cn/）提取神農(nóng)香菊四個(gè)樣品點(diǎn)（天門埡、神農(nóng)頂、黃龍堰、宋洛）2016至2020 年連續(xù)5 年的8 個(gè)生態(tài)因子，主要包括年均溫（℃）、年降水量（mm）、平均濕度（%）、年日照時(shí)數(shù)（h）、最熱月平均溫度（℃）、最冷月平均溫度（℃）、最熱月平均降水量（mm）以及最冷月平均降水量（mm），并基于單因素方差分析（ANOVA）對(duì)四個(gè)地點(diǎn)的生態(tài)因子數(shù)值進(jìn)行顯著分析。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及組裝

用RNA 試劑盒提取神農(nóng)香菊樣品花（HF，LF）、葉（HL，LL）和莖（HS，LS）的總RNA，用NanoDrop 超微量分光光度計(jì)（Thermo Scientific,美國(guó)）測(cè)定濃度以及質(zhì)量，檢測(cè)合格（OD260/OD280≥2.0）后用于cDNA 文庫(kù)構(gòu)建，利用Illumina HiSeq 4000 高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，去除帶接頭的，不確定的以及低質(zhì)量的序列。因?yàn)樯褶r(nóng)香菊缺乏基因組數(shù)據(jù)，故用 Trinity（http://trinityrnaseq.sourceforge.net/）進(jìn)行從頭拼接，采用Corset 軟件[22]將組裝好的轉(zhuǎn)錄本聚類并形成unigenes。通過聚合冗余轉(zhuǎn)錄本從而提高差異表達(dá)基因的檢出率，最后得到的數(shù)據(jù)集用于后續(xù)分析。

1.2.3 Unigenes 功能注釋

利 用 Nr （Non-Redundant Protein Sequence Database）非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/db/FASTA），KOG（Eukaryotic Orthologous Groups）蛋白質(zhì)直系同源簇?cái)?shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/research/kog），SwissPro 蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.expasy.ch/sprot），KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）京都基因百科全書數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.genome.jp/kegg），GO（Gene Ontology）基因本體數(shù)據(jù) 庫(kù)（http://www. geneontology. org/），Nt（Nucleotide Sequence Database）核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/db/FASTA）和PFAM 蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫(kù)（http://pfam.xfam.org/）等七大數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)神農(nóng)香菊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)得到的基因進(jìn)行注釋。

1.2.4 差異基因分析

采用RSEM[23]軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本定量分析，將readcount 數(shù) 進(jìn) 行 FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript sequence per Millions）轉(zhuǎn)換用于表示基因的表 達(dá) 量 。 用 DESeq2（http://www. bioconductor. org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html）進(jìn)行差異表達(dá)分析，以|log2(FoldChange)|＞1&P-value＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異基因。為了控制假陽(yáng)性比例，引入P-adj 對(duì)假設(shè)檢驗(yàn)的P-value 進(jìn)行校正。得到的差異基因在KEGG 和GO 數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋。后續(xù)的可視化分析在R軟件（https://www.r-project.org/）、Graphpad prism 8（https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/）以及 TBtools（https://github.com/CJ-Chen/TBtools/releases）中完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 海拔相關(guān)的生態(tài)因子差異分析

對(duì)神農(nóng)香菊兩個(gè)原生境及兩個(gè)栽培點(diǎn)的生態(tài)因子進(jìn)行顯著性差異分析，結(jié)果表明，野生神農(nóng)香菊最低分布區(qū)與最高分布區(qū)神農(nóng)頂?shù)纳鷳B(tài)因子包括年平均氣溫、最冷月平均溫度均有顯著性差異，而降水、相對(duì)濕度、年日照時(shí)長(zhǎng)均無顯著性差異。高海拔種植點(diǎn)黃龍堰與野生神農(nóng)香菊最低分布區(qū)天門埡的主要生態(tài)因子如年平均氣溫、最冷月平均溫度、相對(duì)濕度、年日照時(shí)長(zhǎng)以及降水等均無顯著性差異，而與最高分布區(qū)神農(nóng)頂?shù)哪昶骄鶜鉁?、最冷月平均溫度、相?duì)濕度都有顯著性差異。低海拔種植點(diǎn)宋洛與兩個(gè)神農(nóng)香菊野生分布區(qū)的主要生態(tài)因子如年平均氣溫、最冷月平均溫度、相對(duì)濕度、年日照時(shí)長(zhǎng)均有顯著性差異，而降水與相對(duì)濕度并無顯著性差異。高海拔種植點(diǎn)黃龍堰與低海拔種植點(diǎn)宋洛有關(guān)溫度的生態(tài)因子（包括年均溫、最熱月平均溫度、最冷月平均溫度）以及年日照時(shí)長(zhǎng)均有顯著性差異。這說明高海拔種植點(diǎn)黃龍堰的環(huán)境與野生神農(nóng)香菊最低分布區(qū)的環(huán)境相近，在海拔相關(guān)的環(huán)境因子中，溫度可能是影響神農(nóng)香菊生態(tài)適應(yīng)性的最重要因子之一，而在低海拔種植點(diǎn)宋洛，除了溫度，光照也可能重要的影響了神農(nóng)香菊的生長(zhǎng)發(fā)育（圖1）。

圖1 四地生態(tài)因子顯著性分析柱形圖

2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序組裝與注釋

對(duì)兩個(gè)種植點(diǎn)的神農(nóng)香菊樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，其中高海拔種植點(diǎn)黃龍堰的樣本（HF、HL 和HS）共產(chǎn)生22,347,910 原始序列，質(zhì)控后得到約22,103,228 干凈序列；低海拔種植點(diǎn)宋洛（LF、LL 和LS）的測(cè)序樣本共產(chǎn)生約22,447,988 原始序列，質(zhì)控后得到約22,161,301 干凈序列。測(cè)序所得堿基錯(cuò)誤率均小于0.03%，Q20 大于97.02%，Q30 大于 92.01%，且GC 含量占比范圍為41.6%-42.54%，有效數(shù)據(jù)量均超過6.17 Gb。說明本實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)組裝質(zhì)量較好，可用于后續(xù)分析（表1）。

表1 神農(nóng)香菊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量分析結(jié)果

將有效數(shù)據(jù)組裝后共獲得439,485 個(gè)轉(zhuǎn)錄本，去冗余后得到158,174 條unigenes，核苷酸總數(shù)分別為466,346,195 和146,386,887，序列平均長(zhǎng)度分別為1,061 bp 和 925 bp，N50 長(zhǎng)度分別為 1,457 bp 和 1,255 bp。超過71.3%的unigene長(zhǎng)度小于1 kb，unigene長(zhǎng)度大于2 kb的占比9.5%（圖2A）。

利 用 Nr、Nt、SwissProt、PFAM、KOG、GO 以 及KEGG 七大數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)158,174 個(gè)unigenes 進(jìn)行功能注釋，有 90,030 個(gè) unigenes（56.91%）在Nr 數(shù)據(jù)庫(kù)中被注釋到，GO 數(shù)據(jù)庫(kù)和KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)分別注釋了63,627（40.22%）和33,997 個(gè)unigenes（21.49%），有7.91%的unigenes 在所有數(shù)據(jù)庫(kù)中都被注釋到，至少一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù) 中 注 釋 到 的 unigenes 有 104, 486（66.05%）個(gè)（圖2B）。

根據(jù)序列同源性，對(duì)63,627個(gè)unigenes進(jìn)行GO功能注釋并分類，一共注釋到生物過程（Biological Process）、細(xì)胞組成（Cellular Component）和分子功能（Molecular Function）三個(gè)功能分類的43 個(gè)GO terms結(jié)果。在生物過程中，注釋最多的基因被歸類于細(xì)胞過 程（cellular process, GO: 0009987）、代 謝 過 程（metabolic process, GO:0008152）、生物調(diào)節(jié)（biological regulation, GO:0065007）以及定位（localization, GO:0051179）類別。在細(xì)胞組成中，注釋最多的基因被歸類為細(xì)胞解剖實(shí)體（cellular anatomical entity, GO:0110165）、細(xì)胞內(nèi)部（intracellular, GO:0005622）以及含蛋白質(zhì)復(fù)合物（protein-containing complex, GO:0032991）類別。在分子功能中，注釋最多的基因被歸類于結(jié)合（binding, GO:0005488）和催化活性（catalytic activity,GO:0003824）類別。共有 33,997 條 unigenes 被注釋到了KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)中的299 個(gè)代謝通路，包括有機(jī)系統(tǒng)（Organismal Systems）、代謝（Metabolism）、遺傳信息處理（Genetic Information Processing）、環(huán)境信息處理（Environmental Information Processing）以及細(xì)胞過程（Cellular Processes）的不同通路類別。在注釋到的次生代謝物的生物合成途徑中，unigenes 數(shù)量最多的是苯丙素類生物合成途徑（ko00940），不飽和脂肪酸生物合成途徑（ko01040），萜類生物合成途徑（ko00900、ko00909、ko00902、ko00130）以及黃酮類生物合成途徑（ko00941），這些途徑大多以合成揮發(fā)性代謝物質(zhì)為主，與神農(nóng)香菊全株富含香氣的表型特征及前人對(duì)神農(nóng)香菊揮發(fā)性代謝物的研究相一致，表明較多的unigenes參與到了神農(nóng)香菊濃郁香氣品質(zhì)形成中（圖2C、圖2D）。

圖2 Unigenes長(zhǎng)度分布及功能注釋。

2.3 不同海拔種植點(diǎn)神農(nóng)香菊基因表達(dá)分析

基于FPKM 結(jié)果，6 組樣品中檢測(cè)到的表達(dá)基因（3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的FPKM 大于0）的數(shù)量均超過10萬，且高海拔黃龍堰樣本中表達(dá)基因的數(shù)量高于低海拔宋洛種植點(diǎn)的樣本，其中高海拔莖（HS）中檢測(cè)到的表達(dá)基因的數(shù)量最多（134,904個(gè)）（圖3A）。韋恩圖結(jié)果顯示，共有71,918 個(gè)基因在所有樣本中均有表達(dá)，不

2.4 差異基因篩選與KEGG通路富集分析

本研究基于FPKM，以低海拔花（LF）、葉（LL）、莖（LS）為對(duì)照組，以P-adj＜0.05 和|log2FoldChange|＞1 為標(biāo)準(zhǔn)篩選種植在黃龍堰和宋洛兩個(gè)不同海拔區(qū)域神農(nóng)香菊間的差異基因。結(jié)果顯示在兩個(gè)海拔神農(nóng)香菊葉組織樣本比較組HL vs LL 中篩選到的差異表達(dá)基因最多，共鑒定到8,037 個(gè)差異基因，其中在高海拔同海拔種植點(diǎn)不同組織樣本中特異性表達(dá)基因的數(shù)量存在較大差異，其中低海拔葉（LL）中有4,993 個(gè)特異表達(dá)基因，高海拔種植點(diǎn)不同樣本中檢測(cè)到了441-643 個(gè)特異表達(dá)基因（圖3B）。皮爾遜（Pearson）相關(guān)性分析顯示所有樣本3個(gè)生物學(xué)重復(fù)間及同一海拔種植點(diǎn)莖和葉樣本間基因表達(dá)相關(guān)性較高。另外，不同海拔種植點(diǎn)同一組織樣本間也呈現(xiàn)了較高的基因表達(dá)相關(guān)性（圖3C）。主成分分析結(jié)果表明不同海拔種植點(diǎn)及其不同組織樣本實(shí)現(xiàn)分離（圖3D）。上述結(jié)果表明神農(nóng)香菊在不同海拔種植點(diǎn)及不同組織間基因具有相似的表達(dá)模式，但同時(shí)也存在明顯的差異。葉組織中下調(diào)表達(dá)的基因最多，有6,070 個(gè)，有1,967個(gè)基因上調(diào)表達(dá)。在莖組織樣本比較組HS vs LS 中，一共鑒定到6,139 個(gè)差異表達(dá)基因，同樣在高海拔莖組織中下調(diào)表達(dá)的基因最多，有3,925 個(gè)，而上調(diào)表達(dá)基因有2,214 個(gè)。在花組織樣本比較組HF vs LF 中，一共篩選到1,328 個(gè)差異基因，其中在高海拔花組織中上調(diào)表達(dá)的基因?yàn)?02個(gè)，而下調(diào)表達(dá)的基因有526個(gè)。分析結(jié)果表明神農(nóng)香菊不同組織基因表達(dá)均受到海拔相關(guān)的環(huán)境因子變化的影響，其中葉和莖的響應(yīng)程度最為明顯。對(duì)于高海拔莖和葉，差異基因中表達(dá)下調(diào)的占多數(shù)，而高海拔花中表達(dá)上調(diào)的差異基因占多數(shù)（圖4A、圖4B）。

圖3 不同海拔神農(nóng)香菊基因表達(dá)量分析。

圖4 不同海拔種植區(qū)神農(nóng)香菊差異基因分析。

將所有的差異基因映射到KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)中，以獲得差異基因參與的代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在兩地神農(nóng)香菊花、莖以及葉三個(gè)比較組中，差異基因主要富集到33個(gè)次生代謝途徑，其中差異基因富集最多的是苯丙素生物合成途徑（ko00940），三個(gè)比較組分別有14、73、53 個(gè)差異基因富集。其次為不飽和脂肪酸生物合成途徑（ko01040），分別有3、75、29個(gè)差異基因富集。對(duì)于亞麻酸代謝途徑（ko00592），三個(gè)比較組分別有12、42、27 個(gè)差異基因富集。在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（ko04075）中，三個(gè)比較組分別有4、47、55個(gè)差異基因富集。富集到與萜類生物合成相關(guān)的途徑共有5 條，包括萜類骨架生物合成途徑（ko00900）、倍半萜和三萜生物合成途徑（ko00909）、單萜生物合成途徑（ko00902）和泛素酮和其他萜醌生物合成途徑（ko00130）。分別有46、39 差異基因富集到脂肪酸生物合成途徑（ko00061）以及黃酮類化合物的生物合成途徑（ko00941）。在涉及植物生長(zhǎng)發(fā)育等的途徑包括植物激素信號(hào)傳導(dǎo)、光合作用生物的碳固定作用、晝夜節(jié)律-植物和光合作用等途徑中均有富集（圖4C）。富集分析結(jié)果表明神農(nóng)香菊對(duì)不同海拔生境的適應(yīng)經(jīng)歷了復(fù)雜的生理生化過程，涉及多基因差異表達(dá)、多途徑共同參與及多種代謝產(chǎn)物的積累。

2.5 揮發(fā)性萜類物質(zhì)生物合成相關(guān)基因表達(dá)模式

研究表明，神農(nóng)香菊中揮發(fā)性成分中萜烯類成分占比較大，主要以單萜和倍半萜及其含氧衍生物為主[4]?；贙EGG 富集結(jié)果在三個(gè)比較組中共發(fā)現(xiàn)30個(gè)差異基因與萜類生物合成有關(guān)，其中17個(gè)參與上游萜類骨架的合成，分別有8 個(gè)和4 個(gè)與下游倍半萜和單萜類生物合成有關(guān)。整體上，這些基因在不同海拔種植樣本及不同組織樣本間的表達(dá)模式存在較大差異，以低海拔神農(nóng)香菊樣本中表達(dá)量較高的基因數(shù)量最多。

在上游MEP 途徑中，1-脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase,DXS）和1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸還原異構(gòu)酶基因（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphatereductoisomerase,DXR）被認(rèn)為是萜烯類合成的關(guān)鍵酶。分析發(fā)現(xiàn)共有5 個(gè)DXS，其中 1 個(gè)DXS（Cluster-57284.37357）均在高海拔三個(gè)組織中上調(diào)表達(dá)，以高海拔花（HF）中的表達(dá)量最高；3 個(gè)DXS在不同海拔種植區(qū)的莖中表現(xiàn)出較高 表 達(dá) 量 ，其 中 2 個(gè)DXS（Cluster-57284.33469 和Cluster-57284.69971）表達(dá)模式相似，均在低海拔莖（LS）中表達(dá)量最高，而Cluster-57284.45777 則在高海拔 莖（HS）中 表 達(dá) 量 最 高 ；1 個(gè)DXS（Cluster-57284.53950）高表達(dá)出現(xiàn)在花器官中，以低海拔花（LF）中表達(dá)量最高。挖掘到1 個(gè)DXR（Cluster-57284.49820），發(fā)現(xiàn)其表達(dá)模式與上述1 個(gè)DXS（Cluster-57284.37357）相反，即均在低海拔種植樣本三個(gè)組織中上調(diào)表達(dá)，以低海拔莖（LS）中表達(dá)量最高。MVA 途徑中的7 個(gè)差異基因也受到不同海拔生境和不同組織發(fā)育的影響，其中，3 個(gè)?；o酶A-膽固醇?；D(zhuǎn)移酶（acetyl-CoA C-acetyltransferase,ACAT）（Cluster-31241.0，Cluster-32214.1和Cluster-4297.0）和1 個(gè)羥甲基戊二酰輔酶A 合酶基因（hydroxymethylglutaryl-CoAsynthase,HMGCS）（Cluster-57284.909）表達(dá)模式一致，均在低海拔葉（LL）中上調(diào)表達(dá)且表達(dá)量最高。1 個(gè)ACAT（Cluster-57284.49820）和1 個(gè)磷酸甲羥戊酸激酶基因（mevalonate kinase,MVK）（Cluster-57284.8960）則在低海拔花（LF）中高表達(dá)。HMGCR 被認(rèn)為是MVA 途徑的 關(guān) 鍵 酶 ，共 鑒 定 到 1 個(gè)HMGCR（Cluster-57284.59325），其高表達(dá)出現(xiàn)在高海拔花（HF）、低海拔葉（LL）和莖（LS）中。

在參與下游倍半萜合成途徑中，1 個(gè)法尼基焦磷酸 合 酶 基 因（farnesyl diphosphate synthase,FPDS）（Cluster-57284.14260）和 5 個(gè)大根香葉烯 D 合成酶基因（(- ) -germacrene D synthase,GERD）（Cluster-15127.0， Cluster-43118.0， Cluster-57284.51368，Cluster-57284.57852和Cluster-57284.7379）均在低海拔 莖（LS）中 表 達(dá) 量 最 高 。 2 個(gè)GERD（Cluster-57284.7713和Cluster-57284.86323）均 在 低 海 拔 葉（LL）中表達(dá)量最高。在參與單萜合成途徑中，2 個(gè)新薄荷醇脫氫酶基因（(+)-neomenthol dehydrogenase,NADP）（Cluster-57284.40061和Cluster-57284.48736）顯示在高海拔葉（HL）中表達(dá)量最高，而另外1 個(gè)NADP（Cluster-57284.48039）和1個(gè)香葉基二磷酸二磷酸 酶 基 因（geranyl diphosphate diphosphatase,GES）（Cluster-57284.30744）均在高海拔莖（HS）中表達(dá)量最高（圖5）。

圖5 萜類生物合成途徑

3 討論

神農(nóng)香菊自然分布于海拔2,000 米以上的高海拔生境，常年霧多風(fēng)大，空氣濕度大，日照短而強(qiáng)烈、常年處于低溫環(huán)境，導(dǎo)致其植株偏小和全株濃郁的香氣品質(zhì)。海拔相關(guān)的生態(tài)因子如溫度、降水等會(huì)影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及次生代謝物的積累，而高山植物對(duì)環(huán)境變化尤其敏感[24]，適宜在低溫環(huán)境下生長(zhǎng)的植物更容易受到溫度升高的影響[25]。已有研究表明，低溫會(huì)限制高海拔植物的生長(zhǎng)繁殖[26]，同時(shí)氣候變暖在一定范圍內(nèi)也會(huì)刺激適宜在低溫環(huán)境下生長(zhǎng)的植物的生長(zhǎng)和繁殖，但并不會(huì)促進(jìn)其開花，而隨著氣候變暖的加劇和環(huán)境溫度的持續(xù)升高，反而會(huì)抑制其生長(zhǎng)[27]。這與前人開展的神農(nóng)香菊引種試驗(yàn)相似，神農(nóng)香菊從生境地引種到低海拔區(qū)域，其生長(zhǎng)發(fā)育及揮發(fā)性香氣均受到影響[7-8]。本文的生態(tài)因子分析表明，不同海拔分布點(diǎn)間溫度的差異是主要環(huán)境因子（圖1）。自然分布在高海拔如神農(nóng)頂、天門埡等的神農(nóng)香菊長(zhǎng)期適應(yīng)環(huán)境低溫，而當(dāng)神農(nóng)香菊被移栽到低海拔種植點(diǎn)如宋洛后，相比高海拔移栽點(diǎn)黃龍堰，其受到溫度的影響更強(qiáng)烈，從而導(dǎo)致宋洛生境的神農(nóng)香菊的生長(zhǎng)發(fā)育受到更大影響，相關(guān)的香氣成分的積累也發(fā)生顯著變化。除了溫度之外，其他環(huán)境因子如降水和光照等也可能部分影響了移栽神農(nóng)香菊的生長(zhǎng)發(fā)育。如先前研究表明，降水量的變化對(duì)植物的物種豐富度、植被覆蓋率以及生長(zhǎng)高度具有顯著影響，降水量減少會(huì)抑制植物的生長(zhǎng)，降水量增加在一定程度會(huì)促進(jìn)植物的生長(zhǎng)以及生物量的積累[28]。不同波長(zhǎng)以及強(qiáng)度的光照是植物光合作用必不可少的非生物因素，過度的光照可能使葉綠體的光合反應(yīng)中心失活或受損，引起光抑制，也可能降低植物的生長(zhǎng)[29-30]，然而光照不足同樣也會(huì)影響植物的生長(zhǎng)[31]。

對(duì)于非模式植物，從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定與次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑相關(guān)的基因是一種便利的方法。在本研究中，從18個(gè)神農(nóng)香菊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共鑒定到695,919個(gè)表達(dá)基因，其中在不同海拔種植區(qū)同一組織樣本之間共篩選得到13,431 個(gè)差異表達(dá)基因。兩兩比較進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，低海拔莖和葉樣品中上調(diào)表達(dá)的基因數(shù)相較高海拔莖和葉樣品更多，而高海拔花中上調(diào)表達(dá)的基因數(shù)高于低海拔花（HL vs LL：1,967 個(gè)上調(diào)/6,070 個(gè)下調(diào)；HS vs LS：3,925 個(gè)上調(diào)/ 2,214 個(gè)下調(diào)；HF vs LF：802 個(gè)上調(diào)/526 個(gè)下調(diào)）。差異基因富集分析得到的通路主要包括生長(zhǎng)發(fā)育及次生代謝相關(guān)途徑，如植物激素信號(hào)傳導(dǎo)、光合作用生物的碳固定作用、萜類生物合成、苯丙素生物合成、脂肪酸生物合成及黃酮類化合物生物合成等。植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在植物生長(zhǎng)發(fā)育及響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮重要作用，當(dāng)植物體處于逆境中，可通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種分子機(jī)制調(diào)控自身代謝和生理活動(dòng)響應(yīng)脅迫從而維持生命活動(dòng)的進(jìn)行[32-33]。次生代謝物的產(chǎn)生和積累可有效幫助植物體適應(yīng)環(huán)境變化并抵御脅迫[34-38]。這提示神農(nóng)香菊可能通過調(diào)節(jié)參與復(fù)雜生理生化過程的基因差異表達(dá)，從而適應(yīng)高海拔生境并響應(yīng)生境改變而產(chǎn)生的非生物脅迫。

在低海拔區(qū)域引種擴(kuò)繁神農(nóng)香菊，在保證其正常發(fā)育的情況下保留濃郁香氣品質(zhì)，是神農(nóng)香菊資源量擴(kuò)大和新品種培育的重要目標(biāo)之一。萜烯類物質(zhì)是植物產(chǎn)生的化合物中最為豐富的一類，不僅參與非生物脅迫的響應(yīng)，同時(shí)也是神農(nóng)香菊揮發(fā)性香氣中的重要組成部分。前人研究發(fā)現(xiàn)，生境改變后會(huì)引起(z)-B-金合歡烯、大根香葉烯D、芳樟醇等萜烯類物質(zhì)的含量變化[8]。為此，本研究從不同生境神農(nóng)香菊轉(zhuǎn)錄組樣本中進(jìn)一步挖掘參與萜烯類生物合成途徑相關(guān)酶基因。結(jié)果共篩選得到30 個(gè)差異表達(dá)基因參與萜類生物合成。DXS、HDR及DXR已被證實(shí)是 MEP 途徑中的關(guān)鍵酶，HMGCR是MVA 途徑上的關(guān)鍵酶[39-41]。DXS、DXR已被證明能提高植物對(duì)非生物以及生物脅迫的耐受性[42]，HMGCR也被證實(shí)在植物生長(zhǎng)發(fā)育和應(yīng)對(duì)各種環(huán)境脅迫方面起著重要作用[43-44]。本研究共挖掘到 5 個(gè)DXS，1 個(gè)DXR和 1 個(gè)HMGCR，其中 2 個(gè)個(gè)DXS（Cluster-57284.37357、Cluster-57284.45777）、2 個(gè)NADP（Cluster-57284.40061和Cluster-57284.48736）和1 個(gè)GES（Cluster-57284.30744）基因在高海拔組織中上調(diào)表達(dá)，這與前人研究發(fā)現(xiàn)的樟腦、β-蒎烯、1-甲基-4-(1-乙酰氧基-1-甲基乙基)-環(huán)已-2-烯醇等物質(zhì)因生境改變導(dǎo)致的含量變化趨勢(shì)一致；相反，多個(gè)差異表達(dá)基因在低海拔組織樣品中上調(diào)表達(dá)，包括3個(gè) DXS（Cluster-57284.33469 和 Cluster-57284.69971和 Cluster-57284.53950） 、 1 個(gè) DXR （Cluster-57284.49820）、3 個(gè)ACAT（Cluster-31241.0，Cluster-32214.1和Cluster-4297.0）、1 個(gè)HMGCS（Cluster-57284.909）、1個(gè)FPDS（Cluster-57284.14260）、7個(gè)GERD（Cluster-15127.0，Cluster-43118.0，Cluster-57284.51368，Cluster-57284.57852、Cluster-57284.7379、Cluster-57284.7713和Cluster-57284.86323）均在低海拔組織樣品中表達(dá)量最高，這與前人研究發(fā)現(xiàn)的月桂烯、環(huán)氧芳樟醇、(z)-B-金合歡烯等物質(zhì)因生境改變導(dǎo)致的含量變化趨勢(shì)一致，表明這些基因可能在神農(nóng)香菊香氣成分合成中發(fā)揮重要的作用，并通過基因表達(dá)量的變化促進(jìn)代謝物的積累以適應(yīng)不同生境。

萜類化合物是植物產(chǎn)生的無數(shù)化合物中最大和最多樣化的化學(xué)物質(zhì)類別，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及環(huán)境適應(yīng)過程中具有重要的保護(hù)作用[45]，馬銀花作為在低海拔適應(yīng)性廣的杜鵑栽培種，基因組中含有比高海拔杜鵑栽培種更多的萜類合酶基因，這些基因參與了倍半萜以及單萜的生物合成，對(duì)馬銀花更好地適應(yīng)低海拔環(huán)境具有重要作用[46]。雞爪槭中單萜類物質(zhì)的排放量隨著海拔降低，溫度升高而升高[47]?；诃h(huán)境溫度變化，根據(jù)物種不同，平均環(huán)境溫度升高1℃，花中萜烯的釋放速率會(huì)增加0.03-1.4倍以對(duì)應(yīng)環(huán)境溫度升高的影響[48]。葡萄中的單萜類物質(zhì)的積累與光照有關(guān)，這與葡萄中VvDXS2和VvDXR基因在不同陽(yáng)光照射下的表達(dá)量有關(guān)[49]。這提示神農(nóng)香菊在低海拔受到了溫度以及光照的影響，促進(jìn)萜類物質(zhì)的產(chǎn)生以適應(yīng)從高海拔移植到低海后的環(huán)境變化。

4 結(jié)語(yǔ)

神農(nóng)香菊作為一種應(yīng)用廣泛的高山香料植物，其生長(zhǎng)發(fā)育以及次生代謝物的積累極易受到環(huán)境的影響。基于生態(tài)因子調(diào)查發(fā)現(xiàn)，神農(nóng)香菊可能更容易受到環(huán)境溫度與光照的影響。對(duì)不同海拔神農(nóng)香菊轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因主要富集在次生物生物合成途徑如：萜類、苯丙素類、黃酮類、脂肪酸以及不飽和脂肪酸類。除此之外，差異表達(dá)基因也較多富集在植物激素信號(hào)傳導(dǎo)、光合作用生物的碳固定作用、晝夜節(jié)律-植物和光合作用等途徑中，大多差異基因在宋洛神農(nóng)香菊樣本中表達(dá)量較高，可能是由于神農(nóng)香菊種植在低海拔區(qū)域，受到溫度、光照等脅迫而誘導(dǎo)了相關(guān)基因的表達(dá)，以幫助神農(nóng)香菊抵御環(huán)境脅迫。綜上，本研究發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)基因涉及的復(fù)雜生理生化過程及代謝通路，進(jìn)而形成神農(nóng)香菊響應(yīng)高海拔環(huán)境和生境變化的適應(yīng)策略，其分子調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步探索，本研究為深入研究神農(nóng)香菊不同海拔適應(yīng)機(jī)制及新品種培育提供數(shù)據(jù)支撐。