面向隱結(jié)構(gòu)模型和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討“調(diào)肝守恒、化濁解毒”治療慢性胃炎的潛在生物學(xué)機(jī)制＊

徐偉超 ，李博林 ，賈文文 ，李佃貴 ，劉建平 ，郎曉猛 ，杜 姚 ，才艷茹 ，杜朋麗 ，趙丹陽 ，楊 倩 ＊＊

（1. 河北省中醫(yī)院 石家莊 050011；2. 河北省中西醫(yī)結(jié)合胃腸病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 石家莊 050011）

慢性胃炎患者多數(shù)并無癥狀，難以獲得精準(zhǔn)、確切流行病學(xué)資料，目前我國基于內(nèi)鏡診斷的慢性胃炎患病率已接近90%，推測(cè)患者數(shù)以億計(jì)[1]。慢性胃炎患者的胃癌、腸道腫瘤、胰腺癌患病率均較一般人群增高，具有較高癌變風(fēng)險(xiǎn)[2]。慢性胃炎伴上皮內(nèi)瘤變是其典型代表，癌變率達(dá)0.25%-6%[3]，成為危害我國人民身體健康和降低生活質(zhì)量的主要慢性疾病之一。幾千年臨床實(shí)踐證明，運(yùn)用祖國醫(yī)學(xué)“人病共存”“以平為期”先進(jìn)理念與方法學(xué)治療慢性疾病優(yōu)勢(shì)明顯。慢性胃炎多歸屬于中醫(yī)“胃痛”“胃痞”“吐酸”“嘈雜”等范疇，以癥狀診斷命名，分為本虛、標(biāo)實(shí)兩種病機(jī)，多從氣機(jī)、濕熱、氣虛、陰虛、瘀血等方面論治，形成了諸多名老中醫(yī)特色用藥與診療經(jīng)驗(yàn)[4]，如何正確詮釋名老中醫(yī)治療經(jīng)驗(yàn)，快速、有效明確慢性胃炎中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及可能靶點(diǎn)，成為中醫(yī)藥有效治療慢性胃炎亟待解決的科學(xué)問題之一。

作為數(shù)據(jù)分析的經(jīng)典方法之一，隱結(jié)構(gòu)模型在中醫(yī)臨證梳理中具有重要的數(shù)據(jù)量化與詮釋作用，有廣闊的應(yīng)用前景[5]。團(tuán)隊(duì)前期運(yùn)用隱結(jié)構(gòu)模型分析方法（圖1），詮釋研究團(tuán)隊(duì)“調(diào)肝守恒”治法，方證結(jié)合：香附、白芍、川芎、延胡索、黃連、白術(shù)、豆蔻、藿香、半枝蓮、白花蛇舌草等組成，具有調(diào)肝守恒、化濁解毒之功，用于胃脘痞悶、疼痛、噯氣、納呆、口干口苦、大便粘膩不爽等。團(tuán)隊(duì)前期基礎(chǔ)已證實(shí)，該治法組方對(duì)多種脾胃疾病具有很好的臨床療效[6-7]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)集合整體、動(dòng)態(tài)、分析于一體，是融合系統(tǒng)生物學(xué)、藥理學(xué)、中藥藥理學(xué)、分子生物學(xué)、計(jì)算機(jī)學(xué)為一體的新興交叉學(xué)科，可構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”多層生物信息網(wǎng)絡(luò)，揭示疾病-藥物隱性關(guān)系。對(duì)于中藥復(fù)方可提供多層次、多成分、多靶點(diǎn)的研究視角，為中醫(yī)藥經(jīng)驗(yàn)醫(yī)學(xué)的可視化、數(shù)據(jù)化研究提供方法學(xué)支持[8-9]?！罢{(diào)肝守恒”治法作為面向隱結(jié)構(gòu)模型挖掘結(jié)合名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)詮釋的創(chuàng)新治法，目前還未見到相關(guān)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究報(bào)道。如何從大規(guī)模、復(fù)雜的多維臨床數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)較優(yōu)的中醫(yī)治療方劑，并分析方劑可能的作用機(jī)制，成為臨床策略形成與驗(yàn)證的重要課題，也是辨證論治臨床評(píng)價(jià)研究的關(guān)鍵問題。隱結(jié)構(gòu)模型和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的結(jié)合，可以較好地模擬、優(yōu)化、驗(yàn)證中醫(yī)治療方劑，提高臨證經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析詮釋準(zhǔn)確性。本研究采用隱結(jié)構(gòu)模型詮釋名老中醫(yī)思維決策，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)搜索“調(diào)肝守恒”治法化合物和靶標(biāo)蛋白，構(gòu)建與分析靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)，篩選核心靶標(biāo)，進(jìn)行功能富集，探討創(chuàng)新治法防治慢性胃炎潛在分子機(jī)制，以期為“調(diào)肝守恒-慢性胃炎”的臨床評(píng)定實(shí)踐提供部分可視化數(shù)據(jù)支持，研究方案見圖2。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.1.1 組方有效成分的篩選

根據(jù)調(diào)肝守恒處方組成與《中國藥典》2015 版[10]的藥物規(guī)范名稱，由香附（CYPERI RHIZOMA）、白芍（PAEONIAE RADIX ALBA）、川 芎（CHUANXIONG RHIZOMA）、延胡索（CORYDALIS RHIZOMA）、黃連（COPTIDIS RHIZOMA） 、白 術(shù) （ATRACTYLODIS MACROCEPHALAE RHIZOMA） 、 豆 蔻 （AMOMI FRUCTUS ROTUNDUS）、藿 香（POGOSTEMONIS HERBA） 、半 枝 蓮 （SCUTELLARIAE BARBATAE HERBA）、白花蛇舌草（HEDYOTIS DIFFUSA WILLD）、三七（NOTOGINSENG RADIX ET RHIZOMA）、茯苓（PORIA）、百合（LILII BULBUS）、枳實(shí)（AURANTIIFRUCTUS IMMATURUS） 、木 香 （AUCKLANDIAE RADIX）、砂仁（AMOMI FRUCTUS）組成。檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫（http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）[11]收集組方主要化學(xué)成分。按照口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18，藥物半衰期（HL）≥8（百合和砂仁為≥6）為條件從上述數(shù)據(jù)庫中篩選出具有較高活性且可能入血的成分。

1.1.2 組方有效成分靶點(diǎn)的收集

利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫中的Related Targets 預(yù)測(cè)成分相關(guān)靶點(diǎn)；通過UniProt 數(shù)據(jù)庫[12]（https://www.uniprot.org/）預(yù)處理靶點(diǎn)名稱，得到最終中藥活性成分相關(guān)靶點(diǎn)。

1.1.3 慢性胃炎相關(guān)靶點(diǎn)獲取

利用GeneCards 數(shù)據(jù)庫[13]（https://www.GeneCards.org/）對(duì)慢性胃炎相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行篩選。應(yīng)用Uniprot 數(shù)據(jù)庫對(duì)疾病靶點(diǎn)進(jìn)行靶點(diǎn)-人類基因名轉(zhuǎn)換后將組方主要活性成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與慢性胃炎相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行交集并繪制韋恩圖，提取共同的靶基因。

但，在今天，傳統(tǒng)文化也許被很多人所遺忘。試問，如今聽說評(píng)書的人有多少？學(xué)習(xí)傳統(tǒng)戲曲的又有多少？隨著一代又一代大師的離去，真正懂這些的人還有多少？是的，正因如此，人們才會(huì)有著再無“且聽下回分解”的遺憾。

1.1.4 中藥-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

為了更清晰的展現(xiàn)藥物-成分-疾病靶點(diǎn)之間的關(guān)系，運(yùn)用Cytoscape 軟件[14]構(gòu)建“中藥-活性成分-疾病靶點(diǎn)”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖。在網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點(diǎn)表示中藥、活性成分、疾病靶點(diǎn)。邊則代表了中藥、活性成分、疾病靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系。節(jié)點(diǎn)的重要程度根據(jù)自由度（Degree）進(jìn)行分析。

1.1.5 靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

利用String 在線數(shù)據(jù)庫[15]（https://String-db.org/）分析靶點(diǎn)的蛋白間相互作用（protein protein interaction，PPI），靶點(diǎn)信息錄入數(shù)據(jù)庫，物種選擇“Homo sapiens”，篩選蛋白互作綜合得分＞0.4作為篩選條件得到PPI 信息，將信息導(dǎo)入Cytoscape 軟件，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，根?jù)Degree的數(shù)值，篩選出核心靶基因。

1.1.6 生物功能注釋（GO）基因分析與基因組百科全書（KEGG）代謝通路富集分析

利用Cytoscape 軟件Clue GO 插件對(duì)作用靶點(diǎn)進(jìn)行 GO 和 KEGG 富集分析，保留P≤0.05 結(jié)果，得到可視化圖片。

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)

2.1.1 組方中藥活性成分篩選

基于OB≥30%，DL≥0.18，HL≥8（百合、砂仁為HL≥6）作為條件對(duì)方中藥物進(jìn)行活性成分篩選，得到59個(gè)活性成分。

2.1.2 組方中藥活性成分篩選慢性胃炎相關(guān)靶點(diǎn)

從TCMSP 數(shù)據(jù)庫中的Related Targets 預(yù)測(cè)得到232 個(gè)成分相關(guān)靶點(diǎn)，從GeneCards 數(shù)據(jù)庫中檢索“慢性胃炎”相關(guān)靶點(diǎn)，得到1139 個(gè)疾病相關(guān)靶點(diǎn)。然后將232 個(gè)成分靶點(diǎn)與1139 個(gè)慢性胃炎靶點(diǎn)進(jìn)行韋恩圖繪制（圖3）；計(jì)中和靶點(diǎn)101個(gè)。

圖3 組方與慢性胃炎重合的靶點(diǎn)韋恩圖

2.1.3 藥物活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)建立、分析

根據(jù)藥物中篩選的活性成分和作用于疾病的相關(guān)靶點(diǎn)，利用Cytoscape 軟件構(gòu)建藥物活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，紅色代表基因，用不同顏色表示該成分來源自某一種藥物，例如黃色表示來自黃連、粉色表示來自白術(shù)、綠色表示枳實(shí)等，經(jīng)過數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)茯苓、延胡索、百合三種藥物的成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)與疾病無交集，所以在成分和靶點(diǎn)圖中沒有上述三種藥物（圖4）。藥物活性成分中“Degree”值排前7 的分別是：槲皮素（Quercetin，MOL00098）、木 犀 草 素（Luteolin，MOL000006）、山柰酚（Kaempferol，MOL000422）、漢黃芩 素（Wogonin，MOL000173）、黃 芩 素（Baicalein，MOL002714）、川陳皮素（Nobiletin，MOL005828）、柚皮素（Naringenin，MOL004328）。

圖4 組方活性成分-靶點(diǎn)圖

2.1.4 靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)分析及關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選

基于String在線數(shù)據(jù)平臺(tái)上輸入疾病-處方101個(gè)中和靶點(diǎn)，分析后得到PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（圖5）。圖中含有101個(gè)靶蛋白和1783條互作邊。推測(cè)組方治療慢性胃炎可能與蛋白激酶B1（AKT1）、絲裂原活化蛋白激酶1/3（MAPK1/3）等靶標(biāo)有關(guān)。

圖5 組方與慢性胃炎蛋白質(zhì)相互作用核心網(wǎng)絡(luò)圖

2.1.5 作用靶點(diǎn)的GO富集分析

作用靶點(diǎn)的GO（Gene Ontology）富集分析包含生物過程（Biological Process，BP）、細(xì)胞組成（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）。利用Cytoscape 軟件中的ClueGO 插件對(duì)101 個(gè)共同作用靶蛋白進(jìn)行GO 生物功能注釋，根據(jù)保留P≤0.05 的結(jié)果，并分別對(duì)前20 個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化分析，得到（BP,CC,MF）柱狀圖，其中縱坐標(biāo)表示富集條目，橫坐標(biāo)表示富集個(gè)數(shù)（圖6～圖8）。圖6 顯示疾病-處方共同作用靶點(diǎn)在BP 中，主要富集條目為對(duì)金屬離子的反應(yīng)（response to metal ion）、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)（response to oxidative stress）、脂多糖應(yīng)答（response to lipopolysaccharide）、對(duì)細(xì)菌來源分子的反應(yīng)（response to molecule of bacterial origin）及對(duì)抗生素的反應(yīng)（response to antibiotic）等。圖7 顯示示疾病-處方共同作用靶點(diǎn)在CC 中，主要富集條目為囊腔（vesicle lumen）、分泌顆粒腔（secretory granule lumen）、細(xì)胞質(zhì)囊 腔（cytoplasmic vesicle lumen）、膜 筏（membrane raft）、膜微區(qū)（membrane microdomain）等。圖8 顯示疾病-處方共同作用靶點(diǎn)在MF 中，主要富集條目為磷酸酶結(jié)合（phosphatase binding）、蛋白磷酸酶結(jié)合（protein phosphatase binding）、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合（ubiquitin-like protein ligase binding）、抗氧化活性（antioxidant activity）、支架蛋白結(jié)合（scaffold protein binding）等。

圖6 組方主要作用靶點(diǎn)的BP柱狀圖

圖7 組方主要作用靶點(diǎn)CC柱狀圖

圖8 組方主要作用靶點(diǎn)MF柱狀圖

2.1.6 KEGG通路富集分析

將得到的通路條目、靶點(diǎn)信息導(dǎo)入Cytoscape 軟件，繪制得到靶點(diǎn)-通路圖（圖9）。其中紅色代表通路，綠色代表靶點(diǎn)，形狀越大代表富集越顯著。MAPK信號(hào)通路、AKT 信號(hào)通路等與組方治療慢性胃炎的潛在靶標(biāo)密切相關(guān)，體現(xiàn)了組方多成分、多靶點(diǎn)多通路對(duì)慢性胃炎起到綜合治療作用。

圖9 組方作用靶點(diǎn)-通路圖

3 討論

我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)運(yùn)用多種中醫(yī)治法能改善慢性胃炎中醫(yī)證候療效，提高患者生活質(zhì)量，影響血清腫瘤特異性生長因子、胃癌單抗MG7 相關(guān)抗原，降低血清炎癥因子水平[16，17]，但中藥復(fù)方藥物眾多，成分復(fù)雜，效用協(xié)同，分子機(jī)制并未闡明，故研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)驗(yàn)方作用機(jī)制進(jìn)行探索性研究，結(jié)論如下：

3.1 主要成分分析

篩選出組方59 種主要活性成分和101 個(gè)成分靶點(diǎn)。最主要的活性成分為槲皮素（Quercetin，QT）、木犀草素（Luteolin，Lut）、山柰酚（Kaempferol，Kae）、漢黃芩 素（Wogonin）、黃 芩 素（Baicalein）、川 陳 皮 素（Nobiletin）、柚皮素（Naringenin）。QT 作為一種天然飲食類黃酮，富含于絕大多數(shù)植物類中藥中，具有明顯的抗氧化、抗炎作用[18]。有研究者發(fā)現(xiàn)，QT 可通過c-Jun/ATF2/Bcl-x L 途徑增強(qiáng)5-氟尿嘧啶對(duì)胃癌細(xì)胞線粒體途徑凋亡的誘導(dǎo)活性[19]。Lut 是主要存在于中藥中的天然黃酮類化合物，有一定的免疫調(diào)節(jié)、抗癌、抗氧化作用[20]，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Lut可通過HIF-1α抗胃癌細(xì)胞增殖和遷移[21]。Kae 是一種富含在化濕類中藥中的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗病毒等功效[22]，有研究者發(fā)現(xiàn)，Kae 通過激活I(lǐng)RE1-JNK-CHOP 信號(hào)通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬[23]。漢黃芩素具有抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)、抗病毒、抗炎、抗氧化等藥理活性[24]，研究表明其可能是通過抑制SGC-7901、ECV304 細(xì)胞不同能量代謝酶活力，減少ATP 生成，改善細(xì)胞酸性微環(huán)境，抑制胃癌細(xì)胞增殖和腫瘤血管生成發(fā)揮抑癌作用[25]。除此之外，研究證實(shí)黃芩素、川陳皮素和柚皮素對(duì)人胃癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖抑制作用[26-28]。

3.2 主要靶標(biāo)與通路分析

在GO 功能分析中發(fā)現(xiàn)組方對(duì)金屬離子的反應(yīng)、氧化應(yīng)激的反應(yīng)、脂多糖應(yīng)答過程的積極調(diào)節(jié)作用；通過靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)分析及關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選，發(fā)現(xiàn)度值較高的靶點(diǎn)為MAPK1/3、AKT1、Bcl、IL、BAD、IKBKB、NFKBIA、JUN、CASP9 等，從不同方面與炎癥反應(yīng)存在一定關(guān)系，且與其他中藥復(fù)方治療慢性胃炎報(bào)道關(guān)鍵靶點(diǎn)吻合。研究表明，AKT/MAPK 途徑是保護(hù)胃黏膜的重要潛在機(jī)制，對(duì)消化道炎-癌轉(zhuǎn)化進(jìn)展至關(guān)重要[29,30]。目前證據(jù)證實(shí)，MAPK1/3 等可以通過促炎反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞變異[31]，AKT1 是PI3K 的靶向基因，活性成分可通過AKT1 途徑增強(qiáng)胃癌細(xì)胞體外增殖及侵襲力，進(jìn)一步證實(shí)AKT1 在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中的潛在作用[32]?？梢灶A(yù)測(cè)：組方活性成分 QT、Lut、Kae、Wogonin 等可能作用于 MAPK、AKT、Bcl 而發(fā)揮藥理作用。

在KEGG 道路分析中發(fā)現(xiàn)MAPK 信號(hào)通路、PI3K/AKT 信號(hào)通路等多條信號(hào)轉(zhuǎn)錄通路通過實(shí)驗(yàn)研究與炎-癌轉(zhuǎn)化關(guān)系密切。其中，MAPK通路上游的許多因子，如RASAL1、白介素-22（IL-22）、CCDC134、NAIF1、ZIC1等，可能通過ERK/MAPK 通路影響胃癌細(xì)胞系的增殖、侵襲和遷移[33]。此外，PI3K/AKT 信號(hào)通路不僅調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖與活化，還影響腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移、細(xì)胞外基質(zhì)的降解以及腫瘤血管生成等[34]。

3.3 展望

綜上所述，本研究面向隱結(jié)構(gòu)模型和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討“調(diào)肝守恒”治療慢性胃炎的潛在生物學(xué)機(jī)制，候選成分中QT、Lut、Kae 可能是組方發(fā)揮作用的關(guān)鍵成分，交集基因富集于MAPK 信號(hào)通路、PI3K/AKT 信號(hào)通路等經(jīng)典炎癥-腫瘤信號(hào)通路發(fā)揮作用。鑒于方法學(xué)局限性，對(duì)疾病發(fā)生、發(fā)展、傳變?nèi)杂兄T多不明，后期對(duì)治法、組方活性成分、作用靶點(diǎn)、作用通路、治療效果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室與臨床驗(yàn)證以及知識(shí)產(chǎn)權(quán)轉(zhuǎn)化，是課題組下一步工作重點(diǎn)。