基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的柴胡疏肝散及成分治療肝癌的分子靶點(diǎn)和療效預(yù)測＊

張澤鑫，陳祎琦，吳汶豐，黃子怡，林思其，方舒涵，林麗珠，鐘 崇，李 菁

（1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 廣州 510405；2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 廣州 510405；3. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 廣州 510405；4. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 長沙 410000）

肝癌是目前威脅人類生命健康的惡性疾病之一。根據(jù)病理類型可分為肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC） 、肝 內(nèi) 膽 管 癌 （intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）以及混合型癌[1-2]。其中肝細(xì)胞癌約占原發(fā)性肝癌的80%[3]（以下簡稱肝癌）。《2020全球癌癥報告》顯示，肝癌在我國發(fā)病數(shù)達(dá)41萬，約占全國癌癥發(fā)病數(shù)的9%。死亡人數(shù)約為39.1 萬，為癌癥死亡原因的第二位[4]。由于惡性程度高、早期診斷困難、進(jìn)展隱匿、高復(fù)發(fā)率等因素，肝癌患者總體預(yù)后不理想[5-6]。因此，尋找更佳的治療手段及建立預(yù)后評價模型具有重要臨床價值。

肝癌歸屬于中醫(yī)的“癥瘕”“肥氣”“積聚”等范疇[7-9]，中醫(yī)認(rèn)為肝性喜調(diào)達(dá)惡抑郁。肝失疏泄，臟腑失調(diào)，氣滯血瘀，濕熱等病理產(chǎn)物蘊(yùn)結(jié)，漸而成積[10,11]。柴胡疏肝散是疏肝解郁的代表方，其藥物組成包括柴胡、芍藥、香附、川芎、陳皮、枳殼、甘草，諸藥共奏疏肝解郁，活血止痛之功[12-13]。有研究發(fā)現(xiàn)，柴胡疏肝散聯(lián)合分子靶向藥可以有效避免肝癌腫瘤的進(jìn)展和對肝臟的損傷[14]。在肝纖維化方面，尚立芝等進(jìn)行大鼠模型實驗，發(fā)現(xiàn)柴胡疏肝散具有抗肝纖維化的作用[15-16]。然而，目前對于柴胡疏肝散治療肝癌的分子靶點(diǎn)和機(jī)制仍然需要進(jìn)一步研究。

生物信息學(xué)分析用于研究腫瘤的基因表達(dá)及作用通路，有助于揭示疾病發(fā)生機(jī)制及篩選潛在生物標(biāo)志物[17-18]。加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，能通過構(gòu)建基因網(wǎng)絡(luò)以實現(xiàn)基因網(wǎng)絡(luò)的可視化，挖掘高度相關(guān)的基因模塊[19-20]。結(jié)合差異基因表達(dá)分析，可以揭示特定疾病的潛在生物標(biāo)志物[21]。而一致性聚類分析可以將基因根據(jù)組學(xué)特點(diǎn)分為不同亞型，評估不同亞型的分析結(jié)果[22]。因此，通過結(jié)合加權(quán)共表達(dá)分析、差異表達(dá)分析和一致性聚類分析結(jié)果，能夠多維度識別與疾病發(fā)生發(fā)展高度相關(guān)的基因。

此外，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能夠揭示與疾病密切相關(guān)的分子靶點(diǎn)[23]，而在此基礎(chǔ)上的分子對接方法基于計算機(jī)技術(shù)分析分子間相互作用，預(yù)測其結(jié)合模式及親和力，在分子層面推動疾病基因與藥物靶點(diǎn)的研究[24-25]。

因此，本研究結(jié)合了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對接和生物信息學(xué)，篩選柴胡疏肝散治療肝癌的核心靶點(diǎn)并研究其相關(guān)機(jī)制，構(gòu)建預(yù)后評估模型和列線圖，用以評估患者的總體生存情況。

1 材料與方法

1.1 核心靶點(diǎn)的篩選、驗證

1.1.1 TCGA肝癌差異表達(dá)基因的鑒定

從 TCGA 數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）下載了TCGA-LIHC 的表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)。進(jìn)一步地根據(jù)log|FC|＞1，校正P值＜0.05的標(biāo)準(zhǔn)，對正常肝組織和腫瘤組織進(jìn)行差異表達(dá)分析，以篩選出肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)差異表達(dá)基因。

1.1.2 TCGA肝癌加權(quán)共表達(dá)分析

通過R 語言4.0.1 的WGCNA 包，將基因表達(dá)和疾病特征進(jìn)行了聯(lián)合分析，將疾病特征定義為正常組和腫瘤組。在本研究中，根據(jù)軟閾值β= 3，我們建立了無標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)。通過公式AIJ=|SIJ|β（AIJ：基因I 與基因J之間的鄰接矩陣，SIJ：通過所有基因?qū)Φ钠栠d相關(guān)性獲得的相似性矩陣，β：軟閾值），并轉(zhuǎn)換為拓?fù)渲丿B矩陣（TOM）及其相關(guān)的相似度（1-tom）。為了將相似的表達(dá)基因分為不同的共表達(dá)模塊，構(gòu)建了1-tom矩陣的層次聚類樹。

1.1.3 GEO-GSE14502一致性聚類分析

從 GEO 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載了GSE14502 的芯片數(shù)據(jù)和GPL571 平臺數(shù)據(jù)，使用perl語言對其進(jìn)行基因符號注釋。一致性聚類分析根據(jù)基因之間的不同功能，劃分成不同的聚類模塊。在本研究中，R 語言 4.0.1 的“ConsensusClusterPlus”包被應(yīng)用于該分析。根據(jù)一致性打分結(jié)果，確定了2 個聚類模塊，并且將其與正常組織之間進(jìn)行了差異表達(dá)分析。

1.1.4 肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因的鑒定

為了明確參與肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因，使用R 語言4.0.1 的韋恩圖包，對差異表達(dá)基因、加權(quán)共表達(dá)基因（顯著性水平：P值排名靠前的3 個模塊）、一致性聚類分析模塊與正常組織的差異表達(dá)基因進(jìn)行取交集，以獲得肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因。

1.1.5 柴胡疏肝散化合物和靶點(diǎn)的鑒定

根據(jù)口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）＞30%，類藥性( Drug Like，DL)＞0.18 的標(biāo)準(zhǔn)，從 TCMSP數(shù)據(jù)庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php）和 SymMap 數(shù)據(jù)庫（http://www.symmap.org/）下載柴胡疏肝散（柴胡、白芍、川芎、枳殼、陳皮、甘草、香附）的化合物和靶點(diǎn)，使用perl 語言進(jìn)行化合物和靶點(diǎn)之間的相互映射，以明確其對應(yīng)關(guān)系。

1.1.6 柴胡疏肝散治療肝細(xì)胞癌的靶點(diǎn)鑒定

為了鑒定參與肝細(xì)胞癌治療的靶點(diǎn)，我們使用R語言4.0.1 的韋恩圖包，對1.1.5.中柴胡疏肝散的所有藥物靶點(diǎn)和肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因進(jìn)行取交集，以獲得柴胡疏肝散治療肝細(xì)胞癌的靶點(diǎn)。

1.1.7 柴胡疏肝散治療肝細(xì)胞癌的GO 和KEGG 功能富集分析

為了進(jìn)一步了解柴胡疏肝散治療肝細(xì)胞癌涉及的生物學(xué)功能和通路，使用在線的metascape 數(shù)據(jù)庫（http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）進(jìn) 行GO和KEGG功能富集分析。在本研究中，設(shè)定分析的物種為“智人”，顯著性水平P值＜0.05。

1.1.8 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)篩選核心靶點(diǎn)

為了了解柴胡疏肝散治療肝細(xì)胞癌的核心靶點(diǎn)，使用在線的metascape 數(shù)據(jù)庫（http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）構(gòu)建PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)核心靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系以及功能聚類，PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)將劃分為不同的模塊進(jìn)行展示。

1.1.9 疾病-藥物-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)篩選核心靶點(diǎn)

為了明確柴胡疏肝散治療肝細(xì)胞癌的主要化合物和核心靶點(diǎn)，使用cytoscape3.7.2 軟件構(gòu)建疾病-藥物-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。在本研究中，篩選出了具有靶點(diǎn)作用數(shù)目排名前3 的化合物，被認(rèn)為是治療肝細(xì)胞癌的主要化合物。篩選出了具有化合物作用數(shù)目排名前10的靶點(diǎn)，被認(rèn)為是核心靶點(diǎn)。

1.1.10 柴胡疏肝散治療肝癌“病-癥-方/藥”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

為了構(gòu)建肝郁氣滯型肝癌“病-證-方/藥”網(wǎng)絡(luò)，我們在SymMap 數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)入了柴胡疏肝散治療肝癌的化合物或靶點(diǎn)，并且保留疾病-藥物-化合物-中醫(yī)癥狀-現(xiàn)代醫(yī)學(xué)癥狀均有對應(yīng)關(guān)系的點(diǎn)，然后使用cytoscape3.7.2繪制網(wǎng)絡(luò)圖。

1.1.11 核心靶點(diǎn)的生存分析

為了探討核心靶點(diǎn)與生存之間是否存在顯著相關(guān)，使用TCGA-LIHC 的臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行KM 生存分析。在本研究中，根據(jù)核心靶點(diǎn)的表達(dá)量，我們截取了中位數(shù)劃分為高低兩組，對秩數(shù)檢驗水平＜0.05 被認(rèn)為具有顯著性意義。

1.2 預(yù)后模型及列線圖的構(gòu)建

1.2.1 單因素cox 分析和LASSO 回歸構(gòu)建柴胡疏肝散治療肝細(xì)胞癌靶點(diǎn)的預(yù)后模型

單因素cox 分析是研究單一變量與生存時間，生存狀態(tài)之間的關(guān)系，提供自變量與結(jié)局變量之間的危險比，用以評估自變量是否對結(jié)局變量存在保護(hù)或危險作用。在本研究中，單因素cox 分析用以篩選出柴胡疏肝散治療肝細(xì)胞癌顯著影響生存的靶點(diǎn)。然后進(jìn)一步的LASSO 回歸去除了冗雜因素，用柴胡疏肝散治療肝細(xì)胞癌的靶點(diǎn)構(gòu)建預(yù)后模型。KM 生存分析將模型的評分分為高低兩組，對秩數(shù)檢驗＜0.05 被認(rèn)為具有顯著性意義，并且使用ROC曲線評估了模型1，3，5 年的預(yù)測能力，ROC 曲線下面積 AUC＞0.6 被認(rèn)為具有良好的預(yù)測能力。

1.2.2 構(gòu)建列線圖用以評估患者的總體生存情況

為了評估患者的1，3，5年生存率，使用單因素cox分析篩選預(yù)后相關(guān)因素，單因素和多因素cox 分析具有顯著性水平的相關(guān)因素被認(rèn)為是獨(dú)立的預(yù)后危險因素，然后將獨(dú)立的預(yù)后危險因素用以構(gòu)建列線圖評估患者的總體生存情況。

1.2.3 藥物敏感性分析和分子對接

為了進(jìn)一步明確柴胡疏肝散治療肝細(xì)胞癌的化合物和靶點(diǎn)的可靠性，使用癌癥藥物敏感性的基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫（https://www.cancerrxgene.org/）對核心靶點(diǎn)進(jìn)行藥物敏感性分析，尋找與靶點(diǎn)密切相關(guān)的藥物。然后對柴胡疏肝散治療肝細(xì)胞癌的化合物，靶點(diǎn)密切相關(guān)的藥物進(jìn)行分子對接，以評估其之間的結(jié)合情況。在 Protein Data Bank（PDB）（https://www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫中下載共晶復(fù)合物。隨后，使用Schr?dinger 軟件包中的Protein and Ligand Preparation 模塊在基于OPLS-2005 的力場條件下對蛋白加氫、加電荷和質(zhì)子化處理，并進(jìn)行能量優(yōu)化。

1.3 核心基因的免疫組織化學(xué)驗證

使用人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫(human protein atlas,HPA)(（https://www.proteinatlas.org/）中的在線工具對肝臟中的正常組織與腫瘤組織之間的ESR1 蛋白質(zhì)表達(dá)水平進(jìn)行免疫組織化學(xué)驗證，比較在正常組織和肝癌組織中核心基因蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 核心靶點(diǎn)的篩選、驗證

2.1.1 TCGA肝癌差異表達(dá)基因的識別

通過差異表達(dá)分析，篩選出了肝癌差異表達(dá)基因2703 個。其中藍(lán)色代表下調(diào)，粉紅色代表上調(diào)；熱圖將正常組和腫瘤組進(jìn)行了劃分，并且展示了顯著性水平排名前50個差異基因（見補(bǔ)充圖1）。

2.1.2 TCGA肝癌加權(quán)共表達(dá)基因的鑒定

通過函數(shù)pickSoftThreshold 選擇軟閾值β=3 建立了無標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)，篩選出了8個加權(quán)基因模塊，可以看出紅色、藍(lán)色、綠松石色在正常組和腫瘤組之間顯著性水平排名前三，因此被用于后續(xù)的分析（見補(bǔ)充圖1）。

補(bǔ)充圖1 差異表達(dá)分析和WGCNA分析。

2.1.3 GEO-GSE14502 一致性聚類分析篩選出核心的模塊基因

通過一致性聚類分析，我們劃分了2個聚類模塊，從圖可以看出，GEO 模塊1 和模塊2 之間能夠被明確的區(qū)別開來，并且當(dāng)其模塊數(shù)目為2 時，內(nèi)部一致性（cluster consensus）大于0.8，這說明了劃分聚類內(nèi)部的可靠性（見補(bǔ)充圖2）。

補(bǔ)充圖2 一致性聚類分析

2.1.4 肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因的鑒定

通過R 語言4.0.1 的韋恩圖包，我們將上述的TCGA-LIHC 的差異表達(dá)基因，加權(quán)共表達(dá)基因，GEO_CLUSTER1 和 GEO_CLUSTER2 同 其 正 常 組 織 之間的差異表達(dá)基因進(jìn)行了取交集處理，共得到了890個肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因。

2.1.5 柴胡疏肝散化合物和靶點(diǎn)的鑒定

根據(jù)口服生物利用度（Oral B，OB）＞30%，類藥性（Drug L，DL）＞0.18 的標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出了160 個化合物，其中柴胡17個，白芍14個，川芎8個，枳殼5個，陳皮5個，甘草92個，香附19個；214個靶點(diǎn)（原1317個靶點(diǎn)，去重后得到214個），其中柴胡276個，白芍62個，川芎19 個，枳殼 52 個，陳皮 107 個，甘草 572 個，香附231個。

2.1.6 柴胡疏肝散治療肝細(xì)胞癌的靶點(diǎn)鑒定

通過R 語言4.0.1 的韋恩圖包，我們將上述的890個肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因和柴胡疏肝散的214個靶點(diǎn)取交集，共得到了柴胡疏肝散治療肝細(xì)胞癌的靶點(diǎn)38個。這些靶點(diǎn)將被用于后續(xù)的GO 和KEGG 功能富集分析，單因素cox 分析和LASSO 回歸構(gòu)建預(yù)后模型，以及PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)篩選核心靶點(diǎn)（圖1）。

圖1 肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因的鑒定（A）和柴胡疏肝散治療肝細(xì)胞癌的靶點(diǎn)鑒定（B）。

2.1.7 柴胡疏肝散治療肝細(xì)胞癌的GO 和KEGG 功能富集分析

通過在線的metascape數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO和KEGG 功能富集分析。條形圖結(jié)果顯示，GO 富集分析中，柴胡疏肝散治療肝細(xì)胞癌可能與對無機(jī)物的反應(yīng)、類固醇代謝過程和對細(xì)胞外刺激的反應(yīng)有關(guān)；KEGG 富集分析中，柴胡疏肝散治療肝細(xì)胞癌可能與FOXM1 信號通路有關(guān)。并且，我們構(gòu)建了GO 和KEGG 之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，以進(jìn)一步了解各個生物功能以及通路之間存在的相互作用關(guān)系（圖2A、圖2B）。

2.1.8 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)篩選核心靶點(diǎn)

通過在線的metascape 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，根據(jù)蛋白之間的相互作用和功能聚類。將38 個靶點(diǎn)進(jìn)行了劃分，此網(wǎng)絡(luò)包括了38 個點(diǎn)，163 條邊，共得到了2 個聚類模塊，分別為PPI 模塊1：GSTM1， CYP1A1， CYP1A2， CYP3A4， SULT1E1，AKR1C3；PPI 模塊2：ESR1，JUN，AR，F(xiàn)OS。這些靶點(diǎn)被認(rèn)為核心的靶點(diǎn)，將用于后續(xù)的分析（圖3）。

圖3 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)篩選核心靶點(diǎn)

2.1.9 疾病-藥物-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)篩選核心靶點(diǎn)

通過cytoscape3.7.2，我們納入了柴胡舒肝散對肝細(xì)胞癌有治療作用的化合物和靶點(diǎn)，構(gòu)建疾病-藥物-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。此網(wǎng)絡(luò)包括了133 個點(diǎn)，347 條邊?？梢钥闯觯琍TGS2，AR，CCNA2，CHEK1，ESR1，F(xiàn)7，ADRB2，MAOB，NR3C2，JUN 是與化合物相互作用數(shù)目最多的前10 個靶點(diǎn)，來自甘草，香附的MOL000098（槲皮素），來自白芍，柴胡，香附的MOL000422（山奈酚），來自柴胡，香附的MOL000354（異鼠李素）是與靶點(diǎn)相互作用數(shù)目最多的前3個化合物（圖4A）。

圖4 疾病-藥物-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)篩選核心靶點(diǎn)（4A）和柴胡疏肝散治療肝癌“病-癥-方/藥”網(wǎng)絡(luò)（4B）

2.1.10 柴胡疏肝散治療肝癌的“病-證-方/藥”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在SymMap 數(shù)據(jù)庫導(dǎo)入柴胡疏肝散治療肝癌的化合物或靶點(diǎn)，保留了疾病-藥物-化合物-中醫(yī)癥狀-現(xiàn)代醫(yī)學(xué)癥狀均有對應(yīng)關(guān)系的點(diǎn)，從而構(gòu)建肝郁氣滯型肝癌“病-證-方/藥”網(wǎng)絡(luò)（圖4B）?？梢钥闯?，柴胡疏肝散治療肝郁氣滯證肝癌的網(wǎng)絡(luò)，患者可能出現(xiàn)發(fā)熱、頭痛、嘔吐、口干、癥瘕、黃疸等既與少陽證候相關(guān)、又與肝癌相關(guān)的癥狀。

2.1.11 核心靶點(diǎn)的鑒定與生存分析

為了鑒定最終的核心靶點(diǎn)，通過R 語言4.0.1 的韋恩圖包，將疾病-藥物-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)篩選的10 個核心靶點(diǎn)和PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)篩選的10 個核心靶點(diǎn)進(jìn)行取交集處理，得到了最終的三個靶點(diǎn)，分別為：ESR1，JUN 和 AR。KM 生存分析顯示，ESR1 和 JUN 基因在生存分析中具有顯著性意義。ESR1 高表達(dá)的肝細(xì)胞癌患者生存率更高，JUN 基因高表達(dá)的肝細(xì)胞癌患者生存率更差，其差異具有顯著性意義，對秩數(shù)檢驗的P值分別為0.036和0.00069（圖5）。

圖5 核心靶點(diǎn)的鑒定與生存分析

2.2 預(yù)后模型及列線圖的構(gòu)建

2.2.1 單因素cox 分析和LASSO 回歸構(gòu)建柴胡疏肝散治療肝細(xì)胞癌的預(yù)后模型

通過對柴胡疏肝散治療肝細(xì)胞癌的靶點(diǎn)38 個進(jìn)行單因素cox 分析，結(jié)果顯示（圖6A），有18 個基因與生存顯著相關(guān)，并且這18個基因危險比都沒有跨越1，這說明了結(jié)果良好。進(jìn)一步使用了18 個基因進(jìn)行LASSO 回歸去除了冗雜因素，以7 個基因構(gòu)建了預(yù)后模型，其模型公式為：(0.1165)*CCNB1 + (-0.0396)*PON1 + (0.0888)*CHEK1 + (0.0521)*SPP1 + (0.0093)*NQO1 + (0.0102)*SERPINE1 + (0.0012)*IGFBP3。結(jié)果顯示，模型的低危險組中位生存期為6.9 個月，高危險組中位生存期為3.1 個月，其差異具有顯著性意義，P=6.71e-07（圖6）。預(yù)后模型的ROC曲線計算了AUC面積，分別為1年0.789，3年0.697，5年0.677,這說明了柴胡疏肝散治療肝細(xì)胞癌的靶點(diǎn)構(gòu)建的預(yù)后模型用以預(yù)測患者生存具有良好的效應(yīng)。

圖6 柴胡疏肝散治療肝細(xì)胞癌的預(yù)后模型構(gòu)建

2.2.2 構(gòu)建列線圖用以評估患者的總體生存情況

結(jié)合年齡，性別，TNM分期和ESR1，JUN基因的表達(dá)，使用了單因素cox 分析篩選出了預(yù)后相關(guān)因素，結(jié)果顯示ESR1，T，M分期是預(yù)后相關(guān)因素。進(jìn)一步的多因素cox 分析結(jié)果表明ESR1 和T 分期是獨(dú)立的預(yù)后危險因素，然后使用ESR1 和T 分期構(gòu)建了列線圖，用以評估患者的總體生存情況，其C-index 為：0.622（0.555-1），P＜0.001，表 明 了 具 有 良 好 的 預(yù) 測 能力（圖7）。

圖7 構(gòu)建列線圖用以評估患者的總體生存情況

2.2.3 藥物敏感性分析及分子對接

通過癌癥藥物敏感性的基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫，我們鑒定了與ESR1 密切相關(guān)的兩種藥物，分別為Tamoxifen（他莫昔芬）和Fulvestrant（氟維司群），其IC50 最低分別為 9.29 μL、12.9 μL，AUC 最高分別為 0.987、0.980。這說明了極低劑量的他莫昔芬和氟維司群能對ESR1起到很好的靶向作用，并且此兩者在體內(nèi)都能很好地進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)（圖8）。為了驗證活性小分子Isorhamnetin、Tamoxifen和Fulvestrant對蛋白（ESR1）的結(jié)合情況。在Protein Data Bank（PDB）數(shù)據(jù)庫中下載共晶復(fù)合物（ESR1 ID: 3ocb）。隨后，使用Schr?dinger軟件包中的Protein and Ligand Preparation 模塊在基于OPLS-2005 的力場條件下對蛋白加氫、加電荷和質(zhì)子化處理，并進(jìn)行能量優(yōu)化。從對接結(jié)果來看，Isorhamnetin、Tamoxifen 和 Fulvestrant 和蛋白 ESR1 的結(jié)合效果良好。ESR1 的結(jié)合能與他莫昔芬、氟維司群非常接近，這也提示了異鼠李素可能成為潛在的ESR1靶向藥物（圖9、表1）。

圖8 ESR1藥物敏感性的IC50及AUC

表1 ESR1 與 Isorhamnetin、Tamoxifen 和 Fulvestrant 的分子對接評分

圖9 ESR1與Isorhamnetin、Tamoxifen和Fulvestrant的分子對接

2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

通過HPA 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示，ERS1 表達(dá)水平在正常組織中高于腫瘤組織，在腫瘤組織中不能檢測得到（圖10）。這與我們的生存分析一致，進(jìn)一步說明ESR1 高表達(dá)在肝癌中是預(yù)后保護(hù)的因素。

圖10 正常肝臟組織與肝細(xì)胞癌組織中ERS1的蛋白質(zhì)表達(dá)水平

3 討論

肝癌是常見的消化道腫瘤之一，其發(fā)病率在我國惡性腫瘤中排名第4 位，死亡率位于惡性腫瘤的第2位[1]，對國民生命健康造成嚴(yán)重的威脅。目前肝癌的治療以手術(shù)切除為主，有研究報道其5 年復(fù)發(fā)率超過70%[26-27]，患者預(yù)后情況不佳。柴胡疏肝散源于《景岳全書》[28]，是臨床治療肝郁氣滯的主要方劑。柴胡疏肝散治療肝癌已被廣泛報道，但是其分子機(jī)制仍然需要進(jìn)一步研究。因此，本研究旨在揭示柴胡疏肝散治療肝癌在分子層面的機(jī)制以及構(gòu)建預(yù)后模型和列線圖，以期為臨床治療肝癌的進(jìn)展提供可靠依據(jù)。

本研究基于生物信息學(xué)分析方法，在TCGA 數(shù)據(jù)庫中篩選得到肝細(xì)胞癌的差異表達(dá)基因2703個，加權(quán)共表達(dá)基因9810 個，在GEO 數(shù)據(jù)庫中獲得GEO 模塊差異表達(dá)基因1 4404 個，GEO 模塊差異表達(dá)基因2 5320 個。將上述四個模塊取交集得到與肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)基因890 個。從TCMSP 數(shù)據(jù)庫得到柴胡疏肝散靶點(diǎn)的214 個，將柴胡疏肝散的靶點(diǎn)與肝細(xì)胞癌發(fā)生密切相關(guān)的基因進(jìn)行取交集處理，得到藥物-疾病共同靶點(diǎn)38個。

為了研究柴胡疏肝散治療肝癌靶點(diǎn)的作用機(jī)制，對篩選出的38 個藥物-疾病靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能富集和KEGG 通路富集分析。GO 功能富集結(jié)果顯示，柴胡疏肝散治療肝癌可能與對無機(jī)物的反應(yīng)、類固醇代謝過程及對細(xì)胞外刺激反應(yīng)等有關(guān)。KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，柴胡疏肝散治療肝癌可能與FOXM1 信號通路有關(guān)。研究表明，F(xiàn)OXM1信號通路通過調(diào)節(jié)細(xì)胞核基因表達(dá)，清除凋亡上皮細(xì)胞，與細(xì)胞的代謝過程有關(guān)[29]。胡國輝[30]研究發(fā)現(xiàn)FOXM1 信號通路通過激活下游KIF4A 啟動子，調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖。有研究[31]顯示，在FOXM1信號通路中，F(xiàn)OXM1 的上調(diào)可以激活 p38MAPK/NF-κB 通路，進(jìn)而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，可能與對細(xì)胞外刺激反應(yīng)有關(guān)。這提示了柴胡疏肝散可能通過作用FOXM1 通路，調(diào)節(jié)其異常表達(dá)從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

為了篩選得到與肝細(xì)胞癌密切相關(guān)的核心靶點(diǎn)，結(jié)合PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和疾病-藥物-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)所篩選核心靶點(diǎn)取交集，最終得到3個核心靶點(diǎn)，分別為：ESR1、JUN、AR。生存分析發(fā)現(xiàn)，JUN、ESR1 在高低風(fēng)險組中具有顯著差異性。其中，JUN 低表達(dá)與良好預(yù)后呈相關(guān)性，ESR1 的高表達(dá)與良好預(yù)后呈相關(guān)性。ESR1 是一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子受體，有研究表明[32]其通過抑制JAK、STAT 通路可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。臨床研究顯示[33]ESR1 通過調(diào)節(jié)下游靶基因在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)，影響肝癌細(xì)胞的遷移能力，ESR1對肝癌的進(jìn)展有重要臨床意義。JUN 是細(xì)胞核內(nèi)的重要轉(zhuǎn)錄因子，c-jun 的異常高表達(dá)已被證實與肝細(xì)胞癌的發(fā)生有關(guān)[34]。相關(guān)研究[35]發(fā)現(xiàn)c-jun 可以保護(hù)紫外線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，抑制TNF-α 誘導(dǎo)的凋亡，促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和免疫逃逸[36]。AR 是一種核蛋白受體，可以雄激素特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)基因表達(dá)水平，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖生長[37]。蔣廣宜[38]研究發(fā)現(xiàn)，AR 通過抑制PD-L1 表達(dá)而干擾T 細(xì)胞，使得肝癌細(xì)胞獲得免疫逃逸。

在SymMap 數(shù)據(jù)庫導(dǎo)入柴胡疏肝散治療肝癌的化合物或靶點(diǎn)，保留了疾病-藥物-化合物-中醫(yī)癥狀-現(xiàn)代醫(yī)學(xué)癥狀均有對應(yīng)關(guān)系的點(diǎn)，從而構(gòu)建肝郁氣滯型肝癌“病-證-方/藥”網(wǎng)絡(luò)。從柴胡疏肝散治療肝郁氣滯證肝癌的網(wǎng)絡(luò)可得，患者可能出現(xiàn)發(fā)熱、頭痛、嘔吐、口干、癥瘕、黃疸等既于少陽證候相關(guān)、又與肝癌相關(guān)的癥狀。

構(gòu)建柴胡疏肝散治療肝癌的靶點(diǎn)預(yù)后模型，對預(yù)測肝癌患者預(yù)后評估具有臨床意義。KM 生存分析結(jié)果顯示，高低風(fēng)險組間生存情況具有顯著差異，低風(fēng)險組與良好生存情況相關(guān)。隨著風(fēng)險評分的增加，患者的死亡人數(shù)不斷增加。此外，進(jìn)一步使用ROC 回歸曲線驗證了該模型的準(zhǔn)確性，其AUC 面積分別為1 年0.789，3年0.697，5年0.677，說明該模型預(yù)測肝癌患者預(yù)后具有良好效應(yīng)。因此，柴胡疏肝散治療肝細(xì)胞癌的靶點(diǎn)預(yù)后模型在預(yù)測患者預(yù)后中具有可靠性。

為進(jìn)一步獲取獨(dú)立的預(yù)后因子，對肝細(xì)胞癌生存相關(guān)靶點(diǎn)結(jié)合性別、年齡、TNM 分期進(jìn)行單因素及多因素cox分析。結(jié)合單因素cox和多因素cox分析結(jié)果可知，ESR1、T 分期是獨(dú)立的預(yù)后危險因素。進(jìn)一步構(gòu)建列線圖以估算ESR1、T 分期的表達(dá)水平與患者總體生存率的關(guān)系，結(jié)果顯示其c-index 為0.622（0.555-1），P＜0.001，說明該列線圖用以評估患者的總體生存情況具有中等程度的準(zhǔn)確性。

為了評估ESR1 和核心化合物、相關(guān)敏感性藥物的優(yōu)劣情況，使用了分子對接模擬核心其相互之間的結(jié)合穩(wěn)定情況[39]，分子對接評分為負(fù)值說明結(jié)合，正值說明不結(jié)合，負(fù)值越大說明結(jié)合效果越好。結(jié)果顯示，Isorhamnetin、Tamoxifen 和 Fulvestrant 和蛋白 ESR1的分子對接評分均為負(fù)值，結(jié)合效果良好，ESR1 的結(jié)合能與他莫昔芬、氟維司群非常接近，這也提示了異鼠李素可能成為潛在的ESR1 靶向藥物。異鼠李素是銀杏、沙棘等植物中提取的黃酮類化合物[40]，蔣晨春等[41]進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，異鼠李素可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，抑制其進(jìn)入細(xì)胞DNA 復(fù)制期，具有一定的抗肝癌作用。異鼠李素在阻滯肝癌細(xì)胞周期中，多種細(xì)胞周期蛋白表達(dá)下降，阻滯作用可能與細(xì)胞內(nèi)活性氧水平相關(guān)[42]。此外，有研究[43]證實，異鼠李素與抗胃癌藥物聯(lián)合使用，可以增強(qiáng)藥物療效。

為了檢驗ESR1 在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)情況，借助HPA 數(shù)據(jù)庫對肝臟組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果顯示，肝細(xì)胞癌組織中ERS1 蛋白質(zhì)表達(dá)水平低于正常肝細(xì)胞組織，進(jìn)一步說明了ESR1 高表達(dá)是預(yù)后的保護(hù)因素。

中藥復(fù)方治療肝癌作用機(jī)制復(fù)雜，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法可對其機(jī)制進(jìn)行分子層面的進(jìn)一步研究。謝小慧等[44]基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)健脾消積方中的槲皮素、木犀草素等是藥效成分的重要組成，發(fā)揮調(diào)控誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用。何燦封等[45]通過探討參桃軟肝丸治療肝癌的機(jī)制發(fā)現(xiàn)槲皮素、木犀草素及山奈酚可能是發(fā)揮作用機(jī)制的有效成分，通過利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法，尋找作用靶點(diǎn)與通路可推動肝癌發(fā)生機(jī)制認(rèn)識及新藥研發(fā)，體現(xiàn)了中藥復(fù)方治療肝癌多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)。

本研究結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對接和生物信息學(xué)分析方法，研究柴胡疏肝散治療肝癌的分子靶點(diǎn)以及構(gòu)建預(yù)后模型。根據(jù)研究得出結(jié)論：①異鼠李素可能是柴胡疏肝散治療肝細(xì)胞癌發(fā)揮作用的主要成分之一；②柴胡疏肝散治療肝細(xì)胞癌的靶點(diǎn)構(gòu)建的預(yù)后模型可用以用于患者預(yù)后的評估；③根據(jù)ESR1 的表達(dá)水平、T 分期構(gòu)建的列線圖可用于患者總體生存率的估算，效能良好。