基于系統(tǒng)藥理學(xué)分析野生真菌硬皮馬勃治療腫瘤多層次作用機(jī)制＊

李 敏，王宜磊，高 霞，周廣燦，唐 欣，張桂榮，崔 慧

（1. 菏澤學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院微生物重點(diǎn)實(shí)驗室 菏澤 274015；2. 山東省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心 濟(jì)南 250014）

腫瘤是指人體在各種致瘤因子的作用下局部組織細(xì)胞異常增生所形成的新生物。腫瘤已是嚴(yán)重威脅全球居民生命和健康的疾病之一，根據(jù)國際癌癥研究中心數(shù)據(jù)表明，2018 年全球新發(fā)惡性腫瘤病例約1800 萬，死亡 960 萬例，位居全球死因首位[1]，我國每年腫瘤新發(fā)病例約392.9 萬例，死亡233.8 萬例[2]，且惡性腫瘤發(fā)病率呈上升趨勢。常規(guī)的治療方法為手術(shù)、放療和化療等，放療、化療在殺死腫瘤細(xì)胞的同時對機(jī)體的消化系統(tǒng)和造血系統(tǒng)損傷嚴(yán)重，且具有顯著的毒性、耐藥性等不良反應(yīng)。與其相比，中藥具有對控制病情，提高生存質(zhì)量，降低放、化療不良反應(yīng)，降低腫瘤復(fù)發(fā)等發(fā)揮越來越重要的作用[3]。藥用真菌作為中藥的一種，含有多種抑制腫瘤生長的功能成分[4]，在治療腫瘤和疑難雜癥中具有獨(dú)特的優(yōu)勢和潛力。

藥用真菌在我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中具有悠久的使用歷史[5]，東漢《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有10 余種藥用真菌的記載[6]，但是對藥用真菌的分類、鑒定缺少模式標(biāo)本材料和方法單一[7]，且同一藥用真菌的形態(tài)特征在不同環(huán)境和生長階段也不相同，對其研究相對匱乏，導(dǎo)致認(rèn)知不充分，特別是民間藥用真菌的研究、整理甚是稀少，使其廣泛推廣應(yīng)用和深度開發(fā)受到嚴(yán)重限制。因而，開展當(dāng)?shù)孛耖g藥用資源大型真菌的鑒定、分類、藥效成分分析及其作用機(jī)理十分必要。本文對當(dāng)?shù)孛耖g應(yīng)用最普遍的野生藥用真菌進(jìn)行組織分離，獲得菌株M-1，通過形態(tài)學(xué)和核糖體rRNA 基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列進(jìn)行鑒定，該菌為硬皮馬勃（Scleroderma sinnamariense）。

硬皮馬勃（Scleroderma sinnamariense）屬于馬勃目，馬勃科，硬皮馬勃屬，該屬分布于世界各地，約60多種，我國較常見的有11種[8]，主要分布于山東、吉林、內(nèi)蒙古自治區(qū)等地。《名醫(yī)別錄》記載馬勃“味辛平無毒，主治惡瘡馬疥”[9]，惡瘡即為現(xiàn)代腫瘤[10-12]。最近研究表明，硬皮馬勃活性成分4,4-二甲氧基維甲酸及其衍生物顯著抑制NCI-H187 腫瘤細(xì)胞生長[13]，Zhang 在多根硬皮馬勃研究同樣發(fā)現(xiàn)甾醇類活性成分能抑制腫瘤壞死因子（TNF-α）和白細(xì)胞介素（IL-6）[14]，而且馬勃狀硬皮馬勃多糖提取物對腫瘤細(xì)胞HepG2 和人肺癌A549 細(xì)胞具有顯著的抑制作用[15]。但是硬皮馬勃活性成分和作用機(jī)制仍不清楚，藥用真菌藥效成分復(fù)雜，其作用位點(diǎn)較多且各成分間協(xié)同作用體系復(fù)雜，采用傳統(tǒng)的方法篩選藥物成分、解釋其作用機(jī)理難度極大。然而，中藥系統(tǒng)藥理學(xué)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP）借助于計算機(jī)技術(shù)在藥物靶點(diǎn)、疾病的發(fā)病、治療機(jī)制研究、精確調(diào)控細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)和提高藥物的療效等方面提供了新的策略[16]。因此，本文應(yīng)用系統(tǒng)藥理學(xué)理論和技術(shù)體系，文獻(xiàn)中硬皮馬勃化學(xué)成分，借助TCMSP 數(shù)據(jù)庫尋找硬皮馬勃有效的、新穎的、潛在的抗腫瘤成分，整合網(wǎng)絡(luò)分析、功能富集和通路等技術(shù)，探討其抑制腫瘤的潛在作用機(jī)制及其規(guī)律（圖1），為揭示有效成分的作用機(jī)制提供新思路，希冀為腫瘤藥物的開發(fā)提供新的視角和理論依據(jù)。

圖1 系統(tǒng)藥理學(xué)流程圖

1 材料與方法

1.1 供試材料

2018 年6 月，從山東省定陶區(qū)仿山草叢里采集一株野生藥用真菌子實(shí)體，置于一次性封口袋中，在微生物實(shí)驗室進(jìn)行分離、純化、鑒定和保藏，菌株編號為M-1。

1.2 試驗方法

1.2.1 M-1菌株純化和鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：先將采集的子實(shí)體用清水清洗干凈，然后用75%乙醇消毒，再用無菌水清洗掉乙醇，在無菌條件下將組織切成小塊接種于PDA 培養(yǎng)基上，置于26℃培養(yǎng)，獲得純化菌株M-1，分別置于4℃和-80℃保藏備用。無菌條件下挑起菌絲接種平板上，接種點(diǎn)2 cm 處插入無菌蓋玻片，待菌絲生長其上后取出置于光學(xué)顯微鏡下觀察菌株的形態(tài)特征。

分子鑒定：將分離純化的菌絲采用CTAB 法[17]提取菌株DNA，基于核糖體rRNA 基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列 ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3'）和 ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）對其 DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系為 50 μL，包括 DNA 模板 2.0 μL，2.5 μmol·L-1的前后引物各 2 μL，2×tag PCR Mix 25 μL，ddH2O 19 μL。PCR 擴(kuò)增程序為94℃ 5 min，35 個循環(huán)（94℃ 45 s，53℃ 45 s，72℃ 1 min），72℃ 10 min，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，剩余PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后送上海生物工程股份有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果用DNAMAN6.0 和Chromas Pro 軟件進(jìn)行堿基修正與拼接，利用在線數(shù)據(jù)庫NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）對拼接后的序列進(jìn)行同源序列比對，獲取相似序列。

1.2.2 馬勃活性成分庫的構(gòu)建及靶點(diǎn)預(yù)測

從文獻(xiàn)中獲取硬皮馬勃化學(xué)成分，利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索其化學(xué)成分，并進(jìn)行后續(xù)的系統(tǒng)分析。利用虛擬ADME 系統(tǒng)，計算硬皮馬勃化學(xué)成分藥用動力學(xué)參數(shù)，依據(jù)網(wǎng)站推薦閥值，以參數(shù)口服生物利用度（Oral Bioavailability OB）＞18% 和 類 藥 性（Drug Likeness DL）＞0.1 為潛在高活性成分進(jìn)行篩選，利用ChemBio獲得潛在高活性成分的結(jié)構(gòu)式。

在篩選到活性成分的基礎(chǔ)上，利用藥物靶向工具（SysDT）[18]和加權(quán)系綜相似度（WES）[19]系統(tǒng)預(yù)測獲得活性成分對應(yīng)作用靶點(diǎn)。首先利用SysDT即兩個數(shù)學(xué)工具，隨機(jī)森林（RF）和支持向量機(jī)（SVM））系統(tǒng)對潛在作用靶點(diǎn)打分，選擇參數(shù)SVM≥0.8 和RF≥0.7 的靶點(diǎn)作為有效作用靶點(diǎn)，利用WES模型挖掘藥物直接靶點(diǎn)，該模型在預(yù)測敏感性和特異性方面表現(xiàn)良好，準(zhǔn)確度達(dá)到78%。對篩選到的靶點(diǎn)進(jìn)行整理，利用Gene Cards Suite（https://www.genecard.org）對靶點(diǎn)名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，將標(biāo)準(zhǔn)化靶點(diǎn)映射到CTD（http://ctdbase.org/）數(shù)據(jù)庫，獲得與腫瘤相關(guān)靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)作為硬皮馬勃活性成分的藥理學(xué)靶點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)的探討。

1.2.3 活性成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（C-T）的構(gòu)建及分析

為明確硬皮馬勃潛在活性成分和靶點(diǎn)之間的關(guān)系，基于TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選出的活性成分和靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件，構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò)圖（C-T），并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)分析。在C-T 網(wǎng)絡(luò)圖中，節(jié)點(diǎn)表示硬皮馬勃活性成分和靶點(diǎn)，邊表示活性成分和靶點(diǎn)蛋白之間的相互作用。在C-T 網(wǎng)絡(luò)圖中，與節(jié)點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的邊的數(shù)量為“度值”，根據(jù)節(jié)點(diǎn)關(guān)聯(lián)的邊數(shù)的多少來評價節(jié)點(diǎn)的重要程度，邊數(shù)越多，該節(jié)點(diǎn)越重要，節(jié)點(diǎn)也越大，反之越小，遴選出關(guān)鍵活性成分和核心靶點(diǎn)。

1.2.4 靶點(diǎn)的生物功能和通路富集分析

為了揭示活性成分潛在的作用機(jī)制，利用在線分析平臺 DAVID（https://david.ncifcrf.gov）和 Metascape（https://metascape.org）對靶點(diǎn)進(jìn)行GO（Gene Ontology）生物功能和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析。設(shè)定閥值p-value ＜0.01，篩選排名靠前的通路，使用柱狀圖對富集結(jié)果進(jìn)行展示，利用在線分析平臺Metascape 構(gòu)建抗癌靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，揭示硬皮馬勃潛在活性成分在治療腫瘤中參與的生物學(xué)過程和涉及的通路。

1.2.5 靶點(diǎn)-通路（T-P）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及通路整合分析

為了探究活性成分作用靶點(diǎn)和通路之間的關(guān)系，利用富集分析獲得KEGG 通路，構(gòu)建靶點(diǎn)-通路（T-P）網(wǎng)絡(luò)圖，用Cytoscape3.8.0 軟件對T-P 進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化，并利用網(wǎng)絡(luò)分析模塊對網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)分析。在TP 網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點(diǎn)表示活性成分作用靶點(diǎn)和KEGG 通路，邊表示靶點(diǎn)和通路之間的隸屬關(guān)系。在T-P 網(wǎng)絡(luò)圖中，與節(jié)點(diǎn)關(guān)聯(lián)的邊的數(shù)量為“度值”，根據(jù)節(jié)點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的邊數(shù)多少來評價節(jié)點(diǎn)的重要程度，邊數(shù)越多，該節(jié)點(diǎn)越重要，節(jié)點(diǎn)也越大，反之越小，篩選出關(guān)鍵靶點(diǎn)和主要作用通路。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生真菌形狀和顯微鑒別

M-1 菌株子實(shí)體呈（圖2a）梨形、近球形，菌柄較短，子實(shí)體較硬，菌蓋有裂口，外表淺黃色，局部微褐色，內(nèi)部潔白。無菌條件下將子實(shí)體接種于PDA 培養(yǎng)基上，分離純化后的菌落干燥潔白，圓形，邊緣整齊，平板背面無菌絲分泌物呈現(xiàn)（圖2b）。菌絲粗壯，有橫隔，分支較多，頂端略圓（圖2c）。形態(tài)學(xué)鑒定在本校微生物教研室王宜磊教授的指導(dǎo)幫助下完成。

圖2 M-1菌株鑒別

采用CTAB 法提取菌株DNA，PCR 擴(kuò)增獲得長度530 bp ITS 序列片段，將擴(kuò)增片段回收、測序，測定序列為：CATTATCGAAGTCGAACGCTAGGAGGGAGAAGGGGAGCC CGTCGCTCCTCGGACCTCTCCGAAGCTTCAACCTTCTT CACACCCGTGTGCACCCGCTGTAGGTCCTTCGGGATCC TACGTCTTCGCTCTCGAACTCGCATGTCTACAGAATGTC CATGTCGTGTCGACCGGCGTCCGCGTCGGCGACCGCAA ACCTTTGTACAACTTTCAGCAATGGATCTCTTGGCTCTC GCATCGATGAAGGACGCAGCGAATCGCGATAAGTAATGT GAATTGCAGATTTTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACG CACCTTGCGCTCCTCGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGT TTGAGTGTCATCGAAATCTCGAACCGAAGCCTTCGATCC GTTCGAAGCTCGGTCTCGGAACGTGGGGGTCTGCGGGC GGCGACGTCGGCTCCCCTCAAACGCATCAGCTGTGGGC ACGAGCCCTGCGTGGCACGGCCTCCCCGACGTCGTAACGATCGTCGTGGGCTGGAAGCGCAGTGATCGGCGATCCC ATGCTTTCCAACCTTTTTCTCGAAGCT。 在 線 NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行核酸序列比對，該序列與硬皮馬勃對應(yīng)序列同源度100%，結(jié)合子實(shí)體、菌落和菌絲特征，初步認(rèn)為該菌株為硬皮馬勃（Scleroderma sinnamariense）。

2.2 硬皮馬勃活性成分庫的構(gòu)建及ADME 虛擬篩選

從文獻(xiàn)中獲得硬皮馬勃的化學(xué)成分59 個，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫查找到的化學(xué)成分37個，根據(jù)ADME系統(tǒng)虛擬篩選標(biāo)準(zhǔn)，以參數(shù)OB%＞18，DL＞0.1 進(jìn)行篩選，獲得活性成分7 個，分別為脂肪酸、甾體化合物、脂類和醇類，其藥用動力學(xué)和結(jié)構(gòu)相關(guān)信息在表1 中。其中，活性成分亞油酸（LA）[20]和棕櫚酸（PA）[21]已被報道具有抗腫瘤作用。

表1 硬皮馬勃活性成分及其藥用動力學(xué)參數(shù)

2.3 硬皮馬勃活性成分靶點(diǎn)預(yù)測及C-T 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過SysDT 和WES 系統(tǒng)獲得7 個活性成分（表1），其中TCMSP 數(shù)據(jù)庫里僅有5 個潛在活性成分的靶點(diǎn)，共獲得38 個無重復(fù)靶點(diǎn)，分別為：PTGS1、PTGS2、RXRA、NCOA2、IGHG1、GABRA1、PGR、CTSD、BCL2、IL10、TNF 等，平均每個潛在活性成分靶點(diǎn)為7.6 個。將38 個靶點(diǎn)映射到CTD 數(shù)據(jù)庫中，獲得靶點(diǎn)的功能，以Cancer 為關(guān)鍵詞篩選與腫瘤相關(guān)靶點(diǎn)16 個。將5個活性成分和腫瘤相關(guān)16 個靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件構(gòu)建硬皮馬勃活性成分和藥理學(xué)靶點(diǎn)（C-T）網(wǎng)絡(luò)圖（圖3），基于21 個節(jié)點(diǎn)（活性成分5 個和靶點(diǎn)16 個）和26條邊構(gòu)建C-T網(wǎng)絡(luò)圖。圖中紅色圓點(diǎn)表示靶點(diǎn)，綠色箭頭表示活性成分，邊表示潛在活性成分對靶點(diǎn)的作用。通過拓?fù)浞治霭l(fā)現(xiàn)，高度值的分子和靶點(diǎn)可能在腫瘤治療過程中發(fā)揮重要作用，硬皮馬勃活性成分LA和PA的度值較高，分別為7和11，這些活性成分可能在硬皮馬勃治療腫瘤中發(fā)揮重要作用。取前6個靶點(diǎn)為核心靶點(diǎn)，分別為 NCOA2、PTGS1、PTGS2、PGR、IGHG1和RXRA等靶點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)相對較高，表明這些靶點(diǎn)可能是活性成分作用的核心靶點(diǎn)。不同活性成分作用在同一個靶點(diǎn)，且同一活性成分作用不同靶點(diǎn)，推測這些活性成分可能存在多靶點(diǎn)、多途徑的協(xié)同作用。

圖3 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.4 馬勃靶點(diǎn)的生物功能和通路富集分析

為進(jìn)一步證實(shí)硬皮馬勃活性成分靶點(diǎn)與腫瘤相關(guān)性，應(yīng)用Metascape 工具和DAVID 數(shù)據(jù)庫對靶點(diǎn)進(jìn)行生物功能和通路富集分析（圖4）。為了更好的明確活性成分作用靶點(diǎn)過程和位置，對其生物功能分析，分別從生物學(xué)過程（biological process, BP）、分子功能（molecular function, MF）和 細(xì) 胞 組 分（cellular component, CC）3 個水平對 16 個靶點(diǎn)進(jìn)行 GO 富集分析，按照P＜0.01 的閾值過濾，共富集到65 條生物功能，選取富集顯著程度靠前的條目進(jìn)行繪制可視化圖形（圖4a）。富集度較高的生物學(xué)過程主要包括：糖皮質(zhì)激素分泌、一氧化碳合成正向調(diào)控、鐵離子對初始轉(zhuǎn)移的正向調(diào)控、藥物反應(yīng)、細(xì)胞對缺氧反應(yīng)、正調(diào)控序列特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、免疫反應(yīng)、發(fā)熱產(chǎn)生的積極調(diào)節(jié)、細(xì)胞因子分泌的負(fù)調(diào)控參與免疫反應(yīng)；分子功能包括：prostaglandin-endoperoxide 合酶活性、酶結(jié)合、過氧化物酶活性、相同的蛋白結(jié)合、細(xì)胞外配體門控離子通道活性、類固醇激素受體活性、PDZ結(jié)合功能域、特異性DNA結(jié)合、鋅離子結(jié)合等；細(xì)胞組分包括：突觸后膜、質(zhì)膜的外部、胞外區(qū)、胞器膜、細(xì)胞外空隙（圖4a）。KEGG 富集通路分析顯示（圖4b），硬皮馬勃活性成分參與的通路有小細(xì)胞肺癌信號通路（hsa05222），MAPK 信號通路（hsa04071），NF-kappa B信號通路（hsa04064）等多個信號通路，這些通路參與不同的腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，誘導(dǎo)或加速腫瘤細(xì)胞的凋亡，活性成分在通路上主要作用的靶點(diǎn)有IL10、PTGS1、PTGS2、TNF、RXRA 和BCL2 等，這些靶點(diǎn)參與免疫應(yīng)答，腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡等多種生物學(xué)過程。

圖4 GO和通路富集分析。

2.5 靶點(diǎn)-通路（T-P）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

為了進(jìn)一步揭示硬皮馬勃活性成分作用靶點(diǎn)和通路之間的關(guān)系，提取富集分析結(jié)果中KEGG 通路及通路相關(guān)靶點(diǎn)，利用Cytoscape3.8.0 軟件構(gòu)建T-P 網(wǎng)絡(luò)圖（圖5）。T-P 網(wǎng)絡(luò)圖含有25 個節(jié)點(diǎn)（9 個靶點(diǎn)和16條通路）和45 條邊。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D分析表明，網(wǎng)絡(luò)的某些通路與多個靶點(diǎn)相關(guān)聯(lián)，如小細(xì)胞肺癌通路（hsa05222）和Toll-like receptor（hsa05152）等通路分別與4 個靶點(diǎn)相關(guān)聯(lián)，該通路主要參與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增殖。MAPK通路（hsa04071）與4個靶點(diǎn)相關(guān)聯(lián)，主要參與免疫與腫瘤細(xì)胞增殖。NF-Kappa 通路（hsa04064）與3 個靶點(diǎn)相關(guān)聯(lián)，主要參與腫瘤細(xì)胞的凋亡。由此我們推斷硬皮馬勃活性成分整合多信號通路抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和增殖，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡等生物學(xué)功能。目標(biāo)靶點(diǎn)也與多個通路相關(guān)聯(lián)，如：TNF靶點(diǎn)與11 個通路相關(guān)聯(lián)，其次BCL2 靶點(diǎn)與8 個通路相關(guān)聯(lián)，IL10靶點(diǎn)與7個通路相關(guān)聯(lián)，說明這些靶點(diǎn)是硬皮馬勃活性成分主要作用的靶點(diǎn)。

圖5 T-P網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 馬勃活性成分治療通路的整合分析

為了深入理解硬皮馬勃治療腫瘤的整體機(jī)制，我們整合MAPK、Toll-like receptor、Jak-STAT、NF-Kappa和小肺癌細(xì)胞中的PI3K-AKT 等關(guān)鍵信號通路，構(gòu)建了硬皮馬勃治療腫瘤的主要通路圖（圖6），這些通路參與細(xì)胞免疫應(yīng)答，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡等生物學(xué)功能。

圖6 目標(biāo)靶蛋白在精簡癌細(xì)胞途徑上的分布

3 討論

根據(jù)國際癌癥研究中心數(shù)據(jù)表明，腫瘤發(fā)病率呈上升趨勢，已威脅全球居民生命和健康。常規(guī)治療方法容易造成機(jī)體損傷和明顯不良反應(yīng)，而中藥治療對機(jī)體安全性相對較高，特別是藥用真菌在一些疑難雜癥和慢性病的治療中顯示其突出優(yōu)勢。硬皮馬勃為當(dāng)?shù)孛耖g藥用大型真菌，在治療老年外陰濕疹及痔瘡手術(shù)后排便困難，阻止傷口止血、凍瘡流水等疾病方面具有較好的療效。為了更好了解、開發(fā)和利用此藥用真菌，對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)和核糖體rRNA 基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）方法鑒定，確定為硬皮馬勃（Scleroderma sinnamariense），屬于硬皮馬勃科的一種。

從已有文獻(xiàn)資料中獲知，硬皮馬勃化學(xué)成分59個，根據(jù)藥用動力學(xué)ADME 系統(tǒng)虛擬篩選獲得7 種活性成分，分別為脂肪酸（2種）、甾體化合物（3種）、脂類（1 種）和醇類（1 種）。由于硬皮馬勃活性成分作用機(jī)制的相關(guān)研究較少，目前僅發(fā)現(xiàn)5種活性成分的靶點(diǎn)，其中PA 和LA 作用靶點(diǎn)較多，可能是抑制腫瘤的主要成分。有關(guān)機(jī)制表明，PA通過調(diào)節(jié)膜流動性和糖代謝來抑制腫瘤細(xì)胞的生長[21]，也可通過抑制腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體[26]或下調(diào)靶點(diǎn)基因IL-10 的表達(dá)水平來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[27]。Lei研究發(fā)現(xiàn)PA 通過自噬激活和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)Saos-2肉瘤細(xì)胞凋亡[28]。而LA 主要通過調(diào)節(jié)雌激素受體（ERa）、G13a G 蛋白、p38 MAP kinase 基因表達(dá)，改善細(xì)胞微環(huán)境，間接參與腫瘤細(xì)胞的凋亡[29-30]。甾體化合物是真菌次生代謝產(chǎn)物，屬于天然抗氧化劑，具有抗炎、抑制腫瘤血管生成的作用[31]，它主要通過上調(diào)抑癌基因Foxo3 表達(dá)和激活凋亡蛋白Puma 和Bax，有效抑制腫瘤細(xì)胞的遷移、增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[32-33]。由此可見，這些成分在抑制腫瘤細(xì)胞生長、增殖、遷移，誘導(dǎo)其凋亡方面具有重要作用。

通過KEGG 通路分析獲得65 條相關(guān)信號通路，整合 PI3K-AKT、MAPK、Toll-like receptor、Jak-STAT、NF-Kappa 等關(guān)鍵信號通路及其通路上的靶點(diǎn)蛋白，能夠清晰展示通路、靶點(diǎn)蛋白之間的關(guān)聯(lián)，更好揭示硬皮馬勃活性成分治療腫瘤的機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，MAPK 、Toll-like receptor 和 NF-Kappa 信號通路參與了免疫應(yīng)答，除了NF-Kappa通路其余4條通路均參與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增殖，此外Toll-like receptor和Jak-STAT 信號通路還參與了腫瘤細(xì)胞的凋亡，表現(xiàn)出多通路，多層次的協(xié)同增效作用。

免疫是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，免疫系統(tǒng)對病原體的抑制，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和專業(yè)吞噬細(xì)胞積累到入侵部位[34]。硬皮馬勃活性成分可能通過MAPK、NFKappa 和Toll-like receptor 信號通路（圖6）上的關(guān)鍵靶點(diǎn) IL10、TNFα、BcL2/XL 和 COX2 參與細(xì)胞的免疫反應(yīng)。MAPK、NF-Kappa 和 Toll-like receptor 信號通路參與多種炎癥過程并能促進(jìn)炎癥的發(fā)生[35-36]，下調(diào)或抑制這些炎癥通路，可以控制炎癥反應(yīng)，提高免疫應(yīng)答[37]。活性成分作用靶點(diǎn)TNFα、BcL2 和 IL10 的通聯(lián)度較高（圖5），分別為11、8 和7，說明這些靶點(diǎn)可能是其關(guān)鍵靶點(diǎn)。我們推測，硬皮馬勃活性成分可能是通過抑制炎癥提高免疫達(dá)到抑制腫瘤增殖和遷移的目的。Hu 沉默 DPP4 基 因和 Zhen 敲除 COL12A1 基因 抑制MAPK 通路，從而抑制細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[38-39]，證明該推測正確，表明硬皮馬勃活性成分在炎癥反應(yīng)和抑制腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

硬皮馬勃活性成分可能通過PI3K-AKT、MAPK、Toll-like receptor、Jak-STAT信號通路抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和增殖，調(diào)控這些信號通路在腫瘤治療過程中可能具有較好的療效。硬皮馬勃活性成分可能通過調(diào)控基因表達(dá)或沉默基因，抑制通路[40-41]和趨化因子，間接參與抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和增殖[42]；也可能抑制AKT磷酸化[43]，導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的改變[44]，或直接作用于靶點(diǎn)蛋白IFNy，通過Jak-STAT 通路抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，此推測需要實(shí)驗進(jìn)一步證實(shí)。總之，不同通路在不同類型的腫瘤中可以被不同分子激活，從而呈現(xiàn)出不同表型。

通過整合通路發(fā)現(xiàn)，硬皮馬勃活性成分可能通過Toll-like receptor、Jak-STAT 信號通路，作用于靶點(diǎn)蛋白iNOS，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，這與Li 用姜黃素上調(diào)miR-99a基因抑制JAK/STAT通路，抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（Rb）增殖，并促進(jìn)凋亡[45]的研究結(jié)果一致。表明JAK/STAT 通路在很多癌癥中被激活，加強(qiáng)了癌細(xì)胞的擴(kuò)散[46-47]，由此可推導(dǎo)抑制該通路可以控制某些腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散。

本研究通過GO 功能和KEGG 通路富集分析，進(jìn)一步揭示硬皮馬勃活性成分作用的16個關(guān)鍵靶點(diǎn)，以及它們在基因功能和信號通路中的作用。TNF、IL10、BCL2 和PTGS2 等靶點(diǎn)在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器部位發(fā)生蛋白結(jié)合、調(diào)控關(guān)鍵基因表達(dá)、抑制趨化因子和磷酸化等分子反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)控PI3K-AKT、MAPK、Toll-like receptor、Jak-STAT 和 NF-Kappa 等 信 號 通路，抑制腫瘤細(xì)胞的生長和侵襲，誘導(dǎo)或促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，充分體現(xiàn)了硬皮馬勃活性成分具有多通路，多靶點(diǎn)、多層次的增效作用。

綜上所述，通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定當(dāng)?shù)孛耖g藥用野生大型真菌為硬皮馬勃（Scleroderma sinnamariense）?；谥兴幭到y(tǒng)藥理學(xué)、ADME、靶點(diǎn)預(yù)測、網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D分析和通路分析等方法，挖掘潛在的活性成分（PA、LA 等）5 種，這些活性成分主要通過Toll-like receptor、PI3K-AKT、MAPK 和 NF-kappa B 等通路作用于關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白（TNF、IL10、BCL2 等），參與免疫應(yīng)答，抑制腫瘤細(xì)胞生長、增殖，促進(jìn)其凋亡，為傳統(tǒng)藥用真菌研究提供方法，腫瘤新藥的開發(fā)和臨床應(yīng)用提供了理論支撐和新思路，但潛在活性物質(zhì)的分離及其在體外抑制腫瘤的效果還需要進(jìn)一步驗證。