黃芪甲苷干預的EPC-Exos對高糖誘導損傷間充質干細胞向內皮分化的影響＊

彭阿建，歐陽范馨，張 熙，譚梅鑫，梁文菲，朱晨鴻，劉錦清，張璐瑤，肖郁婷，熊 武

（1. 湖南中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院 長沙 410208；2. 湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 長沙 410007；3. 湖南省腦科醫(yī)院/湖南中醫(yī)藥大學臨床醫(yī)學院 長沙 410007）

間充質干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）作為一種具有多向分化潛能的“種子細胞”在組織修復、促血管新生及降低細胞因子風暴等方面均具有巨大醫(yī)療價值[1-2]。有研究報道生長因子刺激的人臍血間充質干細胞（hUCBMSCs）可通過其旁分泌外泌體發(fā)揮較強的血管新生作用，在治療糖尿病及其并發(fā)癥方面有廣泛的臨床應用前景[3]。外泌體是由細胞分泌的參與胞間通信、物質交換和血管再建的脂質膜性囊泡，所包含的mRNA、miRNA（MicroRNA，微小RNA）和各種功能蛋白及生長因子等是其發(fā)揮重要生物學功能不可或缺的成分[4-5]。 內皮祖細胞（Endothelial progenitor cells，EPCs）是一種主要來源于骨髓可分化為內皮細胞（Endothelial cells，ECs）的血管干細胞，因其在血管內皮損傷修復與血管新生方面發(fā)揮重要功能而成為近年來的研究熱點。內皮祖細胞外泌體（Endothelial progenitor cells derived exosomes，EPCExos）是EPCs 的重要旁分泌物質。最新研究表明，EPC-Exos 能增強ECs 的成管功能，在缺血性疾病血管的修復和再生中有較大潛能。有關研究顯示，EPCExos 可調控MSCs 生物學功能并充分發(fā)揮MSCs 作為干細胞的優(yōu)越性，參與誘導分化為創(chuàng)面修復所必需的成纖維細胞及血管內皮細胞，為外泌體修復糖尿病創(chuàng)面提供理論依據[6]。目前臨床上糖尿病血管新生困難，高糖受損ECs 的血管再生能力弱，而MSCs 具有良好的血管分化潛能，若能充分激活MSCs 定向分化為血管內皮的潛能，可彌補高糖受損ECs 成管功能低下的不足，對于攻克糖尿病血管新生困難的瓶頸有重要意義。

黃芪甲苷是中藥黃芪中最主要的活性成分，因其能誘導血管新生而廣受關注[7]。本團隊前期研究表明黃芪甲苷（Astragaloside Ⅳ，AS-Ⅳ）對人EPCs 分泌外泌體有明顯促進作用，AS-Ⅳ干預的EPC-Exos 負載大量 miR-126，且 miR-126 可能 調 控 下 游 PIK3R2/SPRED1 （Phospholipylinositol-3-kinase regulatory subunit，磷脂酰肌醇-3-激酶調節(jié)亞基-2；Sproutyrelated，EVH1 domain-containing protein-1，Sprouty 相關EVH1 結構域蛋白1）途徑發(fā)揮促進血管新生效應[8]。然而AS-Ⅳ干預的EPC-Exos是否能促進高糖受損的MSCs 向內皮分化，目前尚無相關研究。本文是在前期研究發(fā)現AS-Ⅳ干預的EPC-Exos 具有較強血管新生的活性基礎上，進一步研究其對高糖誘導損傷MSCs向ECs分化的影響。

1 材料

1.1 主要試劑與儀器

黃芪甲苷（S31401，純度≥98%）源葉生物；胎牛血清（10270-106），美國 GIBCO；Dil-Ac-LDLc（BT-902）美國Biomedical Technologies；DMEM/F12培養(yǎng)基，美國Hyclone（SH30023.01B）；CCK-8 試劑盒（C0037），上海碧云天生物技術研究所；成骨誘導分化培養(yǎng)基（HUXMA-90021），成脂誘導分化培養(yǎng)基（RASMD-90031），美 國 Cyagen；DAPI（4'，6-diamidino-2-phenylindole，4'，6- 二 脒 基 -2- 苯 基 吲 哚）染 液（D9542），油紅O 溶液（O1391-250ML），美國Sigma；成軟骨誘導分化培養(yǎng)基試劑盒（HUXUB-90042），美國OriCell；Matrigel 基質膠（354234），美國 BD BioCoat；FITC anti-human CD44 抗體（338803），PE anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) 抗體（344003），APC antihuman CD105 抗體（323207），美國 Biolegend；Anti-CD9 抗體（ab92726），Anti-CD63 抗體（ab134045），TSG101（ab125011），Anti-vWF 抗體（ab154193），Anti-CD31 抗體（ab28364），山羊抗小鼠IgG H&L（FITC，異硫氰酸熒光素）（ab6785），英國Abcam。

CO2培養(yǎng)箱（XD-101），日本SANYO；生物倒置顯微鏡（BX51），日本OLYMPUS；臺式低速離心機5804(R)，4℃離心機（5415R），德國Eppendorf Centrifuge；流式細胞儀（FACSCalibur），美國BD；酶聯免疫檢測儀（熱電MK3 酶標儀），超低溫冰箱（905），美國Thermo；共聚焦顯微鏡（LSM800），德國蔡司；超速離心機（Optima L-100XP），美國Beckman；透射電鏡（Tecnai Spirit T12）美國 FEI；Nanosight NS300 納米顆粒跟蹤分析儀，英國Malvern。

2 方法

2.1 EPCs及hUCBMSCs細胞分離、培養(yǎng)和鑒定

2.1.1 EPCs分離、培養(yǎng)及鑒定

本團隊前期已從人臍帶血中分離并提取人EPCs，細胞鑒定于前期研究[9]中已驗證。

2.1.2 hUCBMSCs分離、培養(yǎng)

無菌條件下取足月健康新生兒臍帶血10 mL（標本采集獲得產婦和家屬知情同意），用密度梯度離心得到單個核細胞，移入DMEM/F12 培養(yǎng)基（5%胎牛血清、1%雙抗）中，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后換液并清除漂浮細胞，換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至第7 天，細胞生長達90%融合時進行傳代培養(yǎng)，每隔2天換液1次。

2.1.3 hUCBMSCs的鑒定

將P3 代生長狀態(tài)良好的人臍血間充質干細胞置于200 倍光學顯微鏡下觀察。取P4 代人臍血間充質干細胞用胰酶消化，后轉至1.5 mL EP 管制成細胞懸液，1200 r·min-1離心 5 min。將 P4 代生長狀態(tài)良好的人臍血間充質干細胞依次進行成骨、成軟骨和成脂誘導分化鑒定，鑒定成功的P4 代hUCBMSCs 用于后續(xù)實驗。

2.2 細胞造模和分組

將鑒定成功的EPCs 按照隨機數字表法分為2 組，每組 3 孔，每孔 1×105個。一組加入 100 mg·L-1[10]黃芪甲苷培養(yǎng)24 h；另一組加入等量的PBS 培養(yǎng)24 h，分別提取并鑒定內皮祖細胞外泌體（EPC-Exos），用于后續(xù)實驗。將鑒定成功的hUCBMSCs 隨機分為3 等份，取其中2 份在葡萄糖濃度為 30 mmo1·L-1的 EGM 培養(yǎng)基中預培養(yǎng)120 h，隨機分為2組，實驗組和對照組；將另1份hUCBMSCs 用無糖的EGM 培養(yǎng)基預培養(yǎng)120 h，作為正常組。實驗組加入適量黃芪甲苷干預的EPCExos，對照組和正常組加入等量PBS 干預的EPCExos，隨后檢測hUCBMSCs 體外成管及內皮分化的能力。

2.3 EPC-Exos的分離與鑒定

采用經典超速離心法提取P3-P6 代EPCs 培養(yǎng)后分泌的外泌體。在37℃中速融樣本（樣本常溫寄送，融化狀態(tài)），將樣本移動至一個新的離心管內，2000×g，4℃，30 min 離心；將上清液移至新的離心管中，12,000×g，4℃，45 min再次離心，以去除較大的囊泡及雜蛋白；得到的上清液經0.45 μm 濾膜過濾；將過濾液移至新的離心管中，4℃，100,000 × g 超速離心70 min；去除上清，用PBS 重懸后，再次4℃，100,000 ×g 超速離心70 min；去除上清，用 PBS 重懸，取 5 μL 稀釋至 24 μL后分3 份20 μL 提取蛋白，采用蛋白質印跡法檢測外泌體特征性標志物 CD9、CD63 和 TSG101 的表達[11-12]。以上三者均陽性結果提示EPC-Exo 提取成功，用于后續(xù)實驗。

2.4 EPC-Exos的形態(tài)觀察

將直徑2 nm 的載樣銅網固定于支架上，分別滴加4 組 EPC-Exos 懸液 20 μL，室溫靜置 3 min；用濾紙吸取多余的液體，加入30 μL體積分數2%醋酸鈾酰溶液負染EPC-Exos 5 min；用濾紙吸干負染液，將銅網置于Tecnai Spirit T12透射電鏡的樣品室內，放大10萬倍觀察EPC-Exos的形態(tài)并拍攝照片。

2.5 EPC-Exos的粒徑分析

采用納米顆粒跟蹤分析（Nanoparticle tracking analysis，NTA）技術檢測 4 組 EPC-Exos 的粒徑。取 4組各20 μL EPC-Exos 懸液，用去離子水稀釋至1000μL，稀釋后的樣品裝入1 mL 注射器，放進納米顆粒跟蹤分析儀的裝載管，設置溫度25℃、黏度0.90 cP、折射率1.330、每秒幀數25 及測量時間60 s 等參數。待屏幕上的粒子圖像穩(wěn)定后追蹤并分析每個EPCExos 顆粒的無規(guī)則布朗運動軌跡；利用Stockes-Einstein方程式計算EPC-Exos粒徑。

2.6 EPC-Exos干預MSCs后對其內皮分化的影響

4 組 EPC-Exos 分別干預 MSCs 后，采用 Matrigel 體外成管實驗，檢測其對MSCs 成管的影響；采用免疫熒光檢測其對MSCs向內皮分化的影響。

2.6.1 Matrigel體外成管實驗

選用去除酚紅、低生長因子的Matrigel 基質膠4℃過夜溶解，槍頭盒、EP 管、96 孔板均4℃過夜預冷；翌日于冰盒上鋪膠，先用M200 培養(yǎng)基按1:1 稀釋Matrigel 基質膠，混勻后，50 μL/孔加入 96 孔板提前預冷），避免產生氣泡，37℃孵箱放置30-60 min，使基質膠凝固；選用P4代處于對數期的MSCs，隨機分為實驗組、對照組及正常組，待細胞貼壁后，消化后用含10%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基重懸，使細胞密度達到1×105，在固化的基質膠上每孔加入1 mL 重懸液，放入37℃，5% CO2孵箱孵育18 h 后，倒置顯微鏡下觀察并拍照，Image J 軟件測量MSCs成環(huán)數量、成管長度及節(jié)點數。

2.6.2 內皮分化指標CD31、vWF測定

在培養(yǎng)板中放置載玻片，玻片上滴加2 mL 含有1×106/mL MSCs 細胞懸液，加入 20 μL EPC-Exos 懸液，48 h 后取出載玻片；放入-20℃的冷丙酮中固定30 min，用PBS 沖洗3次，每次2 min；滴加3%H2O2室溫孵育 10 min，PBS 沖洗 3 次，每次 2 min，0.5% Triton X-100（PBS 配制）室溫通透20 min；PBS 浸洗3 次，每次3 min，吸干PBS，再滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min；吸掉封閉液，每孔分別滴加CD31 及vWF 一抗并放入濕盒，4℃孵育過夜；PBST 浸洗細胞3 次，每次3 min，吸取一抗，再滴加稀釋后的熒光二抗，濕盒中孵育1 h，PBST浸洗3次；滴加DAPI避光孵育5 min，對標本進行染核，洗去多余的DAPI；吸干液體，熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

2.7 統計學分析

采用SPSS 23.0 軟件進行統計。計量資料以平均值±標準差（）表示，實驗采用完全隨機設計，滿足正態(tài)性和方差齊性采用單因素方差分析，組間比較采用多重比較分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 hUCBMSCs的培養(yǎng)及誘導分化鑒定

光學顯微鏡下觀察P3 代細胞邊緣清晰，形態(tài)均一，排列整齊,呈典型的長梭狀結構，排列呈漩渦狀（圖1A）。P4代hUCBMSCs成骨分化鑒定可見細胞內紅色結節(jié)沉積，成軟骨分化鑒定可見細胞呈藍色改變，成脂分化鑒定可見細胞呈紅色改變，經鑒定細胞為正常間充質干細胞（圖1B-D）。

圖1 hUCBMSCs形態(tài)觀察與成骨、成軟骨及成脂分化鑒定結果

3.2 EPC-Exos的鑒定

分離及提純后黃芪甲苷干預的EPC-Exos 電鏡觀察下形態(tài)為包膜完整的圓形或橢圓形小囊泡結構，數量較多且分布集中（圖2A）；分離提純的樣本EPCExos 中，97.6% 的 EPC-Exos 粒徑在 81.4-142.1 nm（圖2B）；EPC-Exos 表面特異標志物 CD9、CD63、TSG101呈陽性（圖2C）；與對照組相比，實驗組CD9、CD63、TSG101表達均顯著增加，差異有統計學意義（圖2D）。

圖2 EPC-Exos的形態(tài)、粒徑及表面特異標志物表達情況

3.3 黃芪甲苷干預的EPC-Exos 誘導hUCBMSCs 體外成管能力

Matrigel 成管實驗顯示，實驗組、正常組和對照組體外形成管網狀結構的長度分別為373.12±49.38 mm、110.36±13.19 mm、70.57±12.23 mm，3 組成管實驗典型圖如圖3A-C。單因素方差分析結果表明3 組的體外形成管網狀結構的長度不相等或不全相等（F=88.07，P＜0.001）；多重比較結果提示：與對照組相比，實驗組形成的血管長度明顯高于對照組（P＜0.001）；與正常組相比，實驗組形成的血管長度明顯高于正常組，（P＜0.001）（圖3D）。

圖3 AS-Ⅳ對hUCBMSCs體外成管長度的影響

3.4 AS-Ⅳ干預的EPC-Exos 誘導 hUCBMSCs 向內皮分化情況

實驗組CD31 和vWF 熒光強度分別為（3.96±0.68）和（3.15±0.62），對照組 CD31、vWF 熒光強度分別為（1.01±0.19）和（1±0.32），正常組CD31、vWF 熒光強度分別為（1.27±0.15）和（1.41±0.17）。單因素方差分析結果表明3 組的CD31 和vWF 熒光強度不相等或不全相等（F1=42.63，F2=22.72，P均＜0.05）；與對照組相比，實驗組CD31 和vWF 蛋白免疫熒光強度顯著增高，差異有統計學意義（P＜0.01），與正常組相比，實驗組CD31 和vWF 免疫熒光強度亦顯著增高，差異有統計學意義（P＜0.01）（圖4～圖6）。

圖4 各組MSCs免疫熒光CD31表達情況

圖5 各組MSCs免疫熒光vWF表達情況

圖6 免疫熒光CD31、vWF熒光強度半定量分析圖

4 討論

內皮祖細胞外泌體（EPC-Exos）是由EPCs 旁分泌的一種直徑在40-150 nm 的微囊泡，其與EPCs 促進內皮細胞（ECs）增殖和血管新生功能密切相關。已有研究證實EPCs 在血管內皮損傷修復與血管新生方面扮演著重要的角色。間充質干細胞屬于干細胞的一種，具有低免疫原性及調節(jié)免疫功能特點，具有多向分化潛能和強大的自我更新能力[13]。此外，魏韓笑等[6]利用基因芯片高通量篩選技術篩選兔外周血EPCs-Exos中調控MSCs 的差異基因，結果表明EPC-Exos 主要通過調節(jié)細胞周期和MAPK（Mitogen activated protein kinase，絲裂原活化蛋白激酶）通路進而促進MSCs 增殖分化。這一研究結果表明EPC-Exos可以調控MSCs的生物學功能。Yue 等[14]研究證實IL-10 基因敲除小鼠EPC-Exos 中富含促進凋亡和炎癥、抑制血管新生的蛋白，且整合素連激酶基因敲除可逆轉這一現象。尹倩倩等[15]將EPC-Exos 注射到同時患有糖尿病和動脈粥樣硬化的小鼠體內，檢測到相關炎癥因子以及氧化應激指標下降。Hu 等[16]研究表明EPC-Exos 可通過負載高濃度的miRNA-21-5p 靶向抑制血小板凝血酶蛋白1以促進人臍血靜脈內皮細胞體外成管。本研究證實黃芪甲苷干預EPCs 后分泌的外泌體作用于MSCs，可促進MSCs 向ECs 分化，這一結論是基于本課題組前期研究[8]黃芪甲苷可改善人EPCs 分泌外泌體的功能，且分泌的外泌體負載miR-126 的基礎上進一步探索得出。這與Wu 等[17]研究顯示的EPC-Exos 中miR-126 通過下調SPRED1，可以部分增強RAF/ERK（Raf-1 proto-oncogene，serine/threonine kinase，Raf-1原癌基因，絲氨酸/蘇氨酸激酶；Extracellular signalregulated kinase，細胞外信號調節(jié)激酶）信號通路，從而促進ECs 增殖、遷移和血管生成相吻合。上述研究均提示EPC-Exos 具有促進血管內皮細胞增殖遷移、血管新生及減輕細胞炎癥從而促進創(chuàng)面愈合的功能，且EPC-Exos 改善ECs 的功能可能與其負載血管生成相關的蛋白質和miRNA有關。

黃芪甲苷（AS-Ⅳ）乃是黃芪主要的有效藥理成分，而黃芪素有“瘡家之圣藥之稱”?，F代研究表明，AS-Ⅳ的藥理作用主要在于其能促進血管新生、加速創(chuàng)面潰爛愈合，此外在抗炎，抗氧化及降血糖等方面也具有較強的藥理作用[18-20]。血管新生離不開誘導因素，其中與血管新生相關因子在激發(fā)EPCs 潛能、促進血管網新生和重構中發(fā)揮了重要作用。本團隊前期研究證明，離體的EPCs能在AS-Ⅳ的誘導下加強分泌與血管新生的相關因子（血管內皮生長因子、成纖維細胞生長因子和血管緊張素1）等[21]。此外，前期研究不僅證實AS-Ⅳ能改善體外人EPCs 的生物學功能，AS-Ⅳ干預后EPCs 的增殖能力、黏附細胞數、細胞遷移率及體外成管數較對照組均明顯增加[22]；還證實AS-Ⅳ對hUCBMSCs 無毒性，且能改善其細胞活力并提高其誘導分化為內皮細胞及成管的潛能[23]。目前，關于AS-Ⅳ促進MSCs向ECs分化的研究較少，研究大多停留在表型驗證階段，對于AS-Ⅳ如何促進MSCs向內皮分化的分子機制尚未涉及。本研究采用AS-Ⅳ干預EPCs，進一步證實AS-Ⅳ可促進EPCs 分泌EPCExos，且EPC-Exos 可有效改善高糖誘導損傷hUCBMSCs 向內皮細胞分化能力及成管潛能，但黃芪甲苷干預的EPC-Exos 中的具體活性成分通過何種關鍵信號通路介導MSCs 向內皮分化的深層機制還有待探究。AS-Ⅳ干預的EPC-Exos 對高糖誘導損傷MSCs體外成管的影響，是后續(xù)研究其具體機制的前提條件，也為后續(xù)開展黃芪甲苷促進干/祖細胞定向內皮分化的臨床應用奠定了前期基礎。

EPCs 是 ECs 的前體細胞[24]，其可定向分化為 ECs，EPCs 分泌的外泌體負載有大量有促血管新生的RNA[25]及蛋白質[26]等。本項目組推測AS-Ⅳ調控EPCs干預血管新生可能通過其干預EPC-Exos 負載調控血管生成的miRNA 及蛋白質被高糖受損MSCs攝取后促進MSCs 向內皮分化進而發(fā)揮血管新生的作用。因此，本團隊今后將重點探究AS-Ⅳ干預的EPC-Exos促進高糖受損hUCBMSCs 向內皮分化及血管新生的分子機制，為以中藥活性成分調控干/祖細胞分泌外泌體為基礎的細胞藥物治療提供新的理論依據，加速了中醫(yī)藥現代化進程，為中醫(yī)藥與細胞工程結合以及糖尿病創(chuàng)面療法革新等提供了理論基礎。