紫朱軟膏治療非缺血型糖尿病足潰瘍的臨床療效及對(duì)血清中Th1/Th2細(xì)胞的影響＊

黃仁燕，閆少慶，楊 曉，王麗翔，胡嘯明，柳國(guó)斌

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院 上海 201203）

糖尿病（Diabetes，DM）作為人類健康威脅最大的四大慢性疾病之一，后期常合并神經(jīng)、血管病變，涉及多個(gè)組織器官，尤其以足部病變多見[1]。糖尿病足致殘率高，糖尿病足潰瘍（Diabetic foot ulcer，DFU）是糖尿病患者截肢的主要原因[2-4]。糖尿病足潰瘍作為慢性難愈性潰瘍，其發(fā)病機(jī)制、愈合機(jī)制已成為研究的重難點(diǎn)。隨著相關(guān)研究的深入，2 型糖尿病也可能是一種自身免疫性疾病以及糖尿病足的發(fā)生可能與免疫相關(guān)的觀點(diǎn)逐漸興起。2 型糖尿?。═ype 2 Diabetes）患者長(zhǎng)期處于慢性炎癥狀態(tài)，改變了機(jī)體炎癥細(xì)胞水平。有研究指出與正常健康者相比，糖尿病患者血清中的輔助性T 細(xì)胞（helper T lymphocyte1，Th1）細(xì)胞比例以及Th1/Th2 比例呈升高現(xiàn)象，糖尿病潰瘍患者存在T 淋巴細(xì)胞免疫紊亂[5]。炎癥反應(yīng)期促炎因子與抑炎因子之間相互平衡從而參與免疫應(yīng)答。Th1、Th2作為兩個(gè)亞型分別是促炎因子和抑炎因子的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[6]。因此調(diào)節(jié)機(jī)體免疫紊亂是糾正糖尿病足潰瘍患者慢性炎癥狀態(tài)的關(guān)鍵因子。

糖尿病足潰瘍屬于中醫(yī)“脫疽”“筋疽”范疇，因虛感邪（濕、熱、毒）、邪氣致瘀為基本病因病機(jī)[7]。因此在治療上堅(jiān)持“扶正祛邪”并用。針對(duì)糖尿病足潰瘍目前治療主要以綜合治療為主，在內(nèi)科治療的基礎(chǔ)上結(jié)合局部治療，局部更加注重外治[8]。紫朱軟膏是我院我科通過(guò)長(zhǎng)期臨床實(shí)踐總結(jié)的治療糖尿病潰瘍的外用藥，主要藥物包括紫草、朱砂、黃芪、血竭、阿膠、冰片，其中朱砂、紫草為君藥，全方具有祛腐生肌、補(bǔ)氣益血、清熱解毒之功，秉承了扶正、祛邪并用的治療思想[9]。在前期作用機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)紫朱軟膏在糖尿病足潰瘍治療中能有效抑制炎癥因子表達(dá)[10]。Th1、Th2 作為炎癥反應(yīng)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，因此我們推測(cè)紫朱軟膏治療糖尿病足潰瘍可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞從而抑制炎癥因子表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。因此預(yù)通過(guò)本研究觀察紫朱軟膏是否通過(guò)Th1/Th2 細(xì)胞發(fā)揮促進(jìn)潰瘍愈合的作用。

1 臨床資料

1.1 納入標(biāo)準(zhǔn)

符合糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)（2017 年版）[11]；《糖尿病足筋疽單病種質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)》《現(xiàn)代糖尿病診斷治療學(xué)》中非缺血型糖尿病足診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]；符合糖尿病足Wagner 分期 2-4 級(jí)[13]；年齡 40-80 歲；簽署知情同意書者。

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn)

年齡小于40 歲或大于80 歲者；缺血型糖尿病足潰瘍者；資料不全者；嚴(yán)重心肝腎功能不全者；惡性腫瘤者；患自身免疫性疾病者；其他原因引起的神經(jīng)、血管病變者；3 個(gè)月內(nèi)有糖尿病酮癥、酮癥酸中毒以及重度感染者；外科或介入血管形成術(shù)治療者；入選前4周曾參加其他臨床試驗(yàn)者；對(duì)治療方案中相關(guān)藥物過(guò)敏，不適合接受本治療方案者。

1.3 脫落、中止標(biāo)準(zhǔn)

不符合納入標(biāo)準(zhǔn)而被納入者；納入研究后未接受任何治療者；治療過(guò)程中發(fā)展為缺血型糖尿病足，需要介入治療者；發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)，不宜繼續(xù)進(jìn)行治療者；因自身其它原因提出退出研究者；失訪者。凡符合上述任意1項(xiàng)者，均列為脫落病例。

1.4 一般資料

收集 2019 年 12 月至 2020 年 12 月就診于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院周圍血管病科的非缺血型糖尿病足潰瘍患者104 例，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為試驗(yàn)組和對(duì)照組各52 例。兩組一般資料比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），具有可比性（表1）。

表1 兩組一般資料比較

2 方法

2.1 干預(yù)措施

兩組患者均嚴(yán)格按照《中國(guó)2型糖尿病防治指南》給予基礎(chǔ)治療[14]：健康宣教、降糖、降壓、控制血脂糾正低蛋白血癥、電解質(zhì)紊亂、控制感染。試驗(yàn)組局部潰瘍外用雙氧水、0.9%氯化鈉溶液沖洗后，采用紫朱軟膏紗條填充。對(duì)照組局部潰瘍采用常規(guī)外治方案，外用雙氧水、0.9%氯化鈉溶液沖洗后，外用藻酸鈣敷料（商品名：德濕康，保赫曼（上海）貿(mào)易有限公司，10 cm×10 cm）。兩組患者均每日換藥1 次，連續(xù)治療8周。

2.2 觀察指標(biāo)與方法

2.2.1 臨床療效觀察

治療8 周后，對(duì)比兩組患者足部潰瘍面積較治療前變化情況，根據(jù)《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則（試行）》[15]評(píng)估兩組臨床療效。治愈：臨床癥狀消失，創(chuàng)面完全愈合；顯效：臨床癥狀明顯好轉(zhuǎn)，創(chuàng)面2/3 以上愈合；有效：臨床癥狀好轉(zhuǎn)，創(chuàng)面1/2 以上愈合；無(wú)效：達(dá)不到有效標(biāo)準(zhǔn)者。

2.2.2 血清中Th1/Th2相關(guān)細(xì)胞因子水平比較

于治療前及治療8周后，采集患者空腹血，記錄兩組患者血清細(xì)胞因子水平（Th1相關(guān)細(xì)胞因子：腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、干擾素-γ（Interferon-γ，IFN- γ）；Th2 相 關(guān) 細(xì) 胞 因 子 ：白 細(xì) 胞 介 素 -4（interleukin-4，IL-4）、白細(xì)胞介素-5（interleukin-5，IL-5）、白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10），并比較兩組之間的差異及治療前后差異。所有血液檢測(cè)由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院檢驗(yàn)科進(jìn)行。

2.2.3 肝腎功能水平比較

于治療前及治療8周后，采集患者空腹血，記錄兩組患者天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate amino transferase, AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase, ALT）、血清肌酐（serum creatinine,Scr）、尿素氮（Blood Urea Nitrogen, BUN）水平，并比較兩組之間的差異及治療前后差異。所有血液檢測(cè)由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院檢驗(yàn)科進(jìn)行。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析處理。計(jì)量資料符合正態(tài)性、方差齊性時(shí)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）描述，不符合以上條件時(shí)，采用中位數(shù)及四分位間距M（Q1，Q3）描述；計(jì)數(shù)資料及等級(jí)資料采用頻數(shù)或百分率描述。組間比較，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)；等級(jí)資料采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)；計(jì)量資料符合正態(tài)性、方差齊性時(shí)，采用T 檢驗(yàn)；不符合以上條件，采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。組內(nèi)比較，計(jì)量資料符合正態(tài)性、方差齊性時(shí)，采用配對(duì)樣本T 檢驗(yàn)；不符合以上條件，采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。P＜0.05 表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.01 表示有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 結(jié)果

3.1 臨床療效比較

試驗(yàn)組治愈率30.77%（16/52）、顯效率61.54%（32/52）、有效率7.69%（4/52）；對(duì)照組治愈率25.0%（13/52）、顯效率42.31%（22/52）、有效率32.69%（17/52）。兩組臨床療效比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，試驗(yàn)組優(yōu)于對(duì)照組（Z=-2.183，P＜0.05）（表2）。

表2 兩組臨床療效比較（n，%）

3.2 兩組血清中Th1/Th2相關(guān)細(xì)胞因子水平比較

治療前，兩組TNF-α、IL-2、INF-γ 水平均處于非正常值范圍，組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)。治療8周后，試驗(yàn)組TNF-α 平均水平為5.20（4.20，6.70），對(duì)照組TNF-α 平均水平為7.30（6.50，7.90），兩組組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Z=-5.622，P＜0.05）；試驗(yàn)組 IL-2 平均水平為6.30（4.75，6.88），對(duì)照組 IL-2 平均水平為 6.50（5.40，7.50），兩組組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Z=-2.434，P＜0.05）；試驗(yàn)組IL-4 平均水平為6.40（5.53，7.30），對(duì)照組IL-4 平均水平為5.75（4.53，6.75），兩組組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Z=-2.449，P＜0.05）；試驗(yàn)組IL-10平均水平為 8.50（7.33，9.45），對(duì)照組 IL-10 平均水平為7.40（6.40，8.48），兩組組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Z=-3.024，P＜0.05）（表3）。

表3 兩組患者Th1/Th2細(xì)胞水平比較（M（Q1，Q3），%）（pg·mL-1）

血清中細(xì)胞因子治療前后差值結(jié)果顯示兩組患者血清中TNF-α、IL-2、INF-γ水平呈下降趨勢(shì)，IL-4、IL-5、IL-10 水平呈上升趨勢(shì)。組間比較，試驗(yàn)組患者血清 TNF-α 治療前后平均差值為-4.25（-6.55，-2.55），對(duì)照組患者血清TNF-α 治療前后平均差值為-1.65（-3.05，-1.30），試驗(yàn)組小于對(duì)照組，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Z=-5.271，P＜0.01）；試驗(yàn)組患者血清IL-2 治療前后平均差值為-3.0（-5.53，-2.10），對(duì)照組患者血清IL-2 治療前后平均差值為-2.05（-4.58，-1.0），試驗(yàn)組小于對(duì)照組，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Z=-2.104，P＜0.01）（表4）。

表4 兩組血清中Th1/Th2相關(guān)細(xì)胞水平治療前后差值（M（Q1，Q3），%）（pg·mL-1）

3.3 兩組肝腎功能比較

治療前，兩組患者肝腎功能（AST、ALT）比較，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05）。治療8 周后，組內(nèi)比較，兩組患者肝腎功能（AST、ALT）指標(biāo)較治療前均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05）；組間比較，兩組患者肝功能（AST、ALT）指標(biāo)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05）（表5）。

表5 兩組肝腎功能比較（M（Q1，Q3），U·L-1）

4 討論

初始CD4+T 細(xì)胞分化成為Th 細(xì)胞[16]。在多種因素誘導(dǎo)下Th0 選擇性向Th1 或Th2 細(xì)胞偏移、分化。Th1 細(xì)胞能合成干擾素（interferon，IFN）-γ、腫瘤壞死因 子（tumor necrosis factor，TNF）-α 以 及 白 介 素（interleukin，IL）-2 等，在防御胞內(nèi)病原體時(shí)發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[17]。IFN-γ 等可募集活化炎性細(xì)胞，因此Th1 細(xì)胞與炎癥反應(yīng)、組織損傷密切相關(guān)。Th2 能合成 IL-4、IL-5、IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor，TGF）-β 等，其中IL-4可以抑制IFN-γ對(duì)巨噬細(xì)胞的活化作用，IL-10 可直接抑制巨噬細(xì)胞功能，因此Th2 細(xì)胞主要發(fā)揮抗炎作用[18]。正常情況下，炎癥反應(yīng)早期以Th1 反應(yīng)為主，后會(huì)出現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的Th2反應(yīng)，以阻止Th1反應(yīng)介導(dǎo)的損傷[19]。因此當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)Th1/Th2 免疫失衡時(shí)，可能會(huì)引起炎癥反應(yīng)紊亂。目前糖尿病足潰瘍難愈合的具體機(jī)制尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)糖尿病潰瘍?cè)谟线^(guò)程中存在炎癥反應(yīng)延遲以及失調(diào)[20]。

糖尿病足潰瘍屬于中醫(yī)“脫疽”“筋疽”范疇，治療上堅(jiān)持“扶正祛邪”并用。針對(duì)糖尿病足潰瘍目前治療主要以綜合治療為主，在內(nèi)科治療的基礎(chǔ)上結(jié)合局部治療，局部更加注重外治[21，22]。紫朱軟膏是由朱砂、紫草、黃芪、血竭、阿膠、冰片六味中藥加上輔料制備成的外用油膏制劑。六藥合用具有祛腐生肌、補(bǔ)氣益血、清熱解毒之功。其中朱砂又名丹砂、辰砂，是一種天然礦物藥，主要成分為硫化汞。其味甘、性微寒，具有清熱解毒之效，臨床上朱砂常與冰片合用治療癰疽瘡瘍[23]。紫草味甘咸、性寒，具有清熱涼血、活血解毒之功，常與血竭配伍治療瘡瘍久潰不斂及濕疹[23]。紫草在《本經(jīng)》記載其有：“利九竅，通水道?！敝?，同時(shí)又有“補(bǔ)益中氣”之功?！度数S直指方》謂其可治癰疽。血竭味甘咸、性平，具有活血散瘀、定痛止血、斂瘡生肌功效，外用可治瘡瘍久潰難斂之癥[23]。血竭《唐本草》記載有：“止痛，破積，金創(chuàng)生肉?！薄逗Ｋ幈静荨分^其可治一切內(nèi)傷及疼痛。黃芪味甘、性溫。在《本草綱目》中記載：“黃芪甘溫純陽(yáng)，其用有五：補(bǔ)諸虛不足，一也；益元?dú)?，二也；壯脾胃，三也；去肌熱，四也；排膿止痛，活血生血，?nèi)托陰疽，為瘡家圣藥，五也?！秉S芪具有補(bǔ)氣托毒排膿生肌之功，可用于瘡瘍治療[23]。阿膠味甘、性平，具有補(bǔ)益氣血之效，常以內(nèi)服為主。阿膠據(jù)《綱目》記載治“一切癰疽腫毒”，有“和血滋陰”之功效。冰片又名龍腦、梅片、結(jié)片，味苦、性寒，具有清熱解毒、生肌斂瘡之功，常與血竭同用治療瘡瘍潰后日久不斂[23]。綜上，紫朱軟膏全方具有清熱解毒、祛腐生肌、補(bǔ)益氣血的功效，符合糖尿病足潰瘍扶正祛邪的治療理念。從臨床藥理學(xué)研究來(lái)看，紫草中有效成分紫草多糖可抑制炎性因子TNF-α 轉(zhuǎn)錄[24]。黃芪中黃芪多糖可調(diào)控Th1/Th2 平衡，改善機(jī)體免疫水平[25]。血竭中血竭總黃酮能顯著提高小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力[26]。阿膠對(duì)Th1/Th2 細(xì)胞因子平衡具有調(diào)節(jié)作用[27]。冰片具有抗炎作用，其可能與調(diào)控Th1/Th2 細(xì)胞免疫減少炎癥介質(zhì)堆積相關(guān)[28]。另外在前期的臨床研究中發(fā)現(xiàn)紫朱軟膏聯(lián)合中醫(yī)外治技術(shù)治療Wagner2-4 級(jí)糖尿病足潰瘍有效率達(dá)88.89%，除了能促進(jìn)局部潰瘍愈合外，還能有效減少局部潰瘍膿液量，改善局部肉芽顏色、降低潰瘍周圍皮溫以及減輕患者疼痛感[29]，但其作用機(jī)制尚不明確。另外紫朱軟膏可貫穿于糖尿病足潰瘍整個(gè)治療過(guò)程中。如糖尿病足潰瘍?cè)缙谠谥委熒弦造钚盀橹鳎现燔浉嗑哂星鍩峤舛局?，用于早期治療能有效控制?chuàng)面濕熱毒邪；糖尿病足潰瘍中期治療上以生肌為主，紫朱軟膏具有祛腐生肌作用，用于中期治療能使創(chuàng)面腐肉組織去除的同時(shí)促進(jìn)新鮮肉芽生長(zhǎng)，有效縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間；糖尿病足潰瘍后期治療上以生肌長(zhǎng)皮為主，紫朱軟膏具有補(bǔ)益氣血功效，在后期治療中應(yīng)用，為創(chuàng)面提供營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)上皮化。

本項(xiàng)研究結(jié)果表明紫朱軟膏相對(duì)于藻酸鈣敷料而言，在非缺血型糖尿病足潰瘍的治療上臨床療效更為顯著。治療前兩組患者血清中細(xì)胞因子水平在TNF-α、IL-2、INF-γ 處于非正常值范圍，呈升高表現(xiàn)。TNF-α、IL-2、INF-γ 均為多效性細(xì)胞因子，廣泛參與機(jī)體免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)中，它們?cè)谔悄虿∽銤冎刑幱诟弑磉_(dá)狀態(tài)，表明糖尿病足潰瘍患者處于炎性反應(yīng)狀態(tài)，這符合糖尿病足潰瘍存在炎癥反應(yīng)失調(diào)、延遲的觀點(diǎn)。TNF-α、IL-2、INF-γ 主要由Th1 細(xì)胞所分泌，均為促炎細(xì)胞因子。因此提示在糖尿病足潰瘍?cè)缙诳赡艽嬖谘装Y反應(yīng)失調(diào)。從治療后兩組患者細(xì)胞因子檢測(cè)水平來(lái)看，兩組所有觀察指標(biāo)均處于正常值范圍內(nèi)。治療后細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果顯示兩組在TNF-α、IL-2、INF-γ 較治療前明顯降低，在IL-4、IL-5 上均較治療前明顯上調(diào)，對(duì)照組在IL-10 上治療前后無(wú)明顯差異。組間比較結(jié)果顯示試驗(yàn)組與對(duì)照組在TNF-α、IL-2、IL-4、IL-10 中存在表達(dá)差異，試驗(yàn)組的TNF-α、IL-2 表達(dá)水平低于對(duì)照組，而試驗(yàn)組的IL-4、IL-10表達(dá)水平上高于對(duì)照組。細(xì)胞因子治療前后差值結(jié)果顯示試驗(yàn)組在TNF-α、IL-2 治療前后差值上與對(duì)照組有明顯差異，紫朱軟膏下調(diào)TNF-α、IL-2 表達(dá)更為明顯。TNF-α、IL-2 主要由 Th1 細(xì)胞所分泌，而 IL-4、IL-10 主要由Th2 細(xì)胞所分泌。研究表明一方面紫朱軟膏在糖尿病足潰瘍治療中能降低炎癥反應(yīng)，另一方面說(shuō)明紫朱軟膏可下調(diào)Th1、上調(diào)Th2 表達(dá)作用，間接表明紫朱軟膏對(duì)Th1/Th2 細(xì)胞分化具有調(diào)節(jié)作用。因此，推測(cè)紫朱軟膏治療糖尿病足潰瘍的作用機(jī)制可能在于通過(guò)抑制Th1 細(xì)胞分化偏倚，降低機(jī)體炎癥反應(yīng)水平，改善糖尿病足潰瘍慢性炎癥狀態(tài)，促進(jìn)潰瘍愈合。這也間接說(shuō)明紫朱軟膏具有扶正（調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，改善免疫紊亂）、祛邪（降低炎癥反應(yīng)水平）的作用。

Th1/Th2 細(xì)胞分化在炎癥反應(yīng)中具有重要的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，但在糖尿病潰瘍愈合過(guò)程中的機(jī)制尚未闡明。本研究從Th1/Th2 細(xì)胞分化角度出發(fā)研究中藥紫朱軟膏的作用機(jī)制，為中醫(yī)藥以及“扶正祛邪”中醫(yī)理論治療糖尿病潰瘍提供科學(xué)依據(jù)。通過(guò)本次研究發(fā)現(xiàn)紫朱軟膏治療非缺血型糖尿病足潰瘍有效，且對(duì)患者血清中Th1/Th2 細(xì)胞具有調(diào)節(jié)作用，從而降低炎癥反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)促進(jìn)糖尿病足潰瘍愈合的目的，為中醫(yī)“扶正祛邪”理論提供了一定的客觀依據(jù)。